实验十实验十 水中大肠菌群的水中大肠菌群的测定（综合性实验）测定（综合性实验）1一、目的要求一、目的要求n1 1学习测定水中大肠菌群数量的多管发学习测定水中大肠菌群数量的多管发酵法。酵法。n2 2了解大肠菌群的检测作为饮水卫生指了解大肠菌群的检测作为饮水卫生指标的重要性。标的重要性。2二、基本原理二、基本原理 多管发酵法包括初（步）发酵试验、平板分离和多管发酵法包括初（步）发酵试验、平板分离和复发酵试验三个部分。复发酵试验三个部分。n1 1初（步）发酵试验初（步）发酵试验 发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒倒置一德汉氏小套管置一德汉氏小套管。乳糖能起选择作用，因为很。乳糖能起选择作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群能发酵乳糖而多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群能发酵乳糖而产酸产气。为便于观察细菌的产酸情况，培养基产酸产气。为便于观察细菌的产酸情况，培养基内加有溴甲酚紫作为内加有溴甲酚紫作为pHpH指示剂，指示剂，细菌产酸后，培细菌产酸后，培养基即由原来的紫色变为黄色养基即由原来的紫色变为黄色。溴甲酚紫还有抑。溴甲酚紫还有抑制其他细菌如芽胞菌生长的作用。制其他细菌如芽胞菌生长的作用。3 水样接种于发酵管内，水样接种于发酵管内，3737下培养，下培养，2424小时小时内小套管中有气体形成，并且培养基混浊，颜色内小套管中有气体形成，并且培养基混浊，颜色改变，说明水中存在大肠菌群，为阳性结果，改变，说明水中存在大肠菌群，为阳性结果，但但也有个别其他类型的细菌在此条件下也可能产气；也有个别其他类型的细菌在此条件下也可能产气；此外产酸不产气的也不能完全说明是阴性结果。此外产酸不产气的也不能完全说明是阴性结果。在量少的情况下，也可能延迟到在量少的情况下，也可能延迟到4848小时后才产气，小时后才产气，此时应视为可疑结果，因此，以上两种结果均需此时应视为可疑结果，因此，以上两种结果均需继续做下面两部分实验，才能确定是否是大肠菌继续做下面两部分实验，才能确定是否是大肠菌群。群。4848小时后仍不产气的为阴性结果。小时后仍不产气的为阴性结果。4n2 2平板分离平板分离 平板培养基一般使用复红亚硫酸钠琼脂平板培养基一般使用复红亚硫酸钠琼脂（远藤氏培养基，（远藤氏培养基，EndoEndos mediums medium）或）或伊红美伊红美蓝琼脂蓝琼脂（eosin methylene blueagareosin methylene blueagar，EMB EMB agaragar），前者含有碱性复红染料，在此作为指），前者含有碱性复红染料，在此作为指示剂，它可被培养基中的亚硫酸钠脱色，使培示剂，它可被培养基中的亚硫酸钠脱色，使培养基呈淡粉红色，大肠菌群发酵乳糖后产生的养基呈淡粉红色，大肠菌群发酵乳糖后产生的酸和乙醛即和复红反应，形成深红色复合物，酸和乙醛即和复红反应，形成深红色复合物，使大肠菌群菌落变为带金属光泽的深红色。亚使大肠菌群菌落变为带金属光泽的深红色。亚硫酸钠还可抑制其他杂菌的生长。硫酸钠还可抑制其他杂菌的生长。5 伊红美蓝琼脂平板含有伊红与美蓝染料，在此亦伊红美蓝琼脂平板含有伊红与美蓝染料，在此亦作为指示剂，大肠菌群发酵乳糖造成酸性环境时，作为指示剂，大肠菌群发酵乳糖造成酸性环境时，该两种染料即结合成复合物，使大肠菌群产生与该两种染料即结合成复合物，使大肠菌群产生与远藤氏培养基上相似的、远藤氏培养基上相似的、带核心的、有金属光泽带核心的、有金属光泽的深紫色（龙胆紫的紫色）菌落的深紫色（龙胆紫的紫色）菌落。初发酵管初发酵管2424小小时内产酸产气和时内产酸产气和4848小时产酸产气的均需在以上平小时产酸产气的均需在以上平板上划线分离菌落。板上划线分离菌落。n3 3复发酵试验复发酵试验 以上大肠菌群阳性菌落，以上大肠菌群阳性菌落，经涂片染色为革兰经涂片染色为革兰氏阴性无芽胞杆菌者，通过此试验再进一步证实。氏阴性无芽胞杆菌者，通过此试验再进一步证实。原理与初发酵试验相同，原理与初发酵试验相同，经经2424小时培养产酸又产小时培养产酸又产气的，最后确定为大肠菌群阳性结果。气的，最后确定为大肠菌群阳性结果。6三、器材三、器材n1 1、培养基、培养基 乳糖蛋白胨发酵管（内有倒置小乳糖蛋白胨发酵管（内有倒置小套管），三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管（瓶）套管），三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管（瓶）（内有倒置小套管），伊红美蓝琼脂平板，（内有倒置小套管），伊红美蓝琼脂平板，灭菌水；灭菌水；n2 2、仪器或其他用具、仪器或其他用具 载玻片，灭菌带玻璃塞载玻片，灭菌带玻璃塞空瓶，灭菌吸管，灭菌试管等。空瓶，灭菌吸管，灭菌试管等。7四、操作步骤四、操作步骤n1 1水样的采取水样的采取 1)1)自来水自来水 先将自来水龙头用火焰烧灼先将自来水龙头用火焰烧灼3min3min灭菌，灭菌，再开放水龙头使水流再开放水龙头使水流5min5min后，以灭菌三角烧瓶接后，以灭菌三角烧瓶接取水样，以待分析。取水样，以待分析。 2 2）池水、河水或湖水）池水、河水或湖水 应取距水面应取距水面101015cm15cm的的深层水样，先将灭菌的带玻璃塞瓶，瓶口向下浸深层水样，先将灭菌的带玻璃塞瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流入入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出。最瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出。最好立即检查，否则需放入冰箱充分冷却。好立即检查，否则需放入冰箱充分冷却。8n2 2自来水检查自来水检查（1 1）初（步）发酵试验在）初（步）发酵试验在2 2个含有个含有50ml50ml三倍三倍浓缩的乳糖蛋白胨发酵烧瓶中，各加入浓缩的乳糖蛋白胨发酵烧瓶中，各加入100ml100ml水样。在水样。在1010支含有支含有5ml5ml三倍浓缩乳糖蛋白胨发三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管中，各加入酵管中，各加入10ml10ml水样（如图水样（如图-1-1）。混）。混匀后，匀后，3737培养培养2424小时，小时，2424小时未产气的继续小时未产气的继续培养至培养至4848小时。小时。（2 2）平板分离经）平板分离经2424小时培养后，将产酸产小时培养后，将产酸产气及气及4848小时产酸产气的发酵管（瓶），分别划小时产酸产气的发酵管（瓶），分别划线接种于伊红美蓝琼脂平板上，再于线接种于伊红美蓝琼脂平板上，再于3737下培下培养养 18182424小时，将符合下列特征的菌落的一小时，将符合下列特征的菌落的一小部分，进行涂片，革兰氏染色，镜检。小部分，进行涂片，革兰氏染色，镜检。9 （a a）深紫黑色、有金属光泽。）深紫黑色、有金属光泽。（b b）紫黑色、不带或略带金属光泽。）紫黑色、不带或略带金属光泽。（c c）淡紫红色、中心颜色较深。）淡紫红色、中心颜色较深。 （3 3）复发酵试验经涂片、染色、镜检，如为革兰）复发酵试验经涂片、染色、镜检，如为革兰氏阴性无芽孢杆菌，则挑取该菌落的另一部分，氏阴性无芽孢杆菌，则挑取该菌落的另一部分，重新接种于普通浓度的乳糖蛋白胨发酵管中，每重新接种于普通浓度的乳糖蛋白胨发酵管中，每管可接种来自同一初发酵管的同类型菌落管可接种来自同一初发酵管的同类型菌落1 13 3个，个， 3737培养培养2424小时，结果若产酸又产气，即证实有小时，结果若产酸又产气，即证实有大肠菌群存在。大肠菌群存在。 证实有大肠菌群存在后，再根据初发酵试验证实有大肠菌群存在后，再根据初发酵试验的阳性管（瓶）数查表的阳性管（瓶）数查表-2-2，即得大肠菌群数。，即得大肠菌群数。1011n3 3池水、河水或湖水等的检查池水、河水或湖水等的检查（1 1）将水样稀释成）将水样稀释成1010-1-1与与1010-2-2。（2 2）分别吸取）分别吸取1ml101ml10-2-2、1010-1-1的稀释水的稀释水样和样和1ml1ml原水样，各装入有原水样，各装入有10ml10ml普通浓普通浓度乳糖蛋白胨发酵管中。另取度乳糖蛋白胨发酵管中。另取10ml10ml和和100ml100ml原水样，分别注入装有原水样，分别注入装有 5 ml5 ml和和50ml50ml三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵液的试管三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵液的试管（瓶）中。（瓶）中。12 （3 3）以下步骤同上述自来水的平板分离）以下步骤同上述自来水的平板分离和复发酵试验。和复发酵试验。（4 4）将）将100100、1010、1 1、0.10.1（1010-1-1）mlml水样水样的发酵管结果查表的发酵管结果查表-3-3，将，将1010、1 1、0.10.1（1010-1-1）、）、0.010.01（1010-2-2）mlml水样的发酵管水样的发酵管结果查表结果查表-4-4，即得每升水样中的大肠，即得每升水样中的大肠菌群数。菌群数。13141516初发酵前17初发酵后阳性管-产酸、产气结果18EMB平板分离典型结果1-绿色金属光泽菌落19EMB平板分离典型结果2-黑紫色不带或略带金属光泽菌落20EMB平板分离典型结果3-淡紫红色中心颜色较深菌落21复发酵实验结果-产酸、产气22五、实验报告五、实验报告（1 1）自来水）自来水100ml100ml水样的阳性管数是多少？水样的阳性管数是多少？10ml10ml水样的阳性管数是多少？水样的阳性管数是多少？查表查表-2-2得每升水样中大肠菌群数是多少？得每升水样中大肠菌群数是多少？（2 2）池水、河水或湖水）池水、河水或湖水 阳性结果记阳性结果记“+ +”；阴性结果记；阴性结果记“- -”。 查表查表-3-3得每升水样中大肠菌群数是多少？得每升水样中大肠菌群数是多少？ 查表查表-4-4得每升水样中大肠菌群数是多少？得每升水样中大肠菌群数是多少？2324六、思考题六、思考题（1 1）大肠菌群的定义是什么？）大肠菌群的定义是什么？（2 2）为什么要选择大肠菌群作为水源被肠）为什么要选择大肠菌群作为水源被肠道病原菌污染的指示菌？道病原菌污染的指示菌？（3 3）EMBEMB培养基含有哪几种主要成分？在培养基含有哪几种主要成分？在检查大肠菌群时，各起什么作用？检查大肠菌群时，各起什么作用？（4 4）经检查，水样是否合乎饮用标准？）经检查，水样是否合乎饮用标准？25