第五章第五章 植物检验检疫技术植物检验检疫技术第一节第一节 常规检验检疫技术常规检验检疫技术一、现场检验检疫技术一、现场检验检疫技术1 1、直接检查：利用肉眼或放大镜、直接检查：利用肉眼或放大镜注意有无害虫的排泄物、脱皮壳、卵、注意有无害虫的排泄物、脱皮壳、卵、幼虫、蛹、茧和成虫诸虫态以及食痕幼虫、蛹、茧和成虫诸虫态以及食痕和危害状等。和危害状等。第五章第五章 植物检验检疫技术植物检验检疫技术第一节第一节 常规检验检疫技术常规检验检疫技术一、现场检验检疫技术一、现场检验检疫技术2 2、过筛检验：、过筛检验：取样携回室内进行过筛取样携回室内进行过筛检验，按粮谷、油料、豆类颗粒形状检验，按粮谷、油料、豆类颗粒形状和大小，选用不同孔径的规格筛和大小，选用不同孔径的规格筛第五章第五章 植物检验检疫技术植物检验检疫技术第一节第一节 常规检验检疫技术常规检验检疫技术一、现场检验检疫技术一、现场检验检疫技术2 2、过筛检验：、过筛检验：将需用的筛层，按筛孔大小顺序将需用的筛层，按筛孔大小顺序套好套好( (小筛孔放在下面小筛孔放在下面) )，将样品放人上层选筛内，将样品放人上层选筛内( (不宜过多，约达筛层高度的不宜过多，约达筛层高度的2 23)3)，套上筛盖，套上筛盖，电动或手动回旋转动一定时间后，按筛层将筛上电动或手动回旋转动一定时间后，按筛层将筛上物和筛下物分别倒入白瓷盘中，用扩大镜或解剖物和筛下物分别倒入白瓷盘中，用扩大镜或解剖镜检查，检出昆虫和螨类，同时还可检出虫粒、镜检查，检出昆虫和螨类，同时还可检出虫粒、病粒、杂草籽和其它夹杂物。若检查时室温低于病粒、杂草籽和其它夹杂物。若检查时室温低于1010，最下层筛出物须在，最下层筛出物须在20302030下处理下处理151520min20min，促使害虫活动，再行检查。，促使害虫活动，再行检查。第五章第五章 植物检验检疫技术植物检验检疫技术第一节第一节 常规检验检疫技术常规检验检疫技术一、现场检验检疫技术一、现场检验检疫技术3 3、软、软X X光透视检测光透视检测4 4、检疫犬检查、检疫犬检查第五章第五章 植物检验检疫技术植物检验检疫技术第一节第一节 常规检验检疫技术常规检验检疫技术二、实验室检验检疫技术二、实验室检验检疫技术1 1、相对密度检验、相对密度检验一定浓度的食盐水或其它溶液一定浓度的食盐水或其它溶液第五章第五章 植物检验检疫技术植物检验检疫技术第一节第一节 常规检验检疫技术常规检验检疫技术二、实验室检验检疫技术二、实验室检验检疫技术2 2、染色检验法、染色检验法检检查查粮粮粒粒中中的的谷谷象象、米米象象等等可可将将样样品品放放在在铁铁丝丝网网中中，在在3030的的水水中中浸浸lminlmin，再再移移入入1 1高高锰锰酸酸钾钾溶溶液液中中lminlmin，然然后后用用清清水水冲冲洗洗或或用用过过氧氧化化氢氢硫硫酸酸液液洗洗涤涤2030s2030s，用用扩扩大大镜镜检检查，挑出有直径约查，挑出有直径约0 05mm5mm黑斑点的籽粒，再行剖检。黑斑点的籽粒，再行剖检。 豆豆类类可可用用1 1碘碘化化钾钾或或2 2碘碘酒酒染染色色11115min5min，再再移移入入0 05 5氢氢氧氧化化钠钠或或氢氢氧氧化化钾钾液液中中2030s2030s，取取出出用用水水冲冲洗洗30s30s，如粒面有如粒面有12mm12mm直径的黑圆点，则内部可能隐藏豆象。直径的黑圆点，则内部可能隐藏豆象。第五章第五章 植物检验检疫技术植物检验检疫技术第一节第一节 常规检验检疫技术常规检验检疫技术二、实验室检验检疫技术二、实验室检验检疫技术2 2、染色检验法、染色检验法对对植植物物病病原原细细菌菌检检验验可可以以用用革革兰兰氏氏染染色色法法和和鞭鞭毛毛染染色色法法，对对于于植植物物病病原原线线虫虫则则用用透透明明染色法染色法第五章第五章 植物检验检疫技术植物检验检疫技术第一节第一节 常规检验检疫技术常规检验检疫技术二、实验室检验检疫技术二、实验室检验检疫技术3 3、直接镜检、直接镜检第五章第五章 植物检验检疫技术植物检验检疫技术第一节第一节 常规检验检疫技术常规检验检疫技术二、实验室检验检疫技术二、实验室检验检疫技术4 4、洗涤检验法、洗涤检验法用用于于检检测测种种子子表表面面附附着着的的真真菌菌孢孢子子，包包括括黑黑粉粉菌菌的的厚厚垣垣孢孢子子、霜霜霉霉菌菌的的卵卵孢孢子子、锈锈菌菌的夏孢子以及多种半知菌的分生孢子等。的夏孢子以及多种半知菌的分生孢子等。 第五章第五章 植物检验检疫技术植物检验检疫技术第一节第一节 常规检验检疫技术常规检验检疫技术二、实验室检验检疫技术二、实验室检验检疫技术4 4、洗涤检验法、洗涤检验法洗涤检验的操作程序如下：洗涤检验的操作程序如下：(1)(1)洗洗脱脱孢孢子子：将将一一定定数数量量的的种种子子样样品品放放人人容容器器内内并并加加入入定定量量蒸蒸馏馏水水或或其其它它洗洗涤涤液液，振振荡荡5 5一一lOminlOmin，使孢子脱离种子，转移到洗涤液中。使孢子脱离种子，转移到洗涤液中。(2)(2)离离心心富富集集：将将孢孢子子洗洗涤涤液液移移人人离离心心管管，低低速速离离心心(25003000r(25003000rmin)1015minmin)1015min，使使孢孢子子沉沉集集在在离离心管底部。心管底部。 第五章第五章 植物检验检疫技术植物检验检疫技术第一节第一节 常规检验检疫技术常规检验检疫技术二、实验室检验检疫技术二、实验室检验检疫技术4 4、洗涤检验法、洗涤检验法洗涤检验的操作程序如下：洗涤检验的操作程序如下：(3)(3)镜镜检检计计数数：弃弃去去离离心心管管内内的的上上清清液液，加加入入一一定定量量蒸蒸馏馏水水或或其其它它浮浮载载液液，重重新新悬悬浮浮沉沉集集在在离离心心管管底底部部孢孢子子，取取悬悬浮浮液液，滴滴加加在在血血球球计计数数板板上上，用用高高倍倍显显微微镜镜检检查查孢孢子子种种类类并并计计数数，据据此此可可计计算算出出种种子的带菌量。子的带菌量。(4)(4)孢孢子子生生活活力力测测定定：用用常常规规孢孢子子萌萌发发测测定定法法、分分离离培养法或红四氯唑培养法或红四氯唑(TTC)(TTC)染色法判定孢子死活。染色法判定孢子死活。 第五章第五章 植物检验检疫技术植物检验检疫技术第一节第一节 常规检验检疫技术常规检验检疫技术二、实验室检验检疫技术二、实验室检验检疫技术5 5、分离培养检验、分离培养检验主主要要适适用用于于潜潜伏伏于于种种子子、苗苗木木、繁繁殖殖材材料料及及植物产品内的病原菌植物产品内的病原菌分分离离真真菌菌一一般般用用PDAPDA培培养养基基，分分离离培培养养细细菌菌用用牛牛肉肉汁汁培培养养基基，对对于于特特殊殊要要求求的的菌菌类类可可以以用选择性培养基用选择性培养基第五章第五章 植物检验检疫技术植物检验检疫技术第一节第一节 常规检验检疫技术常规检验检疫技术二、实验室检验检疫技术二、实验室检验检疫技术5 5、分离培养检验、分离培养检验方法有：组织分离法方法有：组织分离法 稀释分离法稀释分离法 划线分离法划线分离法第五章第五章 植物检验检疫技术植物检验检疫技术第一节第一节 常规检验检疫技术常规检验检疫技术二、实验室检验检疫技术二、实验室检验检疫技术6 6、血清学检验、血清学检验方法有：免疫电镜技术方法有：免疫电镜技术 酶联免疫吸附技术酶联免疫吸附技术 斑点免疫法斑点免疫法 免疫荧光抗体法免疫荧光抗体法第五章第五章 植物检验检疫技术植物检验检疫技术第一节第一节 常规检验检疫技术常规检验检疫技术二、实验室检验检疫技术二、实验室检验检疫技术7 7、生理生化测定、生理生化测定第五章第五章 植物检验检疫技术植物检验检疫技术第一节第一节 常规检验检疫技术常规检验检疫技术二、实验室检验检疫技术二、实验室检验检疫技术8 8、噬菌体检验法、噬菌体检验法噬菌体是感染细菌的病毒，能在活细菌细噬菌体是感染细菌的病毒，能在活细菌细胞中寄生繁殖，破坏和裂解寄主细胞，在胞中寄生繁殖，破坏和裂解寄主细胞，在液体培养时，使混浊的细菌悬浮液变得澄液体培养时，使混浊的细菌悬浮液变得澄清，在固体平板上培养时，则出现许多边清，在固体平板上培养时，则出现许多边缘整齐，透明光亮的圆形无菌空斑，称为缘整齐，透明光亮的圆形无菌空斑，称为“噬菌斑噬菌斑”，肉眼即可分辩。，肉眼即可分辩。第五章第五章 植物检验检疫技术植物检验检疫技术第一节第一节 常规检验检疫技术常规检验检疫技术二、实验室检验检疫技术二、实验室检验检疫技术8 8、噬菌体检验法、噬菌体检验法国国内内已已采采用用噬噬菌菌体体法法检检查查水水稻稻稻稻种种是是否否带带有有白白叶叶枯枯病病菌菌。病病田田稻稻种种的的稻稻壳壳中中通通常常都都带带有有专专化化性性的的噬噬菌菌体体或或存存活活细细菌菌，可可据据以以确确定稻种确系带菌。定稻种确系带菌。 第五章第五章 植物检验检疫技术植物检验检疫技术第一节第一节 常规检验检疫技术常规检验检疫技术二、实验室检验检疫技术二、实验室检验检疫技术8 8、噬菌体检验法、噬菌体检验法取取10g10g稻稻种种，脱脱下下谷谷壳壳剪剪碎碎或或磨磨碎碎，放放入入已已灭灭菌菌处处理理的的烧烧杯杯中中，加加灭灭菌菌水水20ml20ml浸浸泡泡30min30min，过过滤滤后后分分别别吸吸取取滤滤液液1.51.5、1.01.0和和0.5ml0.5ml，置于三个灭菌的培养皿内置于三个灭菌的培养皿内 第五章第五章 植物检验检疫技术植物检验检疫技术第一节第一节 常规检验检疫技术常规检验检疫技术二、实验室检验检疫技术二、实验室检验检疫技术8 8、噬菌体检验法、噬菌体检验法各各加加lmllml新新培培养养的的白白叶叶枯枯细细菌菌指指示示菌菌液液( (浓浓度度为为9X109X108 8mlml以以上上) )混混匀匀后后加加入入10ml10ml融融化化的的肉肉汁汁胨胨琼琼脂脂培培养养基基，摇摇匀匀凝凝成成平平板板后后，放放在在25282528温箱中，培养温箱中，培养1012h1012h第五章第五章 植物检验检疫技术植物检验检疫技术第一节第一节 常规检验检疫技术常规检验检疫技术二、实验室检验检疫技术二、实验室检验检疫技术9 9、保湿萌芽检验、保湿萌芽检验保湿培养检验保湿培养检验 吸水纸检验法吸水纸检验法通通常常用用底底部部铺铺有有三三层层吸吸水水纸纸的的塑塑料料培培养养皿皿或或其其它它适适用用容容器器作作培培养养床床。先先用用蒸蒸馏馏水水湿湿润润吸吸水水纸纸，将将种种子子按按适适当当距距离离排排列列在在吸吸水水纸纸上上，再再在在一一定定条条件件下下培培养养，对对多多数数病病原原真真菌菌，适适宜宜的的培培养养温温度度为为20202525，每每天天用用近近紫紫外外光光(NUV)(NUV)灯灯或或日日光光灯灯照照明明12h12h。 第五章第五章 植物检验检疫技术植物检验检疫技术第一节第一节 常规检验检疫技术常规检验检疫技术二、实验室检验检疫技术二、实验室检验检疫技术9 9、保湿萌芽检验、保湿萌芽检验保湿培养检验保湿培养检验 吸水纸检验法吸水纸检验法培培养养7 7一一l0dl0d后后检检查查和和记记载载种种子子带带菌菌情情况况，检检查查时时，用用两两侧侧照照明明的的实实体体显显微微镜镜逐逐粒粒种种子子检检查查。本本法法依依据据种种子子上上真真菌菌菌菌落落的的整整个个形形象象，即即“吸吸水水纸纸鉴鉴别别特特征征”来来区区分分真真菌菌种种类类。检检查查时时应应特特别别注注意意观观察察种种子子上上菌菌丝丝体体的的颜颜色色、疏疏密密程程度度和和生生长长特特点点、真真菌繁殖结构的类型和特征菌繁殖结构的类型和特征第五章第五章 植物检验检疫技术植物检验检疫技术第一节第一节 常规检验检疫技术常规检验检疫技术二、实验室检验检疫技术二、实验室检验检疫技术9 9、保湿萌芽检验、保湿萌芽检验保湿培养检验保湿培养检验 冰冻吸水纸法冰冻吸水纸法是是前前一一个个的的改改进进版版，可可以以减减少少杂杂菌菌污污染染、抑抑制种子发芽制种子发芽第五章第五章 植物检验检疫技术植物检验检疫技术第一节第一节 常规检验检疫技术常规检验检疫技术二、实验室检验检疫技术二、实验室检验检疫技术9 9、保湿萌芽检验、保湿萌芽检验保湿培养检验保湿培养检验 琼脂平皿法琼脂平皿法用琼脂培养基代替了吸水纸用琼脂培养基代替了吸水纸第五章第五章 植物检验检疫技术植物检验检疫技术第一节第一节 常规检验检疫技术常规检验检疫技术二、实验室检验检疫技术二、实验室检验检疫技术9 9、保湿萌芽检验、保湿萌芽检验萌芽法检验萌芽法检验 沙土萌发检验沙土萌发检验 土内萌发检验土内萌发检验 试管幼苗症状测定试管幼苗症状测定第五章第五章 植物检验检疫技术植物检验检疫技术第一节第一节 常规检验检疫技术常规检验检疫技术二、实验室检验检疫技术二、实验室检验检疫技术1010、诱捕器诱集检验、诱捕器诱集检验信息素信息素诱饵诱饵第五章第五章 植物检验检疫技术植物检验检疫技术第一节第一节 常规检验检疫技术常规检验检疫技术二、实验室检验检疫技术二、实验室检验检疫技术1111、鉴别寄主检测、鉴别寄主检测应用于植物病毒的鉴定、诊断及检疫中应用于植物病毒的鉴定、诊断及检疫中第五章第五章 植物检验检疫技术植物检验检疫技术第一节第一节 常规检验检疫技术常规检验检疫技术二、实验室检验检疫技术二、实验室检验检疫技术1212、植物病原线虫的各种分离方法、植物病原线虫的各种分离方法漏漏斗斗分分离离法法：此此法法适适于于分分离离少少量量植植物物材材料料中中有有活活动动能能力力的的线线虫虫。基基本本装装置置是是一一个个直直径径适适当当的的漏漏斗斗，漏漏斗斗颈颈末末端端接接一一段段乳乳胶胶管管，用用弹弹簧簧夹夹把把管管子子夹夹住住。漏漏斗斗放放置置在在支支架架上上，其其内内盛盛满满清清水水。把把检检验验的的植植物物材材料料洗洗掉掉泥泥土土后后，切切成成0 05cm5cm长长的的小小段段，放放在在纱纱布布中中包包起起来来，轻轻轻轻地地浸浸入入漏漏斗斗内内。线线虫虫从从植植物物组组织织中中逸逸出出，经经纱纱布布沉沉落落到到漏漏斗斗颈颈底底，经经12h12h或或过过一一夜后，打开弹簧夹使胶管前端的水流到玻皿内，镜检线虫夜后，打开弹簧夹使胶管前端的水流到玻皿内，镜检线虫第五章第五章 植物检验检疫技术植物检验检疫技术第一节第一节 常规检验检疫技术常规检验检疫技术二、实验室检验检疫技术二、实验室检验检疫技术1212、植物病原线虫的各种分离方法、植物病原线虫的各种分离方法浅盘分离法：原理同漏斗法浅盘分离法：原理同漏斗法第五章第五章 植物检验检疫技术植物检验检疫技术第一节第一节 常规检验检疫技术常规检验检疫技术二、实验室检验检疫技术二、实验室检验检疫技术1212、植物病原线虫的各种分离方法、植物病原线虫的各种分离方法简简易易漂漂浮浮分分离离法法：本本法法利利用用干干燥燥的的线线虫虫胞胞囊囊能能漂漂浮浮在在水水面面的的特特性性分分离离土土壤壤中中的的马马铃铃薯薯金金线线虫虫( (GloboderarostochiensisGloboderarostochiensis) )和和各各种种胞囊线虫胞囊线虫( (HeteroderaHeterodera) )。第五章第五章 植物检验检疫技术植物检验检疫技术第一节第一节 常规检验检疫技术常规检验检疫技术二、实验室检验检疫技术二、实验室检验检疫技术1212、植物病原线虫的各种分离方法、植物病原线虫的各种分离方法过过筛筛分分离离法法：本本法法用用于于从从大大量量土土壤壤中中分分离离各各类类线线虫虫。将将充充分分混混匀匀的的土土壤壤样样品品置置于于不不锈锈钢钢盆盆或或塑塑料料盆盆中中，加加入入2323倍倍的的冷冷水水，搅搅拌拌土土壤壤并并振振碎碎土土块块后后过过2020目目筛筛，土土壤壤悬悬浮浮液液流流人人第第二二个个盆盆中中并并喷喷水水洗洗涤涤筛筛上上物物，弃弃去去第第一一个个盆盆中中和和筛筛上上的的剩剩余余物物，第第二二个个盆盆中中的的土土壤壤悬悬浮浮液液经经lminlmin沉沉淀淀后后再再按按上上法法过过150150目目筛筛，从从筛筛子子背背面面将将筛筛中中物物冲冲洗洗到到烧烧杯杯中中，盆盆中中土土壤壤悬悬浮浮液液再再继继续续过过325325目目和和500500目目筛筛。筛筛中中物物收收集集在在烧烧杯杯中中静静置置2030min2030min，线线虫虫沉沉集集底底部部，弃弃去去上上清清液液，将将沉沉集集物物转移到玻皿内镜检或吸取线虫鉴定。转移到玻皿内镜检或吸取线虫鉴定。 第五章第五章 植物检验检疫技术植物检验检疫技术第二节第二节 植物检验检疫新技术的应植物检验检疫新技术的应用用一、核酸杂交技术一、核酸杂交技术二、限制性片断长度多态性标记技术二、限制性片断长度多态性标记技术（RFLPRFLP）第五章第五章 植物检验检疫技术植物检验检疫技术第二节第二节 植物检验检疫新技术的应用植物检验检疫新技术的应用三、聚合酶链式反应（三、聚合酶链式反应（PCRPCR）1 1、免疫、免疫PCRPCR技术技术2 2、反转录、反转录PCRPCR检测技术检测技术3 3、巢式、巢式PCRPCR4 4、多重、多重PCRPCR5 5、实时荧光、实时荧光PCRPCR第五章第五章 植物检验检疫技术植物检验检疫技术第二节第二节 植物检验检疫新技术的应植物检验检疫新技术的应用用四、随机扩增多态性四、随机扩增多态性DNADNA技术（技术（RAPDRAPD）五、基因芯片检测技术五、基因芯片检测技术