目目录录第二十二章第二十二章常用分子生物学技术常用分子生物学技术的原理及应用的原理及应用ThePopularTechnologyinMolecularBiology:PrincipleandApplication生物科学与技术学院生物科学与技术学院 目目录录第第 一一 节节分子杂交与印迹技术分子杂交与印迹技术MolecularHybridization&BlottingTechnology目目录录核酸分子杂交核酸分子杂交(nucleicacidhybridization)一、分子杂交与印迹技术的原理一、分子杂交与印迹技术的原理目目录录复性复性RNADNA目目录录核酸分子杂交的原理核酸分子杂交的原理 带有某种标记的核酸单链作为带有某种标记的核酸单链作为探针探针，在一定条件下，在一定条件下， 按碱基互补配对原按碱基互补配对原则与互补的则与互补的核酸核酸单链退火形成单链退火形成双链双链杂交体杂交体， 鉴定靶序列的存在、分子鉴定靶序列的存在、分子大小或进行靶序列的相对定量分析。大小或进行靶序列的相对定量分析。 目目录录核酸分子杂交的杂交动力学核酸分子杂交的杂交动力学 核酸分子杂交核酸分子杂交 核心序列形成核心序列形成 自发过程自发过程 目目录录（一）印迹技术（一）印迹技术（二）探针技术（二）探针技术探针探针(probe)目目录录 探针的来源探针的来源n 基因组基因组DNA探针探针n cDNA探针探针n RNA探针探针n 寡核苷酸探针寡核苷酸探针目目录录二、印迹技术的类别及应用二、印迹技术的类别及应用（一）（一）DNA印迹技术印迹技术(Southernblotting)（二）（二）RNA印迹技术印迹技术(Northernblotting)（三）蛋白质的印迹分析（三）蛋白质的印迹分析(Westernblotting)目目录录 其他其他斑点印斑点印迹迹(dotblotting)原位杂交原位杂交(insituhybridization)DNA点阵点阵(DNAarray)DNA芯片技术芯片技术(DNAchip)目目录录 核酸杂交技术n（一）Southern Blot 原理原理用途：检测样品中的用途：检测样品中的DNA及其含量，及其含量，了解基因的状态了解基因的状态,如是否有点突变、如是否有点突变、扩增重排等。扩增重排等。 目目录录 Southern Blot 操作步骤：操作步骤：DNA 琼脂糖电泳琼脂糖电泳 印迹转移印迹转移 预杂交预杂交 杂交（变性探针）杂交（变性探针） 洗膜洗膜 放射自显影或显色放射自显影或显色目目录录目目录录斑点印迹杂交斑点印迹杂交(Dot blot)斑点印迹斑点印迹 优点优点-简单、迅速；核酸粗提、多样品检测简单、迅速；核酸粗提、多样品检测 缺点缺点-不确定分子量、特异性不高，假阳性不确定分子量、特异性不高，假阳性 目目录录原位杂交原位杂交 （In Situ hybridization） 标标记记的的核核酸酸探探针针与与组组织织切切片片或或细细胞胞中中的的待测核酸中的互补序列杂交。待测核酸中的互补序列杂交。 1969, Pardue -爪蟾核糖体基因探针爪蟾核糖体基因探针 1970, Orth -兔乳头状瘤病毒兔乳头状瘤病毒cDNA探针探针 目目录录Western Blot 原理原理目目录录 操作过程nSDS-PAGE电泳电泳 转膜（转膜（PVDF或硝酸纤维素膜）或硝酸纤维素膜）n封闭封闭 一抗一抗 洗涤洗涤 酶标二抗反应酶标二抗反应n洗涤洗涤 显色或化学发光显影显色或化学发光显影目目录录Hours04816WesternblotanalysisofthecleavageofCaspase-3/Bcl-2.Cellsweretreatedwith20M of gossypol for 4, 8 and 16 h. After treatment, cells were harvested and lysed in lysis buffer. 50ug of protein was loaded in each lane and the expression of actin was detected as a loading control.目目录录注意的问题注意的问题n蛋白质电泳n常用SDS-PAGEn非变性PAGEnTris-Tricine胶中电泳聚丙烯酰胺具有神经毒性，操作时要戴手套聚丙烯酰胺具有神经毒性，操作时要戴手套目目录录三三种种印印迹迹技技术术的的比比较较分子杂交实验分子杂交实验目目录录放放射射自自显显影影照照片片目目录录目目录录目目录录 DNA芯片: （Bio-chip、DNA arrays、Oligonucleotide microchip) 特点：高度并行性，多样性，微型化和特点：高度并行性，多样性，微型化和自动化。自动化。 DNADNA芯片芯片目目录录Assay Formats NormalNormalSamplSample e1.Extractgenomic1.ExtractgenomicDNAfromtissueDNAfromtissue4.HybridizetoChip4.HybridizetoChip5.WashandImage5.WashandImage2.Label2.LabelGenomicExpression1.ExtractmRNA1.ExtractmRNAfromtissuefromtissue2.Produce2.ProducecDNAcDNAbybyRT&LabelRT&Label4.HybridizetoChip4.HybridizetoChip5.WashandImage5.WashandImage3.Mixwithlabeled3.MixwithlabeledreferenceDNAreferenceDNA3.Mixwithlabeled3.MixwithlabeledreferencereferencecDNAcDNATumorTumorSampleSample目目录录DNA micrarray robot enclosed in a temperature and humidity controlled environment. 目目录录目目录录目目录录Research UseFrom Sequence to function 计算计算Ratio 值值 (= Cy3/Cy5) n 在在 0.5-2.0 之外的定义为在两样本中之外的定义为在两样本中有明显差异表达。进而获取初步功能信有明显差异表达。进而获取初步功能信息。息。 Clustering目目录录 芯片杂交结果示意图目目录录DNA点阵点阵目目录录目目录录DNADNA芯片技术的主要应用芯片技术的主要应用 分析基因组、发现新基因分析基因组、发现新基因 基因表达的研究基因表达的研究 DNADNA序列分析序列分析 基因诊断基因诊断 基因药物设计基因药物设计目目录录第第 二二 节节 聚聚 合合 酶酶 链链 反反 应应PolymeraseChainReaction目目录录 PCR技术发展简史技术发展简史(1)(1)PCR的最早设想的最早设想 (2)(2)PCR的实现的实现 19851985年美国年美国PE-Cetus公司人类遗传研公司人类遗传研究室的究室的Mullis 等发明了具有划时代意义的聚合酶链等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。反应。(3) (3) PCR的改进与完善的改进与完善目目录录 耐热的耐热的DNADNA聚合酶聚合酶TaqTaq DNADNA聚聚合合酶酶于于19881988年年saikisaiki从从嗜嗜热热水水生生菌菌thermusthermus aquaticsaquatics YT-1YT-1株株中中直直接接分分离离出出来来。该该菌菌株株于于19691969年年从从美美国国黄黄石石国国家家森森林林公公园园火火山山温温泉泉中中分分离离到到。基基因因全全长长2,499bp2,499bp，编编码码分分子子量为量为94 94 kdkd、长度为长度为832832个氨基酸的蛋白质。个氨基酸的蛋白质。目目录录聚合酶链式反应聚合酶链式反应(PCR)(PCR)原理原理PCRPCR是是KaryKary MullisMullis于于19851985年年发发明明的的一一种种模模拟拟天天然然DNADNA复复制制过过程程, ,即即利利用用DNA DNA 聚聚合合酶酶（如如TaqTaq DNADNA聚聚合合酶酶）等等在在体体外外条条件件下下，催催化化一一对对引引物物间的特异间的特异DNADNA片段合成的基因体外扩增技术。片段合成的基因体外扩增技术。5 Primer15 Primer2Cycle2Cycle15 5 5 5 5 5 TemplateDNA5 5 5 5 5 5 5 5 一、基本工作原理一、基本工作原理目目录录Cycle35 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530次循环后，模板次循环后，模板DNA的含量的含量可以扩大可以扩大100万倍以上。万倍以上。目目录录目目录录n模板模板DNAn特异性引物特异性引物n耐热耐热DNA聚合酶聚合酶ndNTPsnMg2+二、二、PCRPCR体系基本组成成分体系基本组成成分目目录录三、三、PCR的基本反应步骤的基本反应步骤变性变性95C延伸延伸72C退火退火Tm-5C目目录录PCRthermalcyclers目目录录 平台期与平台效应（平台期与平台效应（plateau effectplateau effect） PCRPCR经经过过一一定定数数量量的的循循环环后后，随随着着产产物物的的对对数数累累积积趋趋于于饱饱和和，DNADNA片片段段不不再再呈呈指指数数积积累累，而而是是进进入入线线性性增增长长期期或或静静止止期期，此过程称为平台效应。此过程称为平台效应。目目录录 PCRPCR通用操作程序通用操作程序 向向 一一 微微 量量 离离 心心 管管 中中 依依 次次 加加 入入 ： 双双 蒸蒸 水水 补至终体积（终体积补至终体积（终体积2020100100l l）1010PCRPCR缓冲液缓冲液 1/101/10体积体积2mmol/L 2mmol/L dNTPdNTP 1/10 1/10体积体积引物引物 各各101050pmol50pmolDNADNA模板模板 10102 210105 5拷贝拷贝TaqTaq DNA DNA聚合酶聚合酶 0.20.22.5U2.5U混匀后，离心数秒。混匀后，离心数秒。目目录录 加矿物油加矿物油5050100100l l于反应液表面于反应液表面以防蒸发以防蒸发, ,于于PCRPCR仪上设置程序，置反应仪上设置程序，置反应管于管于PCRPCR仪上，进行热循环。仪上，进行热循环。 琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。目目录录目目录录（一）目的基因的克隆（一）目的基因的克隆（二）基因的体外突变（二）基因的体外突变（三）（三）DNA和和RNA的微量分析的微量分析（四）（四）DNA序列测定序列测定（五）基因突变分析（五）基因突变分析四、四、PCR的主要用途的主要用途目目录录三、几种重要的三、几种重要的PCR衍生技术衍生技术（一）反转录（一）反转录PCR技术技术（二）原位（二）原位PCR技术技术（三）实时（三）实时PCR技术技术目目录录 原位原位PCR(In-situ PCR)PCR(In-situ PCR) 原位PCR是指直接用细胞涂片或石蜡片包埋组织切片在单个细胞中进行PCR扩增，然后用特异探针进行原位杂交检测含该特异序列的细胞的一种方法。 实时实时PCRPCR技术原理技术原理目目录录目目录录第第 三三 节节 核核 酸酸 序序 列列 分分 析析NucleicAcidSequenceAnalysis目目录录核酸序列分析的基本原理核酸序列分析的基本原理化学裂解法化学裂解法(Maxam-Gillbert法法)DNA链的末端合成终止法链的末端合成终止法(sanger法法)目目录录一、化学裂解法一、化学裂解法( (Maxam-Gillbert法法) )基本原理基本原理基于某些化学试剂可以使基于某些化学试剂可以使DNADNA链在链在1 1个或个或2 2个个碱基处发生专一性断裂的特性，精确地控制反应碱基处发生专一性断裂的特性，精确地控制反应强度，使一个断裂点仅存在于少数分子中，不同强度，使一个断裂点仅存在于少数分子中，不同分子在不同位点断裂，从而获得一系列大小不同分子在不同位点断裂，从而获得一系列大小不同的的DNADNA片段，将这些片段经电泳分离。片段，将这些片段经电泳分离。分析前，用同位素标记分析前，用同位素标记DNADNA的的5 5末端，经放末端，经放射自显影即可在射自显影即可在X胶片上读出胶片上读出DNADNA链的序列。链的序列。目目录录二、二、DNA链末端合成终止法链末端合成终止法目目录录目目录录目目录录三、三、DNA自动测序自动测序采采用用荧荧光光替替代代放放射射性性核核素素标标记记是是实实现现DNA序序列列分分析析自自动动化化的的基基础础。用用不不同同荧荧光光分分子子标标记记四四种种双双脱脱氧氧核核苷苷酸酸，然然后后进进行行Sanger测测序序反反应应，反反应应产产物物经经电电泳泳分分离离后后，检检测测器器采采集集荧荧光光信信号号，并并依依此此确确定定DNA碱碱基的排列顺序。基的排列顺序。目目录录DNA自动测序结果举例目目录录目目录录基基 因因 文文 库库GeneLibrary第第 四四 节节目目录录基因组基因组DNA文库文库 (genomicDNAlibrary)cDNA文库文库 (cDNAlibrary)基因文库基因文库(genelibrary)是指一个包含了某一生物体全部是指一个包含了某一生物体全部DNADNA序列序列的克隆群体。的克隆群体。目目录录基因组基因组DNA文库文库目目录录目目录录疾病相关基因的克隆与鉴定疾病相关基因的克隆与鉴定CloningandIdentificationofDiseaseRelativeGenes第第 五五 节节目目录录克隆疾病相关基因的策略克隆疾病相关基因的策略（一）功能性克隆（一）功能性克隆( (functionalcloning) )（二）定位克隆（二）定位克隆(positionalcloning)（三）非定位候选基因克隆策略（三）非定位候选基因克隆策略(position-independentcandidategeneapproaches)（四）定位候选基因克隆策略（四）定位候选基因克隆策略(positionalcandidategeneapproaches)目目录录定义定义 从对一种致病基因的功能的了解出发，从对一种致病基因的功能的了解出发，克隆该致病基因。克隆该致病基因。（一）功能性克隆（一）功能性克隆应用应用 生化机制已明确、基因表达产物较易生化机制已明确、基因表达产物较易得到部分纯化的遗传性疾病。得到部分纯化的遗传性疾病。目目录录克隆方式克隆方式 利用特异性抗体筛选表达型利用特异性抗体筛选表达型cDNA文库；文库； 根据已知的部分氨基酸序列合成寡核苷酸作探根据已知的部分氨基酸序列合成寡核苷酸作探针，筛选针，筛选cDNA文库。文库。 功能互补试验功能互补试验 (functionalcomplementationassay)利用酵母系统从功能学角度鉴定致病基因。利用酵母系统从功能学角度鉴定致病基因。 目目录录（二）定位克隆（二）定位克隆定义定义从一种致病基因的染色体定位从一种致病基因的染色体定位出发逐步缩小范围，最后克隆该出发逐步缩小范围，最后克隆该基因。基因。目目录录（三）非定位候选基因克隆策略（三）非定位候选基因克隆策略 由于基因组作图的完成和分子病理学的发由于基因组作图的完成和分子病理学的发展，人们可以不依靠染色体定位，直接根据病展，人们可以不依靠染色体定位，直接根据病理学变化和对各种基因产物功能的了解，预测理学变化和对各种基因产物功能的了解，预测出候选致病基因。出候选致病基因。目目录录（四）定位候选基因克隆策略（四）定位候选基因克隆策略当致病基因的染色体定位确认后，人们可当致病基因的染色体定位确认后，人们可以利用因特网上的基因网站所提供基因序列数以利用因特网上的基因网站所提供基因序列数据，鉴定出候选致病基因。据，鉴定出候选致病基因。目目录录第第 六六 节节遗传修饰动物模型的建立遗传修饰动物模型的建立及应用及应用TheEstablishmentandApplicationofHeredity-ModifiedAnimalModel目目录录转基因技术转基因技术采采用用基基因因转转移移技技术术使使目目的的基基因因整整合合入入受受精精卵卵细细胞胞或或胚胚胎胎干干细细胞胞，然然后后将将细细胞胞导导入入动动物物子子宫，使之发育成个体。宫，使之发育成个体。转基因转基因被导入的目的基因被导入的目的基因转基因动物转基因动物( (transgenicanimal)目的基因的受体动物目的基因的受体动物一、一、转基因技术转基因技术目目录录目目录录核转移技术核转移技术即即动动物物整整体体克克隆隆技技术术，将将动动物物体体细细胞胞核核全全部部导导入入另另一一个个体体的的去去胞胞核核的的受受精精卵卵内内，使之发育成个体，即克隆使之发育成个体，即克隆( (clone)。二、核转移技术二、核转移技术目目录录基因剔除技术基因剔除技术也称也称基因靶向基因靶向( (genetargeting) )灭活灭活，有目的去除动物体内某种基因的技术。有目的去除动物体内某种基因的技术。三、基因剔除技术三、基因剔除技术目目录录四、基因转移和基因剔除技术在医四、基因转移和基因剔除技术在医学中的应用学中的应用建立动物模型建立动物模型 单基因决定疾病模型单基因决定疾病模型 基因剔除基因剔除获得性突变获得性突变(gain-of-functionmutation) 多基因决定疾病模型多基因决定疾病模型目目录录第第 七七 节节 生生 物物 芯芯 片片 技技 术术BiologicalChipTechnology目目录录DNA芯片芯片(DNAchip) cDNA芯片芯片(cDNAchip)一、基因芯片一、基因芯片基因芯片基因芯片(genechip)目目录录目目录录目目录录是是将将高高度度密密集集排排列列的的蛋蛋白白分分子子作作为为探探针针点点阵阵固固定定在在固固相相支支持持物物上上，当当与与待待测测蛋蛋白白样样品品反反应应时时，可可捕捕获获样样品品中中的的靶靶蛋蛋白白，再再经经检检测测系系统统对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。二、蛋白质芯片二、蛋白质芯片蛋白质芯片蛋白质芯片(proteinchip)目目录录第第 八八 节节蛋白质相互作用研究技术蛋白质相互作用研究技术 ResearchTechnologyofInteractionofProtein目目录录蛋白质之间相互作用以及通过相互作用而形蛋白质之间相互作用以及通过相互作用而形成的蛋白复合物是细胞各种基本功能的主要完成成的蛋白复合物是细胞各种基本功能的主要完成者。几乎所有的重要生命活动，包括者。几乎所有的重要生命活动，包括DNADNA的复制的复制与转录、蛋白质的合成与分泌、信号转导和代谢与转录、蛋白质的合成与分泌、信号转导和代谢等等，都离不开蛋白质之间的相互作用。等等，都离不开蛋白质之间的相互作用。 蛋白质之间相互作用研究的重要性蛋白质之间相互作用研究的重要性目目录录酵母双杂交酵母双杂交各种亲和分析（亲和色谱、免疫共沉淀等）各种亲和分析（亲和色谱、免疫共沉淀等）荧光共振能量转换效应分析荧光共振能量转换效应分析噬菌体显示系统筛选等等噬菌体显示系统筛选等等常用蛋白质相互作用的研究技术常用蛋白质相互作用的研究技术一、酵母双杂交技术的基本原理一、酵母双杂交技术的基本原理目目录录目目录录双双杂杂交交系系统统的的原原理理LacZGal4激活域Gal4结合域Gal4结合域LacZLacZGal4激活域LacZGal4激活域Gal4结合域XYXY目目录录二、酵母双杂交系统的应用二、酵母双杂交系统的应用（一）分析已知蛋白之间的相互作用（一）分析已知蛋白之间的相互作用（二）对蛋白质功能域的分析（二）对蛋白质功能域的分析（三）分析未知蛋白相互作用（三）分析未知蛋白相互作用（四）绘制蛋白质相互作用系统图谱（四）绘制蛋白质相互作用系统图谱（五）在药物设计中的应用（五）在药物设计中的应用目目录录