环介导等温扩增快速检测病原菌新型试剂盒研制可行性研究报告李思光南昌大学一、选题的必要性1、工程所处技术领域产业政策本工程属生物高技术领域，是国家重点支持的研究领域，工程主要针对严重影响人类健康的主要病原菌的检测与诊断需要进行检测技术的研究与试剂盒的开发，本工程的实施可产生具有自主知识产权的科研成果。本工程技术含量高，市场竞争力强，工程完成后能够产生较好的经济效益和社会效益，工程符合国家产业、技术政策。2、工程所处技术领域技术发展现状目前的病原菌检测方法费时、费力、准确性低，开发快速、准确、低成本的检测技术和配套试剂是病原菌检测工作中亟待攻克的难题。本工程针对病原菌检测中存在的问题，采用高灵敏度、高特异性的环介导等温扩增技术开发出简便、快速、经济的检测试剂。3、工程技术先进性，对相关领域技术进步的推动作用环介导等温扩增是利用4 个特殊设计的引物和具有链置换活性的 DNA聚合酶，在恒温条件下特异、高效、快速地扩增DNA的新技精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 1 页，共 12 页术。该技术在1h 内能扩增出 109靶序列拷贝。 LAMP 技术以其特异性强、灵敏度高、快速、准确和操作简便等优点在核酸的科学研究、疾病的诊断和转基因食品检测等领域得到了日益广泛的应用。该技术的推广对生物学、食品科学及医学领域中的检测和诊断技术的进步有推动作用。4、工程目前进展情况课题组开展了大量前期研究工作，已完成了本工程所需的科研平台建设任务，开展了嗜水单胞菌和金黄色葡萄球菌的环介导等温扩增研究，取得了阶段性研究成果，这些工作为本工程的顺利完成奠定了基础。二、技术方案论述（一）工程技术关键点和创新点，工程完成时达到的技术水平1、技术关键（1）本工程的技术关键之一是引物设计。与常规PCR引物不同，环介导等温扩增引物设计难度大，一组引物要求有6 个位点与靶序列完全匹配才能够进行扩增。目前我们已从国际基因组数据库中下载了部分病原菌的基因组DNA ，并根据基因组特点采用等温扩增软件设计了部分引物，现正通过实验确定这些引物的性能。（2）本工程的另一技术关键是最佳等温扩增体系优化。通过对引物浓度、内引物和外引物的最佳浓度比、模板浓度、dNTP 浓度、BstDNA 聚合酶用量、 Mg2+浓度等条件进行优化，能够获得最佳精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 2 页，共 12 页实验条件。2、创新点（1）既往对病原菌的检测一般采用细菌分离培养鉴定法，但该方法的准确率低，所需时间长，往往延误临床正确的诊断和治疗。近年来，人们将PCR技术用于病原菌的检测。PCR技术虽然较传统方法灵敏、快速，但需要较昂贵的仪器设备。更为重要的是，PCR方法容易产生非特异性扩增产物，造成假阳性和假阴性结果，影响对样品的正确判断。本工程将建立适合于食品和临床标本大规模检测的环介导等温扩增快速检测病原菌技术。与目前的检测方法相比，等温扩增法具有快速、准确、灵敏的特点。而且，等温扩增法是在恒温下进行，只需一个简单的恒温装置，不需要PCR实验中的昂贵仪器，因而易于在基层食品质量检测部门和医院推广使用。（2）目前，国外已有将环介导等温扩增技术应用于病毒DNA和 RNA检测的报道，但将其应用于病原菌检测的文献报道极少，国内基本上还未开展环介导的等温扩增研究工作。本工程首次提出将环介导的等温扩增技术应用于食品和临床标本中病原菌的检测，并对目前的等温扩增方法提出改进策略，发展可同时检测多种病原菌的多重等温扩增技术，以克服当前一个等温扩增反应只能检测一种DNA或 RNA的缺点。因此，本工程的实施，将开发出具有自主知识产权的病原菌检测试剂盒。3、工程完成时达到的技术水平工程完成时，开发的多重环介导等温扩增快速检测病原菌技术精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 3 页，共 12 页及其配套试剂盒达到国际先进水平。（二）工程技术方案1、技术方案（1）环介导等温扩增（LAMP ）和多重等温扩增快速检测常见病原菌方法的建立常见病原菌特异性LAMP引物的设计。根据GenBank数据库公布的常见病原菌DNA 序列，采用 LAMP 专用引物设计软件设计特异性 LAMP引物（包括每类致病菌的两个外引物、两个内引物和两个环引物，其中每个内引物均具有两段能够识别靶分子上特定位点的序列，以保证靶序列的特异性扩增。）常见病原菌基因组DNA的提取。采用本实验室建立的基因组DNA 快速提取技术提取致病菌DNA 。LAMP扩增反应体系的优化：对引物浓度、内引物和外引物的最佳浓度比、模板浓度、dNTP浓度、 BstDNA 聚合酶用量、 Mg2+浓度等条件进行优化。温育条件的优化：在55-65之间优化等温扩增温度。扩增产物的检测：建立快速显色法和电泳分析法两种检测扩增产物的方法。以上述研究结果为基础，建立常见病原菌的环介导等温扩增和多重环介导等温扩增快速检测技术。（2）常见病原菌的环介导等温扩增快速检测方法的灵敏度分析精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 4 页，共 12 页将常见病原菌目标基因克隆至pMD-18T载体，转化后提取质粒，倍比稀释成含目的基因拷贝数为105、104、103、102、101，以其为模板做环介导等温扩增反应，检测本方法的灵敏度。（3）常见病原菌的环介导等温扩增快速检测方法的特异性分析分别以病原菌和非病原菌基因组DNA为模板做环介导等温扩增反应，检测本方法的特异性。（4）常见病原菌的环介导等温扩增快速检测方法与国际标准方法及常规 PCR 扩增方法比较分析以 LAMP 的两个外引物做常规PCR 扩增，并与 LAMP的扩增结果进行比较分析，进一步判断LAMP 技术的灵敏度、特异性和稳定性。（5）常见病原菌的环介导等温扩增和多重等温扩增快速检测方法在食品检测和临床诊断中的应用研究将本方法应用于食品检测和临床诊断中，分析本方法对不同样品检测的准确率。（6）病原菌的环介导等温扩增和多重等温扩增快速检测试剂盒的研制根据本工程所建立的LAMP最佳反应体系和LAMP 反应产物显示方法，研制开发快速检测病原菌的试剂盒（包括单一病原菌检测试剂盒和多种病原菌同时检测试剂盒）。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 5 页，共 12 页2、工艺流程（三）工程技术质量指标（1）本工程建立的方法对病原菌检测的准确率达到95% 。（2）本工程建立的方法对病原菌目的基因检测的灵敏度达到101拷贝。引物优化、组合LAMP 反应体系的建立灵敏度实验特异性实验反应条件优化阴性对照阳性对照试剂盒中试同类产品比较实验国标法比较实验LAMP 方法应用于病原体检测样品收集核酸提取引物设计基因序列分析精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 6 页，共 12 页（3）本工程建立的方法不产生非特异性扩增产物。（4）对病原菌目的基因的等温扩增过程在30-60 分钟内完成，显色法检测扩增产物在5 分钟内完成，电泳法检测扩增产物在60 分钟内完成。（四）工程执行过程中各阶段目标2007 年度第一季度：设计引物，引物合成，购买实验菌株和有关试剂，完善实验条件。第二季度：样品采集，病原菌DNA 提取。第三季度：等温扩增反应体系优化，温育条件优化。第四季度：扩增反应产物检测方法的建立（快速显色法、电泳分析法）。2008 年度第一季度：环介导等温扩增快速检测病原菌方法操作程序确定，多重等温扩增同时检测多种病原菌实验技术建立。第二季度：环介导等温扩增和多重等温扩增快速检测病原菌方法的准确度分析。第三季度：环介导等温扩增和多重等温扩增快速检测病原菌方法的灵敏度分析。第四季度：环介导等温扩增和多重等温扩增快速检测病原菌方法与常规 PCR 扩增方法比较分析。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 7 页，共 12 页2009 年度第一季度：环介导等温扩增和多重等温扩增快速检测病原菌方法在食品和临床标本上的应用及效果分析。第二季度：环介导等温扩增快速检测病原菌试剂盒和多重等温扩增试剂盒研制。第三季度：试剂盒的应用及技术推广。第四季度：课题总结，鉴定。（五）工程经费预算情况本工程申请科研经费5 万元。其中设备、仪器购置费1 万元；材料、样品加工费0.5 万元；土建安装费0.5 万元；资料、调研费0.5 万元；实验、检测费2 万元；鉴定费 0.5 万元。三、工程实施支撑条件1、工程技术来源本工程的技术由工程申请人建立。2、工程实验、检测条件工程申请人所在学院生命科学学院拥有食品科学国家重点建设学科、生物化学与分子生物学省级重点学科和食品科学教育部重点实验室。这些重点学科和重点实验室设施完善、先进，具有进行本工程研究的实验条件和实验场地，为本工程的完成提供了保障。工程申请人所在的江西省生物化学与分子生物学重点实验室实验条件先进，具有PE-9700 型 PCR仪，全自动DNA测序仪（ ABI Prism 3100型）、高速冷冻离心机、超速冷冻离心机、超低温冰精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 8 页，共 12 页箱、Milli-Q超纯水系统、各种规格的电泳仪、紫外分光光度计、设施先进的细菌培养室等仪器设备。现已完成了本工程所需的科研平台建设工作。工程申请人长期从事分子生物学研究工作，熟练掌握了分子生物学研究技术。课题组已开展了本工程的前期研究工作，目前正在进行嗜水单胞菌和金黄色葡萄球菌的环介导等温扩增研究，基本掌握了等温扩增专用引物设计软件的使用和等温扩增的操作要点，这为本工程的顺利完成奠定了技术基础。3、工程申请单位人才资源情况工程申请单位南昌大学是我省唯一一所省部共建的“211”工程重点建设大学，人才资源丰富，科研力量雄厚。生命科学学院有专任教师 150 人，其中正副教授60 人，讲师 28 人，中高级技术人员比例 2:1 。4、工程组人员专业结构、职称结构工程组科研人员7 人，主要由生物化学与分子生物学专业、微生物学专业人员组成，专业结构合理。科研人员中，教授2 人、副教授 2 人、研究生 3 人。其中具有博士学位的教师2 人。5、工程新增投资筹集情况本工程申请科研经费5 万元。四、工程预期经济效益1、预期市场需求病原菌的检测是食品检测和临床诊断中的常规工程，食品检测精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 9 页，共 12 页部门和医疗机构对检测试剂的需求量巨大。等温扩增技术在病原菌的检测工作中有很大潜力。然而，目前国外仅有将其用于病毒DNA和 RNA检测的研究报道，在病原菌检测领域尚无以此技术开发的商业试剂，国内也未见这方面的研究开发报道。因此，开发病原菌的环介导的等温扩增试剂具有广阔的前景。2、预期盈利水平目前以传统方法检测一个样品中的一种致病菌的收费约50元。本工程建立的检测技术检测一个样品的试剂成本约8 元，如果以 20 元销售，可获利润12 元。一个小型试剂生产企业一年至少可生产检测 50 万个样品的试剂，每年获利600 万元。因此，该技术的推广可产生明显的经济效益。3、预期产业化前景本工程是针对严重影响人类健康的病原菌的检测问题提出的，研究成果的实用性强，易于转化。在产品的研制工作中采用了现代分子生物学新技术，产品的科技含量高，生产成本低，利润空间大。本产品的生产不需特殊大型设备，产品定型后可向中小型生化试剂生产企业转让，因此，本工程的产业化前景广阔。我省具有一定生产能力的试剂生产企业经技术培训后可生产本产品。4、工程实施风险分析课题组已开展了本工程的前期研究工作，目前正在进行嗜水单胞菌和金黄色葡萄球菌的环介导等温扩增研究，基本掌握了等温扩增专用引物设计软件的使用和等温扩增的操作要点，这为本工程的精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 10 页，共 12 页顺利完成奠定了技术基础。工程申请人所在实验室为江西省生物化学与分子生物学重点实验室，实验条件先进，现已完成了进行本工程研究的科研平台建设工作。因此，本工程的实施基本上不存在技术风险。常规检测病原菌的细菌培养分离鉴定法费时费力，近年发展起来的 PCR鉴定法易产生非特异性产物，导致假阳性或假阴性结果。与常规检测技术和PCR技术相比，环介导的等温扩增技术具有快速、准确、灵敏、低成本等优点。在本工程的研究中，我们还将建立一次测试能够检测多种致病菌的多重环介导等温扩增新技术。该技术易于质控，适用于大批量样品同时检测，值得在食品病原菌普查和人体健康普查工作中推广应用。环介导等温扩增新技术以其明显的优势将完全能够取代目前使用的常规分析方法和PCR方法，成为病原菌检测中的主要检测方法。因此，本工程的成果转化基本上不存在市场风险。五、工程预计社会效益、环境效益1、对社会发展的作用本工程的实施将开发出具有自主知识产权的病原菌检测技术和配套试剂盒。该检测方法简单、快速、便宜，不需要昂贵的仪器设备，易于在基层食品检测部门和医院推广。这对于保障我省食品安全和人体健康具有重要意义，能够产生明显的社会效益。2、对资源利用情况本工程是生物高科技产品，技术含量高，产品的生产原料主要精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 11 页，共 12 页是常规生物化学试剂，因此不会破坏自然资源。3、对人才培养情况本工程的实施，将为我省培养从事现代分子生物学产品开发和病原菌检验人员 3-4 人，培养硕士研究生5-6 人。4、环境影响及效益。本工程的研究和产品开发过程中不会使用有害物质，也不会过度利用自然资源，因此不会对环境造成影响。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 12 页，共 12 页