单基因基因遗传病的研究方病的研究方法与技法与技术已知致病基因突已知致病基因突变分析分析基因突基因突变基因突基因突变l l稳定突定突变：传递中不改中不改变原有的突原有的突变。l l动态突突变：传递中中不不断断改改变自自己己，多多见于于短短重重复复序序列列的的突突变，在在一一代代代代传递中中重复次数重复次数发生明生明显变化。化。三核苷酸重复突三核苷酸重复突变基因突基因突变类型型l l点点点点突突突突变变：只只有有一一个个或或几几个个核核苷苷酸酸的的改改变，是是突突变中中最最多多见的的形形式式。突突变的的结果果分分为： 同同同同义义突突突突变变、错义错义突突突突变变、无、无、无、无义义突突突突变变、剪切突、剪切突、剪切突、剪切突变变等。等。等。等。l l碱碱碱碱基基基基的的的的插插插插入入入入和和和和缺缺缺缺失失失失：基基基基因因因因编编码码序序序序列列列列中中中中插插插插入入入入或或或或丢丢失失失失一一一一个个个个或或或或几几几几个个个个碱碱碱碱基基基基，其其其其结结果果果果是是是是突突突突变变点点点点下下下下游游游游碱碱碱碱基基基基序序序序列列列列发发生生生生移移移移码码，编编码码氨氨氨氨基基基基酸酸酸酸序序序序列列列列都都都都发发生生生生改改改改变变，又又又又称称称称移移移移码码突突突突变变（frameshift frameshift mutmuta ationtion），并并并并可可可可在在在在突突突突变变点点点点下游提前出下游提前出下游提前出下游提前出现终现终止密止密止密止密码码。基因突基因突变类型型l l框框框框内内内内突突突突变变（inframeinframe mutationmutation）：3 3个个个个或或或或是是是是3 3的的的的倍倍倍倍数数数数的的的的碱碱碱碱基基基基缺缺缺缺失失失失或或或或插插插插入入入入导导致致致致的的的的突突突突变变，使使使使基基基基因因因因丢丢失或增加失或增加失或增加失或增加1 1个或几个氨基酸。个或几个氨基酸。个或几个氨基酸。个或几个氨基酸。l lDNADNA大大大大片片片片段段段段缺缺缺缺失失失失或或或或复复复复制制制制（large large deletion deletion or or duplication)duplication)：几几几几百百百百个个个个bpbp至至至至几几几几十十十十个个个个kbkb的的的的碱碱碱碱基基基基缺缺缺缺失或复制。失或复制。失或复制。失或复制。 各种各种类型病理性突型病理性突变的比例的比例无无义突突变和移和移码突突变：60稀有的稀有的错义突突变：20DNA大片段缺失或重复大片段缺失或重复: 20微小突变微小突变基因突基因突变分析所用分析所用实验材料材料vv临床床样本取材：本取材：l l外周血外周血l l组织组织l l毛囊毛囊l l颊粘膜脱落细胞颊粘膜脱落细胞l l羊水细胞羊水细胞l l绒毛绒毛vv实验应用材料：用材料：l lDNADNAl lRNARNAl lProteinProteinRNA 的的优点与缺点点与缺点l l优点: 不包含内含子不包含内含子 RT-PCR RT-PCR 能能够检测够检测异常的剪切体异常的剪切体l l缺点: 不易不易获获得得 要求操作特要求操作特别别小心且快速以免降解小心且快速以免降解目的基因可能不在目的基因可能不在获获得的材料得的材料组织组织中表达中表达 导导致致RNARNA不不稳稳定的突定的突变变不能被不能被检测检测v聚合聚合酶链式反式反应v分子分子杂交交基因突基因突变分析常用技分析常用技术Southern印迹印迹杂交交例如：脆例如：脆X综合征合征l l若若X染色体在染色体在Xq27.3处呈呈现细丝样结构，构，且且连接的末端形似随体，接的末端形似随体，这条染色体就条染色体就被称被称为脆性脆性X染色体。染色体。l l主要主要临床症状：智力低下、床症状：智力低下、语言障碍、言障碍、性格孤僻、伴有特殊面容性格孤僻、伴有特殊面容长脸、方、方额、大耳、大耳朵、嘴大唇厚，青春期后可、嘴大唇厚，青春期后可见明明显大于正常的睾丸。大于正常的睾丸。l l通通贯掌、三叉点掌、三叉点C缺如。缺如。Xq27.3前突前突变和全突和全突变正常正常 CGG 200Southern杂交法交法诊断断Fragile XF: Fully expanded and methylatedNM: Methylated X do not cut with EclXIP: Unmethylated premutationN: X in normal male and active normal femaleMullis FMullis Ffor for his his invention invention of of the the polymerase polymerase chain chain reaction reaction (PCR) method(PCR) method聚合聚合酶链式反式反应（PCR）v聚合聚合酶链式反式反应于于1983年由美国年由美国Cetus公司的公司的K.Mullis建立，并和建立，并和定点突定点突变的的发明者明者M.Smith一起荣一起荣获1993年度年度诺贝尔化学化学奖，为生生命科学命科学领域的研究开域的研究开创了了崭新新时代。代。PCR反反应的特点的特点l l特异性特异性特异性特异性强强 引物与模板引物与模板引物与模板引物与模板结结合的特异性及聚合合的特异性及聚合合的特异性及聚合合的特异性及聚合酶酶的忠的忠的忠的忠实实性性性性 l l灵敏度高灵敏度高灵敏度高灵敏度高 指数增指数增指数增指数增长长，从从从从pg (10pg (10-12-12) )可可可可扩扩增至增至增至增至 m m m mg (10g (10-6-6) )水平水平水平水平 l l简简便、快速便、快速便、快速便、快速 2 24 4 小小小小时时完成完成完成完成扩扩增增增增l l对标对标本的本的本的本的纯纯度要求低度要求低度要求低度要求低 DNA DNA 粗制品及粗制品及粗制品及粗制品及总总RNARNA均可作均可作均可作均可作为扩为扩增模板增模板增模板增模板 DNADNA的体外复制包括的体外复制包括的体外复制包括的体外复制包括3 3个步个步个步个步骤骤：l l变变性（性（性（性（denaturationdenaturation）:94 :94 C C 95 95 C C l l退火（退火（退火（退火（annealingannealing）: 40 : 40 C C 70 70 C C l l延伸（延伸（延伸（延伸（extensionextension）:72 :72 C C 3 3个步个步个步个步骤骤作作作作为为PCRPCR的一个循的一个循的一个循的一个循环环，每当完成一个循，每当完成一个循，每当完成一个循，每当完成一个循环环，一个分子的模板被复制，一个分子的模板被复制，一个分子的模板被复制，一个分子的模板被复制为为二个，二个，二个，二个，产产物量以指物量以指物量以指物量以指数形式增数形式增数形式增数形式增长长。PCR反反应原理和反原理和反应过程程5533d.NTPs耐热DNA聚合酶引物5353535353535353添加反应混合液添加反应混合液及样本及样本变性变性535353535353退火退火加入试管中加入试管中延伸延伸53535353继续延伸继续延伸535355TaqTaq353TaqTaq55循环循环5353535355335353第二个循环第二个循环4个拷贝个拷贝第三个循环第三个循环8个拷贝个拷贝53535353535353535353533553535353第第n个循环个循环2n个拷贝个拷贝PCR反反应体系体系参与PCR反应的主要成份:模板、引物、dNTP、Taq DNA聚合酶和缓冲液等。引物引物(Primers) 引物决定引物决定PCR扩增增产物的特异性和物的特异性和长度度l l化学合成的寡核苷酸化学合成的寡核苷酸l l能与模板特异地能与模板特异地结合合l l引物决定引物决定产物的特异性和物的特异性和长度度l l引物引物设计时必须遵循一些原则时必须遵循一些原则 设计引物的原引物的原则：l l二条引物分二条引物分二条引物分二条引物分别别位于被位于被位于被位于被扩扩增片段的两端，与模板正增片段的两端，与模板正增片段的两端，与模板正增片段的两端，与模板正负负链链序列互序列互序列互序列互补补l l长长度度度度为为18 18 25 25个核苷酸个核苷酸个核苷酸个核苷酸l l二条引物之二条引物之二条引物之二条引物之间间避免形成引物二聚体避免形成引物二聚体避免形成引物二聚体避免形成引物二聚体l l引物的碱基引物的碱基引物的碱基引物的碱基组组成成成成应应平衡平衡平衡平衡l l引物的引物的引物的引物的55端可被修端可被修端可被修端可被修饰饰（引入（引入（引入（引入酶酶切位点、引入突切位点、引入突切位点、引入突切位点、引入突变变位位位位点、生物素等点、生物素等点、生物素等点、生物素等标记标记）DNA聚合聚合酶Taq DNA聚合聚合酶复制的保真性：复制的保真性：l lTaq DNA聚合聚合酶无无3 5外切外切酶活性，活性，因而无校正功能，在复制新因而无校正功能，在复制新链的的过程中程中会会发生碱基生碱基错配。配。l lTaq DNA聚合聚合酶在每次循在每次循环中中产生的移生的移码突突变率率为1/30000，碱基替，碱基替换率率为1/8000。扩增失增失败l l试剂错试剂错加或漏加加或漏加加或漏加加或漏加 实实验验中中中中如如如如发发现现对对照照照照样样本本本本也也也也扩扩增增增增失失失失败败，可可可可用用用用原原原原试试剂剂重复一次，以确定重复一次，以确定重复一次，以确定重复一次，以确定试剂试剂是否是否是否是否错错加或漏加。加或漏加。加或漏加。加或漏加。l l试剂试剂失效失效失效失效l l变变性温度偏低性温度偏低性温度偏低性温度偏低 有有有有些些些些DNADNA所所所所含含含含GG、C C碱碱碱碱基基基基对对丰丰丰丰富富富富，当当当当变变性性性性温温温温度度度度偏偏偏偏低低低低时时，双，双，双，双链链DNADNA不能完全解不能完全解不能完全解不能完全解链链。l l退火温度偏高退火温度偏高退火温度偏高退火温度偏高l l标标本本本本中中中中DNADNA含含含含量量量量过过高高高高或或或或杂杂质质过过多多多多。降降降降低低低低加加加加样样量量量量拖拖拖拖尾尾尾尾可可可可明明明明显显改善。改善。改善。改善。l lTaqTaq酶酶加加加加量量量量过过大大大大或或或或扩扩增循增循增循增循环环数太多数太多数太多数太多拖尾拖尾非特异条非特异条带l l退退退退火火火火温温温温度度度度低低低低, ,提提提提高高高高退退退退火温度。火温度。火温度。火温度。l l引引引引物物物物特特特特异异异异性性性性不不不不佳佳佳佳，切胶切胶切胶切胶纯纯化特异条化特异条化特异条化特异条带带l lTaqTaq酶酶加加加加量量量量过过大大大大或或或或扩扩增循增循增循增循环环数太多数太多数太多数太多引物二聚体引物二聚体l l引引引引物物物物量量量量过过多多多多：降降降降低低低低引引引引物物物物浓浓度。度。度。度。l l引物引物引物引物设计问题设计问题l l操操操操作作作作问问题题：反反反反应应体体体体系系系系建建建建立立立立后后后后，如如如如在在在在室室室室温温温温放放放放置置置置时时间间过过长长，会会会会引引引引起起起起扩扩增增增增后后后后的二聚体加重。的二聚体加重。的二聚体加重。的二聚体加重。应用用PCR相关技相关技术进行基因突行基因突变分析的策略与方法分析的策略与方法策略与方法策略与方法直接分析法：直接分析法：vvPCRPCR片段大小分析：片段大小分析：片段大小有明片段大小有明显显差异差异vvPCR-RFLPPCR-RFLP：有有酶酶切位点切位点vvPCR-PCR-测测序：序：确定突确定突变变点碱基改点碱基改变变vv多重多重连连接探接探针扩针扩增（增（MLPAMLPA）：）：片段缺失与重复片段缺失与重复vvRT-PCR:RT-PCR: 基因大，可取到新基因大，可取到新鲜鲜材料，且基因在其中有表达材料，且基因在其中有表达间间接分析法：接分析法：vvPCR-STRPCR-STR连锁连锁分析：分析：基因大；在已知致病基因基因大；在已知致病基因编码编码区未区未检测检测到突到突变变的家系的家系1. 脊髓小脊髓小脑性共性共济失失调l l脊髓小脊髓小脑脑性共性共济济失失调调是是遗传遗传性共性共济济失失调调的主要的主要类类型，包括型，包括SCA1SCA12727。成年期。成年期发发病、常染色病、常染色体体显显性性遗传遗传及共及共济济失失调调等是本病的共同特征，等是本病的共同特征，并表并表现现在在连续连续数代中数代中发发病年病年龄龄提前和病情加重提前和病情加重（遗传遗传早早现现）。）。 l lSCA3SCA3是我国最常是我国最常见见的脊髓小的脊髓小脑脑性共性共济济失失调亚调亚型，基因位于型，基因位于14q24.314q24.33232，含，含4 4个外个外显显子。子。CAGCAG突突变变位于位于4 4号外号外显显子，患者子，患者扩扩增拷增拷贝贝数数为为61618989，正常人，正常人为为12124141。 NC F1 F2 F3 F4 F5 PC M应用用PCR技技术分析一分析一遗传性脊髓小性脊髓小脑性共性共济失失调（SCA)3型家系型家系NCNC: :正常对照正常对照PCPC: :阳性对照阳性对照F F: :家系成员家系成员M M:Marker:Marker结果：结果：家系成员家系成员1 1、3 3、4 4有有SCA3SCA3致病基致病基因突变因突变; ;家系成员家系成员2 2、5 5未检测到突变未检测到突变123452. 脊肌萎脊肌萎缩症症l l脊肌萎缩症( Spinal Muscular Atrophy , SMA)系指一类由于下运动神经元变性导致的进行性骨骼肌无力和萎缩的一组疾病,是儿童和少年常见的致死性常染色体隐性遗传病之一,其隐性致病基因携带率在人群中为1/ 401/ 50 ,发病率为1/60001/10000.应用用PCR-RFLP技技术分析脊肌萎分析脊肌萎缩症（症（SMA）致病基因致病基因SMNPCRPCR扩增扩增SMNSMN基因基因exon7,DraIexon7,DraI酶切酶切PCRPCR产物产物. .酶切酶切N N：正常人：正常人PCRPCR产物被酶切为产物被酶切为两条带两条带酶切酶切P P：阳性对照：阳性对照PCRPCR产物被酶切为产物被酶切为一条短带一条短带病人病人1 1：结果显示：结果显示SMNSMN基因有突变基因有突变病人病人2 2和和3 3：结果：结果显示未有突变显示未有突变3. 腓骨肌萎腓骨肌萎缩症症(CMT)l lCMTCMT是一是一类类周周围围神神经经系系统遗传统遗传病病 , ,其其遗传遗传方式方式可可为为常染色体常染色体显显性性遗传遗传(AD ,(AD ,占占绝绝大多数大多数) ) 、常、常染色体染色体隐隐性性遗传遗传(AR)(AR)及及 X X连锁显连锁显性性遗传遗传(XD)(XD)l l依据病理和依据病理和电电生理特点分生理特点分为为两型两型: :脱髓鞘型脱髓鞘型 (CMT1 (CMT1 型型) ) 和和轴轴突型突型 (CMT2(CMT2型型). CMT1). CMT1型型约约占占 CMTCMT总总数的数的70%70%，70%70%以上以上CMT1CMT1由由PMP22PMP22基基因重复引起因重复引起l l其中其中X X连锁显连锁显性性遗传遗传CMTCMT致病基因致病基因为为CX32CX32，含，含有有2 2个外个外显显子子MLPA分析分析PMP22基因重复突基因重复突变 PCR-测序直接分析序直接分析CX32基因来基因来诊断断X连锁腓骨肌萎腓骨肌萎缩症症4. 假肥大型肌假肥大型肌营养不良症养不良症 假肥大型肌营养不良 (DMD) 是一种高发病率、高致残、高致死的X染色体连锁的遗传性疾病，在2500个活产男婴中即有一个患者 致病基因DMD含有79个外显子 DMD的最主要遗传缺陷是外显子缺失，约占60%-70%MLPA 技技术简介介l lMLPAMultiplex ligation-dependent probe Multiplex ligation-dependent probe amplificationamplification链链接依接依赖赖型多探型多探针扩针扩增技增技术术最早由荷最早由荷兰兰人人Schouten JP (Schouten JP et al, Schouten JP (Schouten JP et al, 2002) 2002) 在原有在原有PCRPCR技技术术上上发发展出来展出来MLPA 技技术原原理理MLPA方法方法检测DMD 1 12 23 34 45 55. 成人型多囊成人型多囊肾l l是一种最常是一种最常见见的的单单基因基因遗传遗传性性肾肾病，病，发发病率病率约为约为1/10001/1000l l其主要特征在双其主要特征在双肾肾形成形成进进行行性增性增长长的多个液性囊的多个液性囊肿肿，最，最终终可引起可引起肾肾衰竭衰竭 l l具有具有遗传遗传异异质质性，存在两个性，存在两个主要的致病基因主要的致病基因PKD1PKD1和和PKD2PKD24647ADPKD分子分子遗传基基础GeneGenePKD1PKD1PKD2PKD2PKD3 ?PKD3 ?Chromosomal locusChromosomal locus16p13.316p13.34q22-234q22-23ClonedClonedYesYesYesYesPercentagePercentage85%85%15%15%Exons/Single-copy Exons/Single-copy exonsexons46/46/Ex35-46Ex35-4615/15/Ex1-15Ex1-15Mutation numberMutation number 343 343100100Hot mutation Hot mutation No NoNoNoPKD1基因基因结构的复构的复杂性性PKD基因分析基因分析:l l直接基因突变分析：适于散发病例和小家系病例。具有结果判读的不确定性l l连锁分析: 适于分析在已知致病基因编码区未检测到突变的较大家系，不适于散发病例和小家系病例49PCR-测序分析序分析l l在在PKD1PKD1外显子编码序列上发现无义突变，使外显子编码序列上发现无义突变，使突变碱基所在密码子由突变碱基所在密码子由CGACGA变为终止密码子变为终止密码子TGATGA。连锁分分析析结果果新致病基因的研究方法新致病基因的研究方法和技和技术l l家系连锁分析来定位: 适于分析较大的遗传病家系，不适于散发病例和小家系病例l l二代测序技术：适于散发病例和小家系病例研究研究对象不同，策略方法不同象不同，策略方法不同 连锁连锁分析与二代分析与二代分析与二代分析与二代测测序相序相序相序相结结合加快新基因的合加快新基因的合加快新基因的合加快新基因的发现发现A AT TGGGGT TC CT TC CA AC CT TGGC CA AA AC CC CGGA AT TGGGGT TC CT TC CA AC CT TGGT TA AA AC CC CGGMetMetValValSerSerLeuLeuGlnGlnProProMetMetValValSerSerLeuLeuStop定位克隆定位克隆 利利用用被被定定位位的的基基因因与与在在同同一一染染色色体体上上另另一一遗传座座位位相相连锁的的特特点点，将将该基基因因定位在某一染色体或染色体某一区定位在某一染色体或染色体某一区带上。上。连锁分析分析vvDNA STR vvSNP常常见遗传标记PCR-STR连锁分析分析CACACAPrimer 1Primer 2CACACACACACACACACACACACACACACA毛毛细管管电泳分析泳分析PCR片段大小片段大小分析分析D4S1534D4S2929D4S2460D4S423I-1114,124176,178200,202105,112II-1114,120153,159200,202107,109II-2114,124157,176202,204105,112II-3114,122157,178200,202102,105II-4114,124157,176202,204105,112II-5114,124157,176198,202107,109III-1114,124153,176200,202109,112III-2114,124176,176202,202109,112连锁分析分析结果果vv均匀分布于均匀分布于23对染色体上的染色体上的STR vvSNP芯片芯片通通过全基因全基因组扫描来定位基因描来定位基因vv外外显子子组测序序 用二代用二代测序技序技术寻找致病基因找致病基因vv全基因全基因组测序序 基因功能相关分子基因功能相关分子遗传学研究方法学研究方法 隐性突性突变往往导致失去功能（loss of function） 显性突变可导致获得功能（gain of function）和失去功能 失去功能：单倍剂量不足（halpoinsufficency） 获得功能：显性负效应（dominant negtive） 隐性突性突变和和显性突性突变的致病机制的致病机制基因突基因突变对基因功能的影响及基因功能的影响及发病病机制研究机制研究l l将目的基因将目的基因将目的基因将目的基因cDNAcDNA克隆到合适克隆到合适克隆到合适克隆到合适载载体体体体l l应应用定点突用定点突用定点突用定点突变变方法建立突方法建立突方法建立突方法建立突变变基因基因基因基因载载体体体体l l体外功能研究：体外功能研究：体外功能研究：体外功能研究：应应用分子生物学技用分子生物学技用分子生物学技用分子生物学技术术研究与正常基研究与正常基研究与正常基研究与正常基因相比突因相比突因相比突因相比突变变基因突基因突基因突基因突变变有否功能差异。有否功能差异。有否功能差异。有否功能差异。 l l细细胞水平功能研究，突胞水平功能研究，突胞水平功能研究，突胞水平功能研究，突变变基因基因基因基因转转然然然然细细胞内，胞内，胞内，胞内，顺时转顺时转染或建立染或建立染或建立染或建立细细胞系，研究其所引起胞系，研究其所引起胞系，研究其所引起胞系，研究其所引起细细胞功能改胞功能改胞功能改胞功能改变变及其及其及其及其可能信号可能信号可能信号可能信号转导转导通路。通路。通路。通路。将目的DN片段克隆到质粒载体建立建立遗传病病动物模型物模型l l隐隐性性性性遗传遗传病：病：病：病：往往因基因失去功能所致，往往因基因失去功能所致，往往因基因失去功能所致，往往因基因失去功能所致，适于建适于建立基因敲除立基因敲除动动物模型，物模型，纯纯合突合突变变会表会表现现出人出人类类疾病相似表型疾病相似表型l l显显性性性性遗传遗传病：病：病：病：失去功能引起失去功能引起单倍倍剂量不足量不足，适于适于建立基因敲除建立基因敲除动动物模型，物模型，杂杂合突合突变动变动物会表物会表现现出人出人类类疾病相似表型，疾病相似表型，纯纯合突合突变变往往致死。往往致死。获得功能得功能导致致显性性负效效应，适于建立转基因动物模型，杂合突变会表会表现现出人出人类类疾疾病相似表型，病相似表型，纯纯合突合突变变往往表型更重。往往表型更重。Thank you!