色层分离法色层分离又称层析法或色谱法，它的最大特点是分离效率高，它能把各种性质极相似的物质彼此分离，而后分别加以检出和测定。分离科学与进展中科大lecture(4)课件色层法的发现俄国植物学家茨维特（Tswett）1906年提出色谱（Chromatography）的概念，Tswett让植物色素的石油醚萃取液流经装有碳酸钙的管柱，并继续以纯净的石油醚加以洗脱，得到三种颜色的5个色带。英国生物学家Martin和Synge于1940年提出液液分配色谱，1941年提出用气体代替液体作为流动相，他们首先提出了色谱塔板理论，以及其远见卓识的预言。1952年James和Martin因其在色谱理论和实践方面的贡献获得了诺贝尔奖。1944年出现纸层析以后，层析法不断发展，相继出现薄层层析、亲和层析、凝胶层析、气相层析、高压液相层析（HPLC）等。分离科学与进展中科大lecture(4)课件茨维特使用的实验装置分离科学与进展中科大lecture(4)课件色层分析法的种类按流动相和固定相的性质不同，色层分析可分为：气固层析法、气液层析法、液固层析法和液液层析法；按固定相所处的状态不同可分为：柱层析、纸层析和薄层层析；按层析分离的原理不同可分为：吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶层析等分离科学与进展中科大lecture(4)课件色层分析法的种类名称分离原理吸附层析法固定相是固体吸附剂，各组份在吸附剂表面的吸附能力不同分配层析法各组份在流动相和静止液相中的分配系数不同离子交换层析法固定相是离子交换剂，各组份与离子交换剂亲和力不同凝胶层析法固定相是多孔凝胶，各组份的分子大小不同，因而在凝胶中受阻滞的程度不同亲和层析法固定相只能与一种待分离组份专一结合，以此和无亲和力的其经组份分离分离科学与进展中科大lecture(4)课件柱层析吸附柱层析：根据等分离物质在固体吸附剂表面吸附能力的强弱来加以分离分析的技术分配柱层析：根据欲分离组分在两种互不混溶（或部分混溶）的溶剂间溶解度的差异来进行分离的技术分离科学与进展中科大lecture(4)课件吸附柱层析固液两相中处于液相中的物质在固液两相的界面发生密集现象称为吸附，利用吸附剂对不同物质具有不同吸附力使混合物得到分离的现象就叫吸附层析。在某一温度下某种组分在吸附剂表面的吸附规律可用平衡状态时此组分在两相中浓度的相对关系曲线来表示，这种关系曲线称为吸附等温线。分离科学与进展中科大lecture(4)课件吸附柱层析吸附分配系数：KD = cs / cm在试样中各组分的分配系数往往稍有差异。分配系数较大的组分在柱中被吸附得较牢，在固定相中保留的时间较长，要把它从柱上洗脱下来，所需的溶剂（流动相）也较多。在洗脱过程中，由于经过了许多次的吸附、脱附的分配过程，使得分配系数稍有不同的组分，也能产生明显的保留特性的差异，从而使它们彼此分离。分离科学与进展中科大lecture(4)课件吸附柱层析保留时间和保留体积：组分在柱上的保留特性可用保留时间和保留体积来表示。保留时间是从进样开始到流出液中出现浓度最高点的时间；保留体积是从进样开始到流出液中出现浓度最高点时流过色谱柱的流动相的体积。分离科学与进展中科大lecture(4)课件吸附等温线与对应的洗脱曲线分离科学与进展中科大lecture(4)课件常用的吸附剂及其选择氧化铝：由Al(OH)3在300400C时脱水制得。氧化铝因生产时条件的不同可分为中性、酸性和碱性三种，吸附能力有所不同。中性氧化铝应用较广泛，适用于醛、酮、醌、酯、内酯化合物及某些苷的分离；酸性氧化铝适用于酸性化合物，如酸性色素、某些氨基酸，以及对酸稳定的中性物质的分离；碱性氧化铝适用于分离碱性化合物如生物碱、醇以及其它中性和碱性物质。一般讲，能用酸性或碱性氧化铝分离的物质也可用中性氧化铝分离。氧化铝具有吸附能力强、分离能力强的优点。分离科学与进展中科大lecture(4)课件常用的吸附剂及其选择氧化铝：氧化铝的活性和含水量密切有关。活性强弱用活度级IV级来表示，活度I级吸附能力最强，V级最弱。在100至400degC之间对氧化铝进行活化，活化温度越高，所得氧化铝的活性越强，但温度若高于600degC氧化铝会进一步脱水便开始烧结。由于脱水过程受到许多因素的影响，因此每批生产的氧化铝，其表面积和表面孔穴结构并不一致，活性也并不相同。通常分离弱极性的组分选用吸附活性强一些的氧化铝吸附剂，分离极性较强的组分，应选用活较弱的吸附剂。分离科学与进展中科大lecture(4)课件常用的吸附剂及其选择硅胶：层析用硅胶是由弹性多聚硅酸脱水制得，每批生产的硅胶，性能比较稳定。硅胶的表面化学组成有下面几种：硅胶吸附活性：活泼型游离型束缚型分离科学与进展中科大lecture(4)课件常用的吸附剂及其选择硅胶：水与硅胶表面的羟基可结合成水合硅酸：Si-OHOH2,使其失去吸附性能。加热至100degC左右能可逆地除去这些水分，使硅胶活化。最佳的硅胶活化条件为在105110degC加热30 min。如果加热到200degC以上，硅胶将失去结构水，形成硅氧烷，使吸附能力下降，如果加热至400degC以上，硅胶将发生烧结硅胶具有微酸性，吸附能力较氧化铝稍弱，可用于分离酸性和中性物质，如有机酸、氨基酸、匝萜类、甾体等。分离科学与进展中科大lecture(4)课件常用的吸附剂及其选择聚酰胺：由已内酰胺聚合而成，因而又称聚已内酰胺或锦纶。层析用的聚酰胺为白色多孔性的非晶形粉末，易溶于浓盐酸、热甲酸、苯酚等溶剂；不溶于水及甲醇、乙醇、丙酮、乙醚、氯仿、苯等有机溶剂，对碱比较稳定，对酸的稳定性较差、尤其是热的酸溶液。 分离科学与进展中科大lecture(4)课件常用的吸附剂及其选择聚酰胺：聚酰胺分子内存在很多的酰胺键，可与酚类、酸类、醌类、硝基化合物形成氢键，因而对这些物质有吸附作用。酚类和酸类是以其羟基或羧基与聚酰胺中酰胺键的羰基形成氢键；芳香硝基化合物和醌类化合物是以其硝基或醌基与聚酰胺分子中酰胺键的游离胺基形成氢键。各种化合物因其与聚酰胺形成氢键的能力不同，吸附能力也就不同，因此可以得到分离。 分离科学与进展中科大lecture(4)课件常用的吸附剂及其选择聚酰胺：分离科学与进展中科大lecture(4)课件常用的吸附剂及其选择聚酰胺：一般说来，能形成氢键基团较多的溶质，其吸附能力较大；对位、间位取代基团都能形成氢键时，吸附能增大，邻位的使吸附能力减小；芳香核具有较多共轭双键时，吸附能力增大；能形成分子内氢键者，吸附能力减小。分离科学与进展中科大lecture(4)课件流动相及其选择流动相的洗脱作用实质上是流动相分子与被分离的溶质分子竞争占据吸附剂表面活性中心的过程。强极性的流动相分子占据吸附中心的能力强，因而具有强的洗脱作用。非极性流动相竞争占据活性中心的能力弱，洗脱作用就弱得多。分离科学与进展中科大lecture(4)课件流动相及其选择为了使试样中吸附能力稍有差异的各组分相分离，就必须根据试样的性质，吸附剂的活性，选择适当极性的流动相。对于分离强极性的组分应选用极性较强的流动相才能把它从吸附剂上洗脱下来，使之沿着层析柱前进，弱极性的组分则应选用弱极性的流动相进行洗脱。分离科学与进展中科大lecture(4)课件常见功能团的极性强弱排序氟碳化合物烷烃烯烃芳烃有机卤化物醚类硝基化合物腈二甲胺酯类酮类醛类硫醇胺类酰胺醇类酚类羧酸类磺酸当有机分子的基本母核相同时，取代基团的极性增强，整个分子的极性增强；极性基团增多，整个分子的极性增强；分子中的双键多，吸附力强；共轭双键多，吸附力增强；分子中取代基团的空间排列对吸附性能也有影响，如同一母核中羟基处于能形成内氢键位置时，其吸附力将弱于不能形成内氢键的化合物分离科学与进展中科大lecture(4)课件常见溶剂的极性强弱排序流动相极性较弱时，可使试样中弱极性的组分洗脱下来，在层析柱中移动较快，而与极性强的组分分离。同样强极性和中等极性的流动相适用于强极性和中等极性组分的分离常用的流动相按其极性增强顺序排列如下：石汕醚环已烷二硫化碳四氯化碳三氯乙烯苯甲苯二氯甲烷氯仿乙醚乙酸乙酯丙酮正丙醇乙醇甲醇吡啶三键饱和）涂布固定液的薄层：有各种涂布方法分离科学与进展中科大lecture(4)课件各种特制薄层具有浓缩区的薄层：由两种不同硅胶铺成的薄层。前面一段为浓缩区，由孔穴直径极大的（50mm）、表面积很小、吸附能力极弱的硅胶铺成；后面的薄层由一般的硅胶吸附剂铺成，试样中的各种组分将在两种薄层的交界处发生浓缩，然后在进入后一种种薄层层析展开，可大大改善分离效果。分离科学与进展中科大lecture(4)课件各种特制薄层分离科学与进展中科大lecture(4)课件各种特制薄层高效薄层：由颗粒十分细小，粒度十分均匀，一般直径为57mm的硅胶吸附剂，加上高度惰性的粘合剂，铺成的质地十分致密、均匀、平滑的高效薄层预制板。其性能稳定，层析展开后斑点保持圆形不拖尾，分离效果极好，理论塔板数可达数千，为一般薄层的十倍。分离科学与进展中科大lecture(4)课件薄层层析中展开剂的选择、点样和展开展开剂的选择：展开剂、被分离组分的极性和吸附剂的活性这三者是相互关联相互制约的。分离科学与进展中科大lecture(4)课件薄层层析中展开剂的选择、点样和展开聚酰胺薄层：聚酰胺薄层与各类化合物形成氢键的能力不但取决于其本身，也与溶剂的介质有关。一般来讲，在水中形成氢键的能力最强，在有机溶剂中形成氢键的能力较弱弱，在碱性有机溶剂中形成氢键的能力最弱。因此在聚酰胺薄层上展开剂洗脱能力的大小顺序大致是：水乙醇甲醇丙酮稀氢氧化铵（钠）溶液甲酰胺二甲基甲酰胺分离科学与进展中科大lecture(4)课件薄层层析中展开剂的选择、点样和展开点样：基本与纸色谱类似展开：上行展开、下行展开、径向展开（高效板）、双向展开、连续展开（上行或下行）、程序控制多次展开法（PMD）、加压薄层展开分离科学与进展中科大lecture(4)课件薄层层析中展开剂的选择、点样和展开分离科学与进展中科大lecture(4)课件薄层层析中展开剂的选择、点样和展开分离科学与进展中科大lecture(4)课件薄层层析中展开剂的选择、点样和展开分离科学与进展中科大lecture(4)课件薄层层析中展开剂的选择、点样和展开分离科学与进展中科大lecture(4)课件薄层层析中展开剂的选择、点样和展开分离科学与进展中科大lecture(4)课件