实验四实验四 细菌质粒的接合转移细菌质粒的接合转移 李晓华李晓华 程国军程国军实验四_细菌质粒的接合转移一：目的要求一：目的要求了解在自然条件下微生物遗传信息传递的了解在自然条件下微生物遗传信息传递的方式；方式；掌握细菌质粒转移的原理和流程。掌握细菌质粒转移的原理和流程。 实验四_细菌质粒的接合转移二：基本原理二：基本原理在质粒转移过程中，供体菌与受体菌在质粒转移过程中，供体菌与受体菌细胞通过结合作用紧密接触，质粒从细胞通过结合作用紧密接触，质粒从供体细胞向受体转移，同时进行质粒供体细胞向受体转移，同时进行质粒复制，这就是结合转移的过程。按能复制，这就是结合转移的过程。按能否自主转移，将天然存在的质粒分为否自主转移，将天然存在的质粒分为两大类。两大类。 实验四_细菌质粒的接合转移实验四_细菌质粒的接合转移1转移型质粒转移型质粒：多为低拷贝的大质粒，含有完整：多为低拷贝的大质粒，含有完整的转移操纵子基因（的转移操纵子基因（tra）和转移起始位点。能在同）和转移起始位点。能在同种或亲缘关系近的菌体细胞间进行转移。例如：种或亲缘关系近的菌体细胞间进行转移。例如： 大肠杆菌：大肠杆菌：F因子、因子、R1、R100、R6K、RP4 天蓝色链霉菌：致育性因子天蓝色链霉菌：致育性因子pSCP1、pSCP22非转移型质粒非转移型质粒：多为高拷贝的小质粒，如大肠：多为高拷贝的小质粒，如大肠杆菌的杆菌的ColE1、RSF1010等。由于缺少转移基因等。由于缺少转移基因（tra），不能自主转移，但由于含有与），不能自主转移，但由于含有与F质粒类似质粒类似的的bom（或（或nic）位点或诱动基因）位点或诱动基因mob（mobilization），因而能被带有），因而能被带有tra基因的转基因的转移性质粒诱动而发生转移移性质粒诱动而发生转移。 实验四_细菌质粒的接合转移实验四_细菌质粒的接合转移实验四_细菌质粒的接合转移转移子的筛选转移子的筛选筛选培养基为：筛选培养基为：基本培养基基本培养基+抗生素抗生素； 供体和辅助大肠杆菌均营养缺陷型，不能供体和辅助大肠杆菌均营养缺陷型，不能在基本培养基上生长；在基本培养基上生长； 未转化成功的受体菌不能在有抗生素的平未转化成功的受体菌不能在有抗生素的平板上生长。板上生长。实验四_细菌质粒的接合转移三：实验菌株三：实验菌株供体菌：供体菌：E.coli DH5(pTR102) (TcR)，含有，含有 mob基因基因 ；受体菌受体菌: 紫云英根瘤菌紫云英根瘤菌 ( TcS) ；辅助菌辅助菌: E. coli MM294 (pPK2073)（SpeR），），含有含有tra基因。基因。 实验四_细菌质粒的接合转移四：实验内容四：实验内容 准备准备将受体、供体、辅助菌分别培养到对数期：将受体、供体、辅助菌分别培养到对数期： 供体菌：供体菌：E.coli DH5(pTR102) (TcR)，LB + Tc 20g /ml，37震荡培养震荡培养1夜；夜； 受体菌受体菌: Sinorhizobium fredii ( TcS)， TY, 28震荡培养震荡培养2天；天； 辅助菌辅助菌: E. coli MM294 (pPK2073)（SpeR），），LB + Spe 50 g/ml 37震荡培养震荡培养1夜夜实验四_细菌质粒的接合转移用可调定量移液器吸取供体、辅助菌各用可调定量移液器吸取供体、辅助菌各 0.4ml，吸受体菌吸受体菌0.6ml，都加入同一，都加入同一eppdorf管内（每个管内（每个同学做同学做1管），放入离心机内，管），放入离心机内，10000转转/min 离心离心1分钟。分钟。倒上清，向沉淀加倒上清，向沉淀加 1ml 的的 TY液体，用液体，用 tip上下抽上下抽吸，洗涤菌体，再吸，洗涤菌体，再10000转转/min离心离心1分钟，倒上分钟，倒上清，留清，留100l左右用于悬浮菌体。左右用于悬浮菌体。倒倒TY平板，然后用镊子取灭菌滤纸片贴于已准备平板，然后用镊子取灭菌滤纸片贴于已准备好的好的TY平板上（平板上（每每2个同学个同学1片，片，2-3片片/平板平板）。）。用用200l的的 tip 抽吸抽吸eppdorf管内沉淀的菌体，打管内沉淀的菌体，打散成浓菌液，将之加到滤纸片中央（切勿倾斜平散成浓菌液，将之加到滤纸片中央（切勿倾斜平板，以免菌液流出滤纸片以外）板，以免菌液流出滤纸片以外）,吹干。吹干。28培养培养2天。天。 操作步骤（第一天）操作步骤（第一天） 实验四_细菌质粒的接合转移倒倒SM平板平板将基本培养基（将基本培养基（SM）溶化，加千分之一的）溶化，加千分之一的维生素混合液，然后加相应量的四环素维生素混合液，然后加相应量的四环素（15U/ml），每），每2人人1皿。皿。另准备另准备1瓶基本培养基，不加抗生素，用于瓶基本培养基，不加抗生素，用于对照。对照。将倒好的平板用报纸包好后放入将倒好的平板用报纸包好后放入4冰箱，冰箱，备用。（备用。（注：四环素在强光下易分解注：四环素在强光下易分解）实验四_细菌质粒的接合转移向灭菌青霉素瓶中加向灭菌青霉素瓶中加3ml无菌水，将已培养无菌水，将已培养的的TY平板上的滤纸片用无菌镊子放入水中，平板上的滤纸片用无菌镊子放入水中，在震荡混匀器上洗菌体，充分打散在震荡混匀器上洗菌体，充分打散。向向1ml的的ep管加管加 0.9mL无菌水，取无菌水，取0.1ml菌菌液，混匀。液，混匀。 吸取吸取 200L涂皿。涂皿。少数同学另取稀释液，涂少数同学另取稀释液，涂1板不加板不加Tc的的SM做对照做对照 。 平板放平板放28 培养培养4-6天后看结果。天后看结果。操作步骤（第三天）操作步骤（第三天） 实验四_细菌质粒的接合转移五：实验报告内容五：实验报告内容转移频率转移频率=SM+Tc平板的单菌落数平板的单菌落数/纯纯SM平板平板的单菌落数的单菌落数 SM+Tc平板的单菌落数为：平板的单菌落数为：纯纯SM平板的单菌落数为：平板的单菌落数为：实验四_细菌质粒的接合转移六：思考题六：思考题你认为本次实验方法适合哪些方面的研究你认为本次实验方法适合哪些方面的研究工作？工作？实验四_细菌质粒的接合转移