分子生物学目录第一章绪论 2 第二章核酸的结构及性质4 第三章 DNA复制 4 第四章 DNA损伤与修复2 第五章可转移的遗传因子2 第六章 RNA的转录与加工5 第七章蛋白质的生物合成5 第八章分子生物学技术8 第九章原核基因表达调控4 第十章真核基因表达调控4 第一章绪论DNA Double Helix model:1953 Watson & Crick 基因的基本属性: 1. 基因的自我复制2. 基因控制性状的表达3. 基因的突变以DNA, protein为核心以生物化学为基础Crick ： . 我本人的思想是基于两个基本原理，我称之为序列假说和中心法则序列假说：核酸片段的特异性完全由其碱基序列所决定，而且这种序列是某一蛋白质的氨基酸序列的密码。中心法则：信息一旦进入蛋白质，它就不可能再输出分子生 物学的三大原则1. 构成生物大分子的单体是相同的( 共同的核酸语言、共同的蛋白质语言) 2. 生物遗传信息的表达的中心法则相同3. 生物遗传信息的表达的中心法则相同个性高级结构生物大分子之间的互作农业是现代生物学研究与应用最为广阔，重要的领域第二章核酸与染色体的结构和性质2.1 DNA 是遗传物质?2.1.1 转化实验?2.1.1.1 Griffith的发现2.1.1.2 Avery等人的实验精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 1 页，共 32 页?2.1.2 化学实验2.2 DNA 的结构2.2.1 DNA的一级结构?定义： DNA 的一级结构指的是DNA分子内碱基的排列顺序。2.2.2 DNA一级结构的方向性? DNA链的方向总是理解为从5 P端 到 3-OH 端。? DNA分子总是由脱氧核糖核苷酸组成，核糖的2 位总是 H。? RNA分子的核糖的2 位总是 OH基。DNA一级结构的多样性? 编码蛋白质的遗传信息的多样性? 用于调控的序列具有多样性? 两种不同遗传信息的比较相同点：都不是简单地以其一级结构发挥作用，而依赖于与Pro 的相互作用。不同点：编码蛋白质氨基酸组成的信息强烈依赖酶系或蛋白质结构来进行基因表达，而调控序列不仅依靠蛋白质作用而且利用自身的双螺旋空间结构的改变来负责基因活性的选择性表达。2.2.3 DNA的二级结构 3.2.3.1 定义： DNA的二级结构指的是由两条DNA链反向平行盘绕所形成的双螺旋结构。 1每一单链具有5 3极性2 两条单链间以氢键连接3 两条单链，极性相反，反向平行4 以中心为轴，向右盘旋 (B-form)5 双螺旋中存在大沟 (2.2nm)，小沟 (1.2nm 2.2.3.2 理化特性及维持二级结构稳定的力 主链 碱基对 大沟和小沟 螺距2.2.3.3 DNA二级结构的基本特点? DNA 分子是由两条反向平行的脱氧核苷酸长链盘绕而成的。? DNA 分子中的脱氧核糖和磷酸交替连接，排在外侧，构成基本骨架；碱基排列在内侧。? 两条链上的碱基通过氢键结合，形成碱基对。A总是与 T 配对， G总是与 C配对。2.2.3.4 DNA二级结构的不均一性? DNA 上的回文序列（inverted repeats）? DNA 上的富含AT 序列? 嘌呤、嘧啶的排列顺序对双螺旋稳定性影响2.2.3.5 DNA二级结构的多样性?通常情况下，DNA的二级结构分为两大类：一类是右手螺旋的，如BDNA 、ADNA 、C-DNA等；另一类是局部的左手螺旋，如Z DNA 。?天然状态下的DNA大多为 B-DNA 。?1953 年， Watson 和 Crick 首次提出了DNA的反向平行双螺旋模型，该模型所描述的就是BDNA 。其他 DNA螺旋结构精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 2 页，共 32 页三螺旋 DNA 四螺旋 DNA 2.2.4 DNA的变性和复性?2.2.4.1 呼吸作用双链 DNA中配对碱基的氢键总是处于不停的断裂和再生状态之中，特别是稳定性较低的富含A-T 的区段， 氢键的断裂和再生更为明显。在微观上常常表现为瞬间的泡状结构，这种现象称为DNA的呼吸作用。?2.2.4.2甲醛试验把标准 DNA放到含有甲醛的溶液当中，发现随时间推移，吸光性出现变化（增加） ，表示 DNA由双链变成了单链。这是因为DNA上的 NH2在甲醛作用下发生了缩醛反应，使DNA双链不可逆地解开，这个过程又称为甲醛的变性作用。?定义：双螺旋DNA溶解成单链的现象称为DNA变性。DNA分子变性 ( DNA denaturation ) D.S. DNA S.S. DNA 加温 , 极端 pH, 尿素 , 酰胺变性过程的表现 DNA粘度降低 DNA 沉降速度加快 DNA分子的 A 260 nm UV 值上升核酸在 260nm具有强烈的吸收峰，结构越有序，吸收的光越少。游离核苷酸比单链的RNA或 DNA吸收更多的光，而单链 RNA或 DNA的吸收又比双链DNA分子强。2.2.4.3 增色效应、减色效应和Tm值单链和双链DNA的 A260吸收值不同。以50g/mlDNA 溶液测量，分别为：双链 DNA A260=1.00单链 DNA A260=1.37双链 DNA缓慢加热，其溶液对紫外光的吸收值增加，叫增色效应，而单链DNA缓慢降温，其对紫外光的吸收值减少，叫减色效应。根据 DNA的变性作用， 以 260nm紫外光吸收值与温度变化作图，可得到一条S形曲线， 在相当狭的一个范围内，增色效应出现一个跳跃。通常以紫外吸收值达到最大值的一半时的温度也就是DNA的碱基有50% 发生变性时的温度称为融点Tm(melting temperature,Tm)2.2.4.5复性变性后的DNA用某种方法处理后，使之重新形成天然DNA的过程叫做复性或退火。复性是一个比较慢的过程。? 1A 1B 1C 1D?.ATGA.ATGA.CCCC.ATGA.?.TACT.TACT.GGGG.TACT.? 1A 1B 1C 1D2.2.5 DNA的高级结构超螺旋与拓扑异构现象负超螺旋 - 拓扑异构酶 / 溴乙锭 - 松弛 DNA-拓扑异构酶 / 溴乙锭 - 正超螺旋DNA超螺旋结构?超螺旋精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 3 页，共 32 页超螺旋，简单地说就是螺旋的螺旋，或者我们假定双螺旋存在一个中心轴，这条中心轴再形成螺旋。超螺旋的形成不是一个随机过程，而是在 DNA 双螺旋存在一种结构张力时才会形成。由于 DNA 双螺旋的盘绕过度或不足，使 DNA分子处于一种张力状态。在封闭环状DNA分子中这种张力不能释放出来，就会形成超螺旋。正、负超螺旋?正超螺旋中心轴的盘绕同双螺旋两条链盘绕的方向相同，也就是同解链方向相反。正超螺旋使螺旋更加紧密，所以把正超螺旋叫过分盘绕DNA 。?负超螺旋负超螺旋能让DNA分子通过调整双螺旋本身的结构来减少这种张力，一般是以减少每个碱基对旋转，即放松两股链彼此的盘绕，所以把具有负超螺旋的DNA叫盘绕不足DNA 。超螺旋的生物学意义?超螺旋可能有两方面的生物学意义：1 超螺旋 DNA比松弛型DNA更紧密，使DNA分子体积变得更小，得以包装在细胞内；2 超螺旋能影响双螺旋的解链程度，因而影响DNA分子与其他分子，如酶、蛋白质分子的相互作用。DNA拓扑异构体具有完全相同顺序，而链环数值不同的DNA ，称为拓扑异构体。在封闭环状DNA 分子中链环数值的改变，即拓扑异构体之间的互变，只有在一条链或两条链有了缺口时才能发生，通常要有酶来催化，此种酶叫拓扑异构酶。I 型异构酶能在一股链上产生一个缺口，而II 型异构酶能在两股链上产生缺口。2.3 染色体2.3.1 染色体概述染色体的结构要素1 着丝粒（ centromere ） ：细胞分裂时染色体与纺锤丝相连结的部位，为染色体的正常分离所必需。在着丝粒附近有高度重复的卫星DNA （长约510 bp 、方向相同的高度重复序列），它们不能与组蛋白结合，形成常染色质区域。2 端粒 (telomere)：真核生物线状染色体分子末端的DNA 区域。端粒 DNA的特点与功能：?有许多短的正向重复序列。?端粒的末端都有一条12-16 碱基的单链3端突出。?端粒 DNA末端不能被外切核酸酶和单链特异性的内切核酸酶识别。?端粒的功能：防止DNA末端降解，保证染色体的稳定性和功能原核：简单，没有核膜包围形成真正的细胞核，核酸分子常裸露存在整个细胞中，与少量蛋白质结合，这些蛋白质有些与DNA的折叠有关，另外的参与DNA复制、重组和转录过程。真核：染色体位于细胞核的核仁内， DNA 与 Pro（组与非组蛋白）完全融合，Pro/DNA 的质量比2/1 。原核与真核染色体DNA比较?原核生物中一般只有一条染色体且大都带有单拷贝基因，只有很少数基因如rRNA基因是以多拷贝形式存在；?整个染色体DNA几乎全部由功能基因与调控序列所组成；?几乎每个基因序列都与它所编码的蛋白质序列呈线性对应状态。2.3.2 真核生物的染色体?真核生物的染色体在细胞生活周期的大部分时间里都以染色质的形式存在。染色质是一种纤维状结构，称为染色质丝。它是由最基本的单位- 核小体串联而成的。这里有一系列的结构等级：DNA和组蛋白构成核小体，核小体再绕成一个中空的螺线管成为染色质丝，染色质丝再与许多非组蛋白结合进一步螺旋化形成染色体。?组成： DNA 和蛋白质。?特征：体细胞是二倍体，性细胞是单倍体。结构相对稳定。能够自我复制。能够指导蛋白质的合成。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 4 页，共 32 页能够产生可遗传的变异。2.3.2.1 蛋白质?染色体上的蛋白质主要包括组蛋白和非组蛋白。?组蛋白是染色体的结构蛋白，它与DNA组成核小体。?真核生物的染色体一般有5 种主要的组蛋白，分别命名为：H1、H2A 、H2B 、H3和 H4 。?在 5 种组蛋白中， H1富含赖氨酸，H3 、H4富含精氨酸。?鸟类、鱼类和两栖类的红细胞染色体不含H1而代之以H5 。?在某些物种的精子中，染色体的结构蛋白是鱼精蛋白。?非组蛋白主要包括与复制和转录有关的酶类、与细胞分裂有关的蛋白等。2.3.2.2 核小体的装配?核小体：指的是168bp 长度的 DNA与一组组蛋白构成的致密结构，是构成真核生物染色质的基本单位。?装配过程：两分子的H3和两分子的H4先形成四聚体，然后由H2A和 H2B形成的异二聚体在该四聚体的两侧分别结合而形成八聚体。长146bp 的 DNA按左手螺旋盘绕在八聚体上1.8 周，形成核小体的核心颗粒。核心颗粒两端的DNA各有 11bp 与 H1结合，形成完整的核小体。2.3.3 真核生物的基因组?基因：是指表达一种蛋白质或功能RNA的遗传物质的基本单位。?基因组 genome 原核：就是它的整个染色体。真核：一个物种单倍体染色体数目。2.3.3.1 C值矛盾?C值：单倍体基因组中的DNA含量。?不同物种的C值有很大差异：C值矛盾 c-value paradox（定义）：?在结构和功能相似的物种中，甚至在亲缘关系相近的物种中，C值差异大。?在不同进化阶元中，某些低等生物的C值比高等生物的C值还大。2.3.3.2 真核生物基因组不同拷贝的序列组分单一拷贝的非重复序列在基因组中只存在一个拷贝。轻度重复序列在基因组中只有2-10 个拷贝，主要是组蛋白和tRNA 等基因。中度重复序列这类序列的重复次数在数十到数百次之间。高度重复序列有几百到几百万个拷贝。卫星 DNA 把基因组DNA切成数千个bp 的片段，进行氯化铯密度梯度离心。对一个物种来说，其浮力密度曲线是一条覆盖一定浮力密度范围的一条宽带，但是有些DNA片段却含有异常高或低的G+C含量，常会在主DNA带的附近出现几条次带，其浮力密度曲线出现在主带的前面或后面。G+C含量的变化， 使它们与大多数DNA具有不同的浮力密度，浮力密度略重或略轻的DNA即是所谓的卫星DNA 。卫星 DNA是一种高度重复序列。2.3.3.3真核生物基因组的结构特点基因组分子量较大。真核生物DNA常和组蛋白结合形成染色体。DNA集中在细胞核区，转录在核内，翻译在细胞质中。真核生物基因组多形成断裂基因。真核生物DNA序列中有很多重复序列和不编码序列。真核生物的编码基因常以单拷贝存在，无操纵子形式。2.3.4 原核生物的基因组3.3.4.1 原核生物基因组的特点DNA是裸露的， 不形成染色体。能够最经济地利用DNA序列，除控制区域外， 很少有不编码的DNA序列。 原核生物把功能相关的一系列基因高度集中在一起，形成一个操纵子。基因组中几乎没有重复序列。原核生物由于没有细胞核，转录和翻译是同步进行的。2.3.4.2 几种原核生物的基因组x174 5386bp 11 个基因 3 个操纵子?5.GAAGGAGUGAUGUAAUGUCUAAAG.3 x174 的 mRNA 的一段序列?5.GAAGGAGUGAUGUAA.3 基因 DmRNA 的 3 端序列?5.AUGUCUAAA. 基因 JmRNA 的 3 端序列精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 5 页，共 32 页?5.GAAGGAGUGA.3 基因 EmRNA 的 3 端序列E.Coli 4.6*106bp 噬菌体 48502bp 基因与基因概念的发展基因是生物体遗传信息的基本单位，其本质是DNA （有的生物基因组是RNA ） ，简单的说，基因是合成一种功能蛋白或 RNA分子所必须的全部DNA （RNA ）序列。原核生物和真核生物的基因有较大的不同，一个典型的真核基因包括：编码序列外显子；插入外显子之间的非编码序列内合子；5- 端和 3- 端非翻译区 (UTR)；调控序列（可位于上述三种序列中）。原核生物与真核生物的基因比较：1. 真核生物除配子外，染色体成对，所以同源DNA分子两个；原核生物只有一个DNA （RNA ）分子；2. 真核生物基因转录为单顺反子；原核生物基因具有操纵子结构，转录为多顺反子；3. 真核生物DNA重复顺序较多；原核一般不具重复序列；4. 真核生物基因非编码区部分大于编码区部分，无基因重叠现象；原核生物基因编码区部分大于非编码区部分，基因有重叠现象；5. 真核生物有内含子（不连续基因或者断裂基因）；原核生物一般无；6. 真核生物DNA复制多起点；原核生物DNA复制单起点。基因概念的发展1 移动基因（跳跃基因）2 断裂基因3 假基因是一种核苷酸序列同其相应的正常功能基因基本相同，但却不能表达或者表达异常，不能产生有功能的基因产物的失活基因。 4 重叠基因2.4RNA 核酸是生物体内重要的高分子化合物，它储存着生物体全部遗传信息。除DNA外，在生物体内还存在着另一种核酸 RNA 。 RNA有许多种类，它们具有不同的生物功能。2.4.1 RNA分子的结构特点RNA通常是单链RNA分子核苷酸中的糖是核糖而不是脱氧核糖4 种碱基中没有胸腺嘧碇，而有尿嘧啶2.4.2 RNA的种类细胞含量最多的几类RNA分子主要的生物功能是参与蛋白质的生物合成。第一类 RNA分子叫做信使RNA （mRNA ）它的生物学功能是从DNA上把遗传密码即蛋白质中氨基酸排列顺序的信息接受过来，并起模板作用来合成蛋白质。一般来讲，一种蛋白质就有一种与之相对应的mRNA 分子，但有的mRNA分子可以翻译出几条蛋白质分子。mRNA 在代谢上是不稳定的。第二类是转运RNA （tRNA） 。生物体内存在着与20 种氨基酸对应的tRNA分子。它们在代谢上也是稳定的，在蛋白质的生物合成过程中起接受、转运和掺入氨基酸的作用。第三类是核糖体RNA （rRNA） 。原核生物有三种rRNA （5srRNA16srRNA23srRNA ）, 真核生物有4 种（5s,5.8s,18s和 28srRNA） 。这些 RNA分子在代谢上十分稳定，是生物体内蛋白质合成的“机器”核糖体的重要成分。上述三类RNA都存在于细胞质中，它们行使生物学功能的主要场所在核糖体上。在真核生物的线粒体和叶绿体里存在着独立的蛋白质合成系统，也有这几类RNA分子，但是其大小和结构和细胞质中的不完全相同。此外生物体内还存在着多种具有特定生物功能的RNA分子，例如，参与起动DNA复制的引物RNA ，在某些肿瘤病毒中存在着一些类似tRNA的分子是逆转录酶的引物，参与DNA的合成。在某些细菌中有的tRNA 分子在细胞壁合成时是甘氨酸的载体。还有一些RNA分子是一些酶活性不可缺少的组成成分，例如兔肌1，4-2- 匍聚糖分枝酶含有 31 个核苷酸的2.8sRNA 分子， 特异性地作用于tRNA 前体的 RNAaseP中有 77% 的成份是核糖核酸酶。真核细胞的核内还存在着许多小分子RNA（ snRNA ） , 其大小从4S到 8S不等，大约由 80260 个核苷酸构成其中有些snRNA在 RNA成熟过程式中起重要作用。另外，还有一些染色质结合的RNA （chRNA ）其生物学功能尚不清。2.4.3前体 RNA 绝大多数RNA分子都是在细胞核内合成的。核内存在着各种RNA的前体，例如tRNA前体、 rRNA前体和 mRNA 。这些前体RNA的分子量要比对应成熟的RNA的大得多。例如哺乳动物肝细胞的rRNA 的前体是45s 细胞核RNA（nRNA ） ，在成熟过程中产生41snRNA ，32snRNA和 20snRNA等中间物，最后相应地成为28s、5.8s 和 18sRNA 。前体 RNA都是由细胞核DNA转录产生的，经过剪切、装配和修饰成为成熟的tRNA、rRNA和 mRNA ，进入细胞质各精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 6 页，共 32 页自行使其生物功能有人把在细胸核内合成后离开细胞核去行使生物功能的RNA分子称作迁移性RNA （Migrating RNA）,而把始终存在于细胞核内的称作非迁移性RNA （Nonmigrating RNA ） 。第三章 DNA 的复制定义：亲代双链DNA分子在 DNA聚合酶的作用下，分别以每单链 DNA 分子为模板，聚合与自身碱基可以互补配对的游离的dNTP, 合成出两条与亲代DNA分子完全相同的子代DNA分子的过程。3.1 DNA 复制的基本机理 DNA 由两条螺旋的多核苷酸链组成，两条链的碱基通过A:T 和 G:C 之间的氢键联结在一起。在复制过程中首先两条链间的氢键破裂并使双链解旋和分开，然后以每条链为模板，按碱基互补配对原则(A:T ，G:C)，由 DNA聚合酶催化合成新的互补链，结果由一条链成为互补的两条链，这样新形成的两个DNA分子与原来的DNA分子的碱基序列完全相同。在此过程中，每个子代DNA的一条链来自亲代DNA ，另一条链则是新合成的。这种复制方式称此过程中，每个子代DNA的一条链来自亲代的DNA ，另一条链则是新合成的。这种复制方式称为半保留复制(semi conservative replication)。1958 年 Meselson 和 Stahl的实验首次有力地支持了半保留复制方式。他们先将大肠杆菌放在15NH4C1培养基中生长 15 代，使几乎所有的DNA都被 15N标记后，再将细菌移到只含有14NH4C1的培养基中培养。随后，在不同的时间取出样品，用十二烷硫酸钠(SDS)裂解细胞后，将裂解液放在CsC1 溶液中进行密度梯度离心(140000g ，20小时 ) 。离心结束后，从管底到管口，溶液密度分布从高到低形成密度梯度。DNA分子就停留在与其相当的CsC1密度处，在紫外光下可以看到形成的区带。14N-DNA 分子密度较轻(1.7g/cm3)，停留在离管口这较近的位置;15N-DNA 密度较大停留在较低的位置上。当含有15N-DNA的细胞在14NH4C1培养液中培养一代后，只有一条区带介于14N-DNA与 15N-DNA之间，这时在15N-DNA区已没有吸收带，说明这时的DNA一条链来自15N-DNA ，另一条链为新合成的含有14N的新链。培养两代后则在14N-DNA区又出现一条带。在14NH4C1中培养的时间愈久，14N-DNA区带愈强，而14N-15NDNA区带逐渐减弱，但始终未出现其他新的区带。按照半保留复制方式培养两代，只能出现14N-15NDNA两种分子，而且随着代数的增加14N-DNA逐渐增加。 Meselson 和 Stahl的实验完全证实了保留复制的设想。复制起点和复制子DNA复制在生物细胞中要从DNA 分子上特定位置开始。 这个特定的位置就称为复制起点(Origin of replication)，用ori表示。 DNA复制从起点开始双向进行直到终点为止，每一个这样的DNA 单位称为复制子或复制单元(replicon)。在原核生物中，每个DNA分子上通常只有一个复制子而在真核生物中，每个DNA分子有许多个复制子，每个复制子长约50-200kb 。因此，真核细胞DNA的复制是由许多个复制子共同完成的既然 DNA复制不是随机的从DNA分子上的任何一点起始，而是从特定的区域开始，这说明复制起点有其结构上的特殊性。如科学家们利用分子克隆技术，分离出大肠杆菌染色体DNA复制起点oriC ，发现其含有3 个 13bp 的串联重复保守序列和4 个 9bp 的保守序列DNA复制的特点DNA复制的最主要特点是半保留复制另外，它还是半不连续复制半不连续复制DNA双螺旋的两条链是反向平行的，因此，在复制起点处两条DNA链解开成单链时，一条是5 3 方向，另一条是 3 5 方向。以这两条链为模板时，新生链延伸方向一条为3 5 ，另一条为5 3 。但生物细胞内所有催化 DNA聚合酶都只能催化5 3 延伸，这是一个矛盾。冈崎片段(Okaxaki fragments)的发现使这个矛盾得以解决。在复制起点两条链解开形成复制泡(replication bubbles)， DNA向两侧复制形成两个复制叉(replication forks)。以复制叉移动的方向为基准，一条模板链是3 5 ，以此为模板而进行的新生DNA链的合成沿5 3精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 7 页，共 32 页方向连续进行，这条链称为前导链(leading strand)。另一条模板链的方向为5 3 ，以此为模板的DNA合成也是沿 5 3 方向进行， 但与复制叉前进的方向相反，而且是分段， 不连续合成的， 这条链称为滞后链(lagging strand)，合成的片段即为冈崎片段。这些冈崎片段以后由DNA连接酶连成完整的DNA链。这种前导链的连续复制和滞后链的不连续复制在生物是普遍存在的，称为DNA合成的半不连续复制。?复制的多模式1 单起点、单方向 2多起点、单方向 3单起点、双方向 4多起点、双方向3.2 DNA 复制的过程DNA复制过程大致可以分为复制的引发，DNA链的延伸和DNA复制的终止三个阶段。( 一)DNA复制的引发复制的引发 (Priming)阶段包括DNA复制起点双链解开，通过转录激活步骤合成RNA分子 RNA引物的合成， DNA聚合酶将第一个脱氧核苷酸加到引物RNA的 3-OH末端。复制引发的关键步骤就是前导链DNA的合成，一旦前导链 DNA的聚合作用开始，滞后链上的DNA合成也随着开始，在所有前导链开始聚合之前有一必需的步骤就是由RNA聚合酶 ( 不是引物酶 ) 沿滞后链模板转录一短的RNA分子在有些 DNA复制中， ( 如质粒 ColE) ，该 RNA分子经过加工成为DNA复制的引物。但是，在大部分DNA复制中，该 RNA分子没有引物作用。它的作用似乎只是分开两条DNA链，暴露出某些特定序列以便引发体与之结合，在前导链模板DNA上开始合成RNA引物，这个过程称为转录激活(transcriptional activation)，在前导链的复制引发过程中还需要其他一些蛋白质，如大肠杆菌的dnaA 蛋白。这种蛋白质可以和复制起点处DNA上高度保守的4个 9bp 长的序列结合， 其具体功能尚不清楚。可能是这些蛋白质与DNA复制起点结合后能促进DNA聚合酶复合体的七种蛋白质在复制起点处装配成有功能的全酶DNA复制开始时， DNA螺旋酶首先在复制起点处将双链DNA解开，通过转录激活合成的RNA分子也起分离两条DNA链的作用，然后单链DNA结合蛋白（ SSB蛋白 )结合在被解开的链上。由复制因子X(n 蛋白 ) ，复制因子Y(n 蛋白 ) ，n 蛋白， i 蛋白， dnaB蛋白和 dnaC蛋白等 6 种蛋白质组成的引发前体 (preprimosome)，在单链DNA结合蛋白的作用下与单链DNA结合生成中间物，这是一种前引发过程。引发前体进一步与引物酶(primase)or引发酶组装成引发体(primosome) 。 引发体可以在单链DNA上移动，在 dnaB亚基的作用下识别DNA复制起点位置。 首先在前导链上由引物酶催化合成一段RNA引物， 然后， 引发体在滞后链上沿5 3 方向不停的移动(这是一种相对移动，也可能是滞后链模板在移动，见后) ，在一定距离上反复合成RNA引物供 DNA聚合酶合成冈崎片段使用，引发体中许多蛋白因子的功能尚不清楚。但是， 这些成份必须协同工作才能使引发体在滞后链上移动，识别合适的引物合成位置，并将核苷酸在引发位置上聚合成RNA引物由于引发体在滞后链模板上的移动方向与其合成引物的方向相反，所以在滞后链上所合成的RNA引物非常短， 一般只有 3-5 个核苷酸长。 而且， 在同一种生物体细胞中这些引物都具有相似的序列，表明引物酶要在DNA滞后链模板上比较特定的位置( 序列 ) 上才能合成RNA引物。为什么需要有RNA引物来引发DNA复制呢 ?这可能尽量减少DNA复制起始处的突变有关。DNA复制开始处的几个核苷酸最容易出现差错，因此， 用 RNA引物即使出现差错最后也要被DNA 聚合酶切除，提高了 DNA复制的准确性。 RNA引物形成后， 由 DNA聚合酶催化将第一个脱氧核苷酸按碱基互补原则加在RNA引物 3-OH 端而进入DNA链的延伸阶段。( 二)DNA链的延伸DNA新生链的合成由DNA聚合酶所催化，然而，DNA必须由螺旋酶在复制叉处边移动边解开双链。这样就产生了一种拓扑学上的问题: 由于 DNA的解链，在DNA双链区势必产生正超螺旋，在环状DNA中更为明显，当达到一定程度后就会造成复制叉难再继续前进，从而终止DNA复制。但是，在细胞内DNA复制不会因出现拓扑学问题而停止。有两种机制可以防止这种现象发生: 1DNA在生物细胞中本身就是超螺旋，当DNA解链而产生正超螺旋时，可以被原来存在的负超螺旋所中和; 2DNA拓扑异构酶要以打开一条链，使正超螺旋状态转变成松弛状态，而 DNA拓扑异构酶 ( 旋转酶 ) 可以在 DNA解链前方不停地继续将负超螺旋引入双链DNA 。这两种机制保证了无论是环状DNA还是开环DNA的复制顺利的解链，再由DNA聚合酶合成新的DNA链。前已述及DNA生长链的延伸主要由DNA聚合酶催化，该酶是由 7 种蛋白质 ( 多肽 ) 组成的聚合体， 称为全酶。 全酶中所有亚基对完成DNA复制都是必需的。亚基具有聚合功能和5 3 外切酶活性， 亚基具有3 5 外切精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 8 页，共 32 页酶活性。另外，全酶中还有ATP分子它是DNA聚合酶催化第一个脱氧核糖核苷酸连接在RNA引物上所必需的，其他亚基的功能尚不清楚。在 DNA复制叉处要能由两套DNA聚合酶在同一时间分别进行DNA前导链和滞后链复制。如果滞后链模板环绕DNA聚合酶全酶，并通过DNA聚合酶，然后再折向与未解链的双链DNA在同一方向上，则滞后链的合成可以和前导链的合成在同一方向上进行。这样，当 DNA聚合酶沿着滞后链模板移动时，由特异的引物酶催化合成的RNA引物即可以由DNA聚合酶所延伸。当合成的 DNA链到达前一次合成的冈崎片段的位置时，滞后链模板及刚合成的冈崎片断便从DNA聚合酶上释放出来。这时，由于复制叉继续向前运动，便产生了又一段单链的滞后链模板，它重新环绕DNA聚合酶全酶，并通过DNA聚合酶开始合成新的滞后链冈崎片段。通过这样的机制，前导链的合成不会超过滞后链太多( 最后只有一个冈崎片段的长度) 。而且，这样引发体在DNA链上和 DNA聚合酶以同一速度移动。这时，由于复制叉继续向前运动，便产生了又一段单链的滞后链模板，它重新环绕DNA聚合酶全酶，并通过DNA聚合酶开始合成新的滞后链冈崎片段。通过这样的机制，前导链的合成不会超过滞后链太多( 最后只有一个冈崎片段的长度) 。而且，这样引发体在DNA链上和 DNA聚合酶以同一速度移动。在 DNA合成延伸过程中主要是DNA聚合酶的作用。当冈崎片段形成后，DNA聚合酶通过其5 3 外切酶活性切除冈崎片段上的RNA引物，同时，利用后一个冈崎片段作为引物由5 3 合成 DNA 。最后两个冈崎片段由DNA连接酶将其接起来，形成完整的DNA滞后链。( 三)DNA复制的终止过去认为， DNA一旦复制开始， 就会将该DNA分子全部复制完毕，才终止其DNA复制。 但最近的实验表明，在 DNA上也存在着复制终止位点，DNA复制将在复制终止位点处终止，并不一定等全部DNA合成完毕。但目前对复制终止位点的结构和功能了解甚少, 在 DNA复制终止阶段令人困惑的一个问题是，线性DNA分子两端是如何完成其复制的? 已知 DNA复制都要有RNA引物参与。当RNA引物被切除后，中间所遗留的间隙由DNA聚合所填充。但是，在线性分子的两端以5 3 为模板的滞后链的合成，其末端的RNA引物被切除后是无法被DNA聚合酶所填充的在研究 T7DNA 复制时，这个问题部分地得到了解决。T7DNA 两端的 DNA序列区有 160bp 长的序列完全相同。 而且，在 T7DNA复制时，产生的子代DNA分子不是一个单位T7DNA 长度，而是许多单位长度的T7DNA首尾连接在一起。T7DNA两个子代DNA分子都会有一个3 端单链尾巴，两个子代DNA的 3 端尾巴以互补结合形成两个单位T7DNA的线性连接。 然后由 DNA聚合酶填充和DNA连接酶连接后，继续复制便形成四个单位长度的T7DNA 分子。 这样复制下去， 便可形成多个单位长度的T7DNA分子。 这样的 T7DNA 分子可以被特异的内切酶切开，用 DNA聚合酶填充与亲代DNA完全一样的双链T7DNA 分子。在研究痘病毒复制时， 发现了线性DNA 分子完成末端复制的第二种方式。痘病毒 DNA 在两端都形成发夹环状结构。DNA复制时，在线性分子中间的一个复制起点开始，双向进行，将发夹环状结构变成双链环状DNA 。然后，在发夹的中央将不同DNA链切开，使DNA分子变性，双链分开。这样，在每个分子两端形成一个单链尾端要以自我互补，形成完整的发夹结构，与亲代DNA分子一样。在真核生物染色体线性DNA分子复制时，尚不清楚末端的复制过程是怎样进行的。也可能像痘病毒那样形成发夹结构而进行复制。但最近的实验表明， 真核生物染色体末端DNA复制是由一种特殊的酶将一个新的末端DNA序列加在刚刚完成复制的 DNA末端。这种机制首先在四膜虫中发现。该生物细胞的线性DNA分子末端有30-70 拷贝的 5TTGGGG3 序列，该细胞中存在一种酶可以将TTGGGG 序列加在事先已存在的单键DNA末端的 TTGGGG 序列上。这样有较长的末端单链 DNA ，可以被引物酶重新引发或其他的酶蛋白引发而合成RNA引物，并由DNA聚合酶将其变成双链DNA 。这样就可以避免其DNA随着复制的不断进行而逐渐变短。在环状 DNA的复制的末端终止阶段则不存在上述问题。环状 DNA复制到最后， 由 DNA拓扑异构酶切开双链DNA ，将两个 DNA分子分开成为两个完整的与亲代DNA分子一样的子代DNA 。3.3 与复制有关的酶和蛋白质3.3.1 DNA复制的复杂性复制过程解链需要能量供应如何维持单链过程DNA复制要求高度真实超螺旋的问题不同生物复制机制不同线性DNA复制过程如何解决最后一个引物是怎样切除的复制体：复制叉上DNA模板以特定的结构与酶和蛋白质偶联成的核蛋白复合物。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 9 页，共 32 页3.3.2 原核生物 DNA复制的酶学3.3.2.1 DNA聚合酶3.3.2.2 引物酶和RNA聚合酶3.3.2.3 解螺旋酶3.3.2.4 单链结合蛋白（SSBP ）3.3.2.5 依赖于 DNA的 ATP酶3.3.2.6 DNA连接酶3.3.2.7 旋转酶3.3.2.1 DNA聚合酶以 E.coliDNA聚合酶为例（1）大肠杆菌DNA聚合酶 (DNApolymerase ， DNApol)（2）大肠杆菌DNA聚合酶 (DNApol )：（3）大肠杆菌DNA聚合酶 (DNApol DNA 聚合酶主要负责DNA损伤的修复和冈崎片段之间间隙的填补。用枯草杆菌蛋白酶处理DNA聚合酶可得两个片段，大片段分子量76kd，被叫作klenow 片段，广泛用于 DNA序列分析中。5 3 聚合活性要求有双链DNA模板和具有3 羟基的引物，活性很高，可达1000 核苷酸 /min 。3 5 外切活性可以对不配对的局部单链进行识别，切除不配对碱基，又称“校正功能”。5 3 外切活性主要功能是切除复制过程中的引物。pol 的 5 3 外切活性有三个特点：a.必须有 5-P 末端。b. 被切除的核苷酸必须是氢键配对的。 c. 可以切除脱氧核糖核苷酸，也可以切除核糖核苷酸。（二） . 大肠杆菌DNA聚合酶 (DNApol) ：(1) 聚合作用 : 该酶催化DNA的聚合，但是对模板有特殊的要求。该酶的最适模板是双链DNA而中间有空隙(gap)的单链 DNA部份，而且该单链空隙部份不长于100 个核苷酸。(2) 该酶也具有3 5 外切酶活性，但无5 3 外切酶活性。(3) 该酶对作用底物的选择性较强，一般只能将2- 脱氧核苷酸掺入到DNA链中。(4) 该酶不是复制的主要聚合酶，因为此酶缺陷的大肠杆菌突变株的DNA复制都正常。可能在DNA的损伤修复中该酶起到一定的作用。（三） DNA聚合酶（四） pol 是体内DNA复制的主要承担者，是复制的主要酶类。全酶由多亚基组成. 其中 、 、三种亚基组成核心酶，其它为辅助蛋白。3.3.2.2引物酶和RNA聚合酶引物酶：用于合成引物的酶。利福平：抑制RNA的转录，使细菌无法繁殖。用利福平处理发现：先导链不能合成，而后随链能合成。3.3.2.3解螺旋酶3.3.2.4单链结合蛋白（SSBP ）SSB没有催化功能，它可以特异性地结合在单链区，使之免被核酸酶水解，起到保护和维持单链的作用。3.3.2.5依赖于 DNA的 ATP酶3.3.2.6 DNA连接酶用于连接3-OH和 5-P, 形成一个磷酸二酯键。3.3.2.7 旋转酶用于消除正超螺旋，恢复负超螺旋结构，需要ATP供能。3.3.3 真核生物 DNA复制的酶学3.3.3.1 真核生物DNA聚合酶真核生物中发现有5 种 DNA聚合酶，分别是：、 、。DNA聚合酶 是 DNA复制的主要酶类，由4 个亚基组成。原因是：所有强烈抑制酶的抑制剂都能抑制细胞的复制。酶的温度敏感突变株使该细胞的DNA复制成呈温度敏感型。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 10 页，共 32 页显微注射 酶的抗体可以抑制DNA的复制。酶 的活性随细胞周期而变化，S期活性最高。 DNA 聚合酶 具有 3 5 外切酶活性，对于复制的真实性十分重要。同是也是前导链合成的主要酶类。目前认为： 酶 和酶都是真核DNA复制酶。 酶在复制中合成前导链，酶合成后滞链。3.3.3.2 真核生物DNA解旋酶3.3.3.3 真核生物端聚酶用于复制染色体末端的序列。实际上是一种逆转录酶。3.4 DNA 复制的几种形式3.4.1 线性 DNA双链的复制线性 DNA先在 ori处形成复制泡， 从复制眼开始可以单向或双向复制，真核生物都是多复制泡起始的双向复制。4.2.2 型复制环形 DNA大多采用 型复制，如E.coli。特点：从原点ori开始，通常采用双向等速复制，不断扩大复制泡，形成环。3.4.3 滚环型复制某些环形的病毒DNA ，如 x174、噬菌体都是以这种方式复制。这是一种单向复制类型。3.4.4 D-环型（ D-loop) 动物线粒体DNA的复制方式。单向复制3.5 DNA 复制的调控4.5.1 大肠杆菌 DNA复制的调控原核生物DNA链的延伸速度是恒定的。与生长、增殖相配合协调的DNA的合成，主要依靠复制叉数量的不同。迅速分裂的细胞具有较多的复制叉，分裂缓慢的细胞复制叉较少。细胞复制叉的多少取决于复制起始的频率，这是原核细胞复制的调控点。复制子的调控由复制起始因子和起始位点两部分组成。E.coli的起始位点主要是oriC ，与蛋白相互作用来启动复制。主要的起始因子有dnaA、 dnaH 等蛋白质，它们通过与始位点形成复合物相互作用，确定复制的起始频率。研究发现：dnaA 对复制起正调控作用。4.5.2 真核生物 DNA复制的调控真核细胞中DNA复制有三个调控点：细胞生活周期水平的调控真核细胞的生活周期： G1：复制预备期 S：复制期 G2：有丝分裂准备期 M：为有丝分裂期。DNA复制只发生在S期染色体水平的调控复制子水平的调控第四章 DNA 的损伤与修复4.1 基因突变基因突变：可以通过复制而遗传的DNA结构的永久性改变。4.1.1 点突变DNA分子最常发生的点突变是碱基置换和移码突变两种。一种碱基被另一种碱基所替代称为替换。有两种形式的替换：转换（transition）和颠换 (transversion)。转换指的是一种嘌呤替换另一种嘌呤，或一种嘧啶替换另一种嘧啶。颠换指的是嘌呤替换嘧啶或嘧啶替换嘌啶。替换会引起单个密码子发生改变。表 4-1 正常血红蛋白与镰刀形血红蛋白的DNA变化和氨基酸差异精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 11 页，共 32 页链上 5、 6、7 氨基酸的核苷酸密码正常脯谷谷GGA CTC GGA 镰刀形脯缬谷 GGA CAC GGA 移码突变在 DNA的碱基序列中插入一个或几个碱基，或失去一个或几个碱基，使全部密码发生了变化，称为移码突变 (frameshift mutaion)。移码突变常常导致生物的死亡。4.1.2 染色体突变涉及到染色体较大区域的突变，主要形式有重复、丢失、倒位和易位等。4.1.3 基因组突变涉及以基因组为单位的变化，以致影响染色体的数量4.2 DNA的损伤DNA损伤是在某些因素作用下，DNA的结构和功能发生改变，阻碍DNA的复制与转录，DNA的这种变化称DNA的损伤4.2.1 DNA损伤的原因4.2.1.1 DNA分子的自发性损伤1、DNA复制中的错误 DNA 复制中的错配率约在10-10左右，即每复制1010个核苷酸大概会有一个碱基的错误。2、DNA的自发性化学变化生物体内DNA分子可以由于各种原因发生变化，至少有以下类型：碱基的异构互变 DNA中的 4 种碱基各自的异构体间都可以自发地相互变化（例如烯醇式与酮式碱基间的互变）。这种变化会使碱基的配对性质发生改变，可使腺嘌呤能配上胞嘧啶、胸腺嘧啶能配上鸟嘌呤等，如果这些配对发生在 DNA复制时，就会造成子代DNA序列与亲代DNA不同的错误性损伤。碱基的脱氨基作用碱基的环外氨基有时会自发脱落，从而胞嘧啶会变成尿嘧啶、腺嘌呤会变成次黄嘌呤（H） 、鸟嘌呤会变成黄嘌呤（X）等，遇到复制时，U 与 A 配对、 H 和 X都与 C配对就会导致子代DNA序列的错误变化。胞嘧啶自发脱氨基的频率约为每个细胞每天190 个。脱嘌呤与脱嘧啶自发的水解可使嘌呤和嘧啶从DNA链的核糖磷酸骨架上脱落下来。一个哺乳类细胞在37条件下， 20h 内 DNA链上自发脱落的嘌呤约1000 个、嘧啶约500 个；估计一个长寿命不复制繁殖的哺乳类细胞（如神经细胞）在整个生活期间自发脱嘌呤数约为108，这占细胞DNA中总嘌呤数约3% 。碱基修饰与链断裂细胞呼吸的副产物O2-、H2O2等会造成DNA损伤，能产生胸腺嘧啶乙二醇、羟甲基尿嘧啶等碱基修饰物，还可能引起DNA单链断裂等损伤，每个哺乳类细胞每天DNA单链断裂发生的频率约为5 万次。4.2.1.2 物理因素引起的DNA损伤射线引起的DNA损伤是最引人注意的。1、紫外线引起的DNA损伤DNA分子损伤最早就是从研究紫外线的效应开始的。当 DNA受到最易被其吸收波长（260nm）的紫外线照射时，同一条DNA链上相邻的嘧啶会以共价键连成二聚体，相邻的两个T、或两个C、或C 与 T 间都可以环丁基环（cyclobutane ring）连成二聚体，其中最容易形成的是TT 二聚体 .人皮肤因受紫外线照射而形成二聚体的频率可达每小时5 104/ 细胞，但只局限在皮肤中，因为紫外线不能穿透皮肤。但微生物受紫外线照射后，就会影响其生存。紫外线照射还能引起DNA链断裂等损伤。2、 电离辐射引起的DNA损伤电离辐射损伤DNA有直接和间接的效应，直接效应是DNA直接吸收射线能量而遭受损伤，间接效应是指DNA周围的其他分子（主要是水分子）吸收射线能量产生具有很高反应活性的自由基进而损伤DNA 。电离辐射可导致DNA分子的多种变化：碱基的变化主要是由OH-自由基引起，包括DNA链上的碱基氧化修饰、过氧化物的形成、碱基环的破坏和脱落等。一般嘧啶比嘌呤更敏感。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 12 页，共 32 页脱氧核糖的变化脱氧核糖上的每个碳原子和羟基上的氢都能与OH-自由基反应， 导致脱氧核糖分解，最后会引起DNA链断裂。DNA链断裂这是电离辐射引起的严重损伤事件，断链数随照射剂量而增加。射线的直接和间接作用都可能使脱氧核糖破坏或磷酸二酯键断开而致DNA链断裂。 DNA 双链中一条链断裂称单链断裂（single strand broken ） ，DNA双链在同一处或相近处断裂称为双链断裂（double strand broken ） 。虽然单断发生频率为双断的10-20 倍，但还比较容易修复；对单倍体细胞（如细菌）一次双断就是致死事件。交联包括 DNA 链交联和 DNA- 蛋白质交联。 同一条 DNA 链上或两条DNA 链上的碱基间可以共价键结合，DNA与蛋白质之间也会以共价键相连，组蛋白、染色质中的非组蛋白、调控蛋白、与复制和转录有关的酶都会与DNA共价键连接。 这些交联是细胞受电离辐射后在显微镜下看到的染色体畸变的分子基础，会影响细胞的功能和DNA复制。4.2.1.3 化学因素引起的DNA损伤化学因素对DNA损伤的认识最早来自对化学武器杀伤力的研究，以后对癌症化疗、化学致癌作用的研究使人们更重视突变剂或致癌剂对DNA的作用。1、烷化剂对DNA的损伤烷化剂是一类亲电子的化合物，很容易与生物体中大分子的亲核位点起反应。烷化剂的作用可使DNA发生各种类型的损伤：碱基烷基化。烷化剂很容易将烷基加到DNA链中嘌呤或嘧啶的N或 O上，其中鸟嘌呤的N7和腺嘌呤的N3最容易受攻击，烷基化的嘌呤碱基配对会发生变化，例如鸟嘌呤N7被烷化后就不再与胞嘧啶配对、而改为与胸腺嘧啶配对，结果会使G-C转变成 A-T。碱基脱落。烷化鸟嘌呤的糖苷键不稳定，容易脱落形成DNA上无碱基的位点，复制时可以插入任何核苷酸，造成序列的改变断链。 DNA 链的磷酸二酯键上的氧也容易被烷化，结果形成不稳定的磷酸三酯键，易在糖与磷酸间发生水解，使 DNA链断裂。交联。烷化剂有两类，一类是单功能基烷化剂，如甲基甲烷碘酸，只能使一个位点烷基化；另一类是双功能基烷化剂，化学武器如氮芥、硫芥等、一些抗癌药物如环磷酰胺、苯丁酸氮芥、丝裂霉素等、某些致癌物如二乙基亚硝胺等均属此类，其两个功能基可同时使两处烷基化，结果就能造成DNA链内、 DNA链间、以及DNA与蛋白质间的交联。2、碱基类似物、修饰剂对DNA的损伤人工可以合成一些碱基类似物用作促突变剂或抗癌药物，如5-溴尿嘧啶（ 5-BU） 、5- 氟尿嘧啶（ 5-FU） 、2- 氨基腺嘌呤（2-AP）等。由于其结构与正常的碱基相似，进入细胞能替代正常的碱基参入到DNA链中而干扰DNA复制合成，例如5-BU 结构与胸腺嘧啶十分相近，在酮式结构时与A配对，却又更容易成为烯醇式结构与G配对，在 DNA复制时导致A-T 转换为 G-C。还有一些人工合成或环境中存在的化学物质能专一修饰DNA链上的碱基或通过影响DNA复制而改变碱基序列，例如亚硝酸盐能使C脱氨变成U，经过复制就可使DNA上的 G-C变成 A-T 对；羟胺能使T 变成 C，结果是 A-T 改成 C-G对；黄曲霉素B也能专一攻击DNA上的碱基导致序列的变化，这些都是诱发突变的化学物质或致癌剂。4.2.2 DNA损伤的后果上述损伤会最终导致DNA分子结构的变化，这种DNA分子水平上的突变(mutation)是基因突变的基础。突变或诱变对生物可能产生4 种后果：致死性；丧失某些功能；改变基因型(genotype)而不改变表现型(phenotype)；发生了有利于物种生存的结果，使生物进化。4.3 DNA 修复DNA修复 (DNA repair) 是细胞对DNA受损伤后的一种反应，这种反应可能使DNA结构恢复原样，重新能执行它原来的功能。绝大多数的损伤或突变在DNA未复制前就被修复，保持遗传的稳定性。生物体内存在多种修复机制，采用那一种修复机制对损伤的DNA进行修复，取决于DNA损伤的性质。4.3.1 回复修复这是较简单的修复方式，一般都能将DNA修复到原样。1. 光修复这是最早发现的DNA修复方式。修复是由细菌中的DNA光复活酶来完成，此酶能特异性识别紫外线造成的核酸链上相邻嘧啶共价结合的二聚体，并与其结合，这步反应不需要光；结合后如受300600nm波长的光照射，则此酶就被激活，将二聚体分解为两个正常的嘧啶单体，然后酶从DNA链上释放， DNA恢复正常结构。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 13 页，共 32 页后来发现类似的修复酶广泛存在于动植物中，人体细胞中也有发现。2. 单链断裂的重接 DNA 单链断裂是常见的损伤，其中一部分可仅由DNA连接酶 (ligase)参与而完全修复。此酶在各类生物各种细胞中都普遍存在，修复反应容易进行。但双链断裂几乎不能修复。3. 碱基的直接插入 DNA 链上嘌呤的脱落造成无嘌呤位点，能被DNA嘌呤插入酶 (insertase)识别结合，在K存在的条件下，催化游离嘌呤或脱氧嘌呤核苷插入生成糖苷键，且催化插入的碱基有高度专一性、与另一条链上的碱基严格配对，使DNA完全恢复。4.3.2. 错配修复识别新生链中非 m6A 的 GATC 序列Scanning 新生链中错配碱基酶切含错配碱基的新生DNA区段4.3.3 切除修复是修复 DNA损伤最为普遍的方式，对多种 DNA损伤包括碱基脱落形成的无碱基位点、嘧啶二聚体、 碱基烷基化、单链断裂等都能起修复作用。这种修复方式普遍存在于各种生物细胞中，也是人体细胞主要的DNA修复机制。修复过程需要多种酶的一系列作用，基本步骤包括：首先由核酸内切酶识别DNA的损伤位点， 在损伤部位的5侧切开磷酸二酯键。不同的 DNA损伤需要不同的特殊核酸内切酶来识别和切割。由DNA解链酶将有损伤的DNA片段解离。在DNA聚合酶的催化下，以完整的互补链为模板，按 5 3 方向合成DNA链，填补已切除的空隙。由 DNA连接酶将新合成的DNA片段与原来的 DNA断链连接起来。这样完成的修复能使DNA恢复原来的结构。4.3.4 重组修复主要用于DNA复制后的损伤修复DNA重组修复方式受损伤的DNA链复制时，产生的子代DNA在损伤的对应部位出现缺口。 另一条母链DNA与有缺口的子链DNA进行重组交换，将母链DNA上相应的片段填补子链缺口处，而母链DNA出现缺口。以另一条子链DNA为模板，经DNA聚合酶催化合成一新DNA片段填补母链DNA的缺口，最后由DNA连接酶连接，完成修补。重组修复不能完全去除损伤，损伤的DNA段落仍然保留在亲代DNA链上，只是重组修复后合成的DNA分子是不带有损伤的，但经多次复制后，损伤就被“冲淡”了，在子代细胞中只有一个细胞是带有损伤DNA的。链的非准确转移，导致突变机率的增加4.3.5 SOS修复SOS修复是指DNA受到严重损伤、细胞处于危急状态时所诱导的一种DNA修复方式，修复结果只是能维持基因组的完整性，提高细胞的生成率，但留下的错误较多，故又称为错误倾向修复(errorprone repair)，使细胞有较高的突变率。当 DNA两条链的损伤邻近时，损伤不能被切除修复或重组修复，这时在核酸内切酶、外切酶的作用下造成损伤处的 DNA链空缺，再由损伤诱导产生的一整套的特殊DNA聚合酶 -SOS修复酶类，催化空缺部位DNA的合成，这时补上去的核苷酸几乎是随机的，但仍然保持了DNA双链的完整性，使细胞得以生存。但这种修复带给细胞很高的突变率。应该说目前对真核细胞的DNA修复的反应类型、参与修复的酶类和修复机制了解还不多，但DNA损伤修复与突变、寿命、衰老、肿瘤发生、辐射效应、某些毒物的作用都有密切的关系。人类遗传性疾病已发现4000 多种，其中不少与DNA修复缺陷有关，这些DNA修复缺陷的细胞表现出对辐射和致癌剂的敏感性增加。小结环境和生物体内的因素都经常会使DNA的结构发生改变。DNA的复制会发生碱基的配对错误；体内DNA会有自发性结构变化，包括DNA链上的碱基异构互变、脱氨基、碱基修饰、 DNA链上的碱基脱落等。外界射线的照射等物理因素，烷化剂、碱基类似物、修饰剂等化学因素都能损伤DNA的结构，变化包括有相邻嘧啶共价二聚体的形成、碱基、脱氧核糖和磷酸基团的烷基化和其它修饰、碱基脱落、 DNA单链断裂、 双链断裂、DNA链内交联、链间交联、DNA与周围的蛋白质交连等。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 14 页，共 32 页最后能导致DNA的点突变、 DNA核苷酸的缺失、插入或转位、DNA链的断裂等，结果可能影响生物细胞的功能和遗传特性，这些改变可能会导致细胞死亡、也有机会使细胞获得新的功能或进化，也可能细胞只有DNA结构的遗传性改变而没有表型变化，视DNA结构变化的部位、类型和范围不同而异。生物在进化过程中获得的DNA修复功能， 对生物的生存和维持遗传的稳定性是至关重要的。对有些 DNA的损伤，细胞能将其完全修复到原样，如可将嘧啶二聚体切开、DNA单链断裂可重新连接、碱基缺失可再配对插入、加成的烷基可以移除、一条链上的碱基或核苷酸的错误可以切除并依赖互补链作模板而复制重新修复等。对DNA较严重的损伤，细胞可采取重组修复、SOS修复等方式进行反应，以期提高细胞的存活率，但不能完全消除DNA的损伤，会带给细胞较高的突变率。DNA的损伤和修复与遗传、突变、寿命、衰老、辐射效应、肿瘤发生、某些毒剂的作用、以及某些遗传性疾病等有密切的关系。目前对DNA损伤修复的认识还不透彻。复习思考题1. 为什么说细胞对DNA损伤的修复能力对细胞的生存是至关重要的?2. 体内那些因素会导致DNA结构的变化 ?细胞能采取那些办法保持DNA结构的稳定性?3. 那些环境因素容易损伤生物体内的DNA? 损伤有那些方式和类型?结果对生物细胞会有些什么影响?第五章 DNA的转座转座作用DNA的转座，或称移位，是由可移位因子介导的遗传物质重排现象。不十分准确，在转座过程中，可移位因子的一个拷贝常常留在原来的位置上，在新位点出现的是拷贝，因此，转座有别于同源重组，它依赖于DNA的复制。根据转座子复制与否，转座作用可分为: 1 单纯转移 2 复制转移5.1 转座子转座子（ Transposon,Tn ）是存在于染色体DNA上可自主复制和位移的基本单位。转座子分两大类：1 插入序列 2 复合型转座子5.1.1 插入序列插入序列对插入点后的基因产生极性效应。插入序列的发现：S除带有编码转座酶的基因外，不带任何其它遗传信息。IS 的结构特点：长度在1000bp 左右。末端具有倒置重复序列，转座时常复制靶位点附近的一小段DNA （4-15bp ） ，形成位于IS 两端的正向重复区。具有编码转座酶的基因。IS 转座一般模式精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 15 页，共 32 页5.1.2 复合型转座子是由两个重复顺序夹着一个或多个结构基因组成的转座单位，往往存在于R因子及其它质粒中。有的复合型转座子的重复顺序就是IS。一般长4,500-200,000bp。复合转座子一旦形成，转座功能受较多因子调控5.2 转座机制目前认为，转位酶能与转位因子两端相结合，并且也和转位因子将要插入的DNA靶序列相结合。然后转位酶在靶上作出交错的切割，好象限制酶一样，并同时在转位因子的两端也各进行单链的切断，这个切断必须在两条不同的链上。所产生的转位因子游离端于是和靶序列的游离端相连接，这样就将两个DNA分子连接起来，即靶序列两端各有一条链和原转位因子的一个游离端相连。然后有两条路可走，取决于当时的情况和转位因子的类型。简单转位作用：第二次切割转位因子两条链的另一端切断，并将转位因子整个转移到新DNA分子上；而在原来宿主DNA上留下一个致死性的“空隙”。DNA聚合酶的功能在这里不过是插入几个核苷酸以完成靶位点的复制而已。因此，简单转位作用只是将转位因子转移到新的位点上。复制转位作用转位因子被复制，一个拷贝转移，另一拷贝留下，故原来宿主DNA上不留“空隙” ，不被破坏。在这种情况下不进行第二次切割，而是在第一次切割处留下的断端处，由DNA聚合酶起始复制转位因子的第二条链，从而形成共联体（ cointegrate） 。1）简单转位（2）复制转位5.3 转位作用的遗传效应引起插入突变产生新的基因产生染色体畸变（引发 DNA重排：如DNA缺失或者倒位）引起生物进化精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 16 页，共 32 页5.4 某些常见的转位子5.4.1 Tn10许多转位子两端的IS 具有完全相同的反向（或同向）重复顺序。但亦有些Tn 两端 IS 不完全相同，从而引起其功能各异。例如Tn10 两端的 IS（右侧 IS10R，左侧为 IS10L ）即不完全相同。在 IS10 两端的反向重复顺序长22bp。这个 22bp 的反向重复即是转位酶所赖以识别的位点，因而为转位反应所必须。由于IS10R 和 IS10L 的反向重复不完全相同，所以IS10R 是 Tn10 转位所必须，而IS10L 的转位活性却仅为 IS10R 的 1-10 （目前估计IS10R 和 IS10L 之间约有2.5 的差异）。此外，Tn10 所需靶序列 （同向重复序列）亦有特异性。 这个 9bp 的同向重复中有6bp 在靶序列中是对称排列的，并且是共同顺序（consensus ） 。5 NGCTNAGCN3 3 NCGANTCGN5 （N为任意碱基对）靶序列和共同顺序愈相似，则转位的频率愈高。很可能转位酶需要同时识别末端反向重复和靶序列二者方能发挥作用。5.4.2 Tn5Tn5 的末端反向重复序列是一个很好的例子，说明很小的突变能引起很大的功能改变。Tn5 右端的 IS50R 对转位作用有功能，而左端IS50L 则无功能。然而这一对反向重复之间的差异仅为一个碱基对。5.4.3 TnA家族TnA家族都是比较大的转座子（-5kb 以上），其特点是两端不含IS，但含有独立的转位酶基因和抗药性基因。TnA家族包括许多类似的转位子。它们的一般结构均相类似，但有不同的遗传标记(genetic markers)。第六章 RNA 的转录与加工若 干 基 本 概 念基因表达的第一步以 D. S. DNA 中的一条单链作为转录的模板在依赖 DNA的 RNA聚合酶的作用下按 A U，C G 配对的原则，合成RNA分子模板单链 DNA的极性方向为3 5 , 而非模板单链 DNA 的极性方向与RNA链相同，均为5 3 . ( 书写 DNA序列时，仅写非模板序列，可不注明极性方向) DNA 5-ATGAGTA-33-TACTCAT-5RNA 5-AUGAGUA-3编码链又称有义链， 是指与 mRNA 序列相同的那条链。 非编码链又称反义链，是指那条根据碱基互补原则指导mRNA生物合成的DNA链。某一基因只以一条单链DNA 为模板进行转录（不对称转录 RNA 的转录包括promotion, elongation, termination 三过程从启动子（ promoter ）到终止子（terminator）称为转录单位（transcriptional unit）原核生物中的转录单位多为 polycistron in operon真核生物中的转录单位多为monocistron, No operon转录原点记为+1，其上游记为负值，下游记为正值精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 17 页，共 32 页6.1 转录概述转录指的以DNA为模板，在RNA聚合酶催化下通过DNA链上的碱基配对来合成RNA的反应。启动子：与RNA聚合酶特异性结合以起始转录的一段DNA序列。终止子：引起转录终止的一段DNA序列。富含GC对。增强子：调节启动子，增强转录效率的一段DNA序列。6.1.1 RNA合成的基本特征合成 RNA的底物是NTP ，包括 ATP 、GTP 、CTP和 UTP 。在 RNA聚合酶的作用下，一个NTP的 3-OH 和另一个NTP的 5-P 反应，形成磷酸二酯键。RNA的碱基顺序由DNA的顺序决定，以双链DNA分子中的一条链为模板，按碱基互补配对原则合成。RNA合成的方向是5 3 。在 RNA的合成中不需要引物。转录与复制的异同？转录与复制存在三个主要不同点：A转录中不需要RNA引物、以4 种三磷酸核糖核苷（NTP ）为底物；B转录反应一般只用一小段DNA做模板；C在转录区，一般都只有一条DNA链可以作为模板。6.1.2 转录的基本过程无论是原核细胞还是真核细胞，转录的基本过程都包括：起始、延伸和终止。起始指的是 RNA聚合酶结合到双链DNA上， 局部解链， 使得底物NTP与模链的碱基能够配对。随着约 9nt( 核苷酸 )!? 的掺入，起始阶段结束。延伸阶段是底物 NTP加到生长的多核苷酸链的3 端，在解螺旋区形成暂时的RNA-DNA 杂合分子。聚合酶沿着 DNA移动，下游的双螺旋再解开一段，使模板链不断暴露出新的单链部分。随着聚合酶向前移动，合成的RNA从模板 DNA上脱开，模板DNA与有意义链配对形成双链。终止反应包括识别特定的终止位点，碱基不再加到链上，转录复合物停止移动，酶和 RNA从模板上释放。6.1.3 原核和真核生物基因转录的差别原核生物只有一种RNA聚合酶，负责转录所有类型的基因，而真核生物有三种以上的RNA聚合酶，负责不同类型基因的转录，在细胞核内的位置也不相同。转录产物有差别。真核的初始产物很长，包括有内含子序列，加工后成熟的mRNA 只占其中的一小部分。而原核生物的初始产物与编码的蛋白成线性关系。真核生物转录产物要经过加工修饰过程。原核的mRNA 是多顺反子，而大多数真核mRNA 是单顺反子。把只编码一个蛋白质的mRNA 称为单顺反子mRNA 。把编码多个蛋白质的mRNA 称为多顺反子mRNA 。多顺反子mRNA 是一组相临或相互重叠基因的转录产物，这样的一组基因可被称为一个操纵子（operon ） 。操纵子（ operon ）: 是包含几个基因（可作为一个多顺反子的转录物被转录）及其共同调控元件的原核生物基因座。基因座（ gene loci） ：是指染色体上一个基因的位置，包括两侧的调控元件。其本义是指任何标记物的位置（包括基因、调控元件、复制起始区、细胞遗传学中的标记）。6.2 RNA 聚合酶RNA聚合酶的主要功能：识别并结合于DNA上的启动子；使 DNA解链或恢复双链；通过阅读启动子序列，确定转录方向和模板链；选择正确的NTP ，按 5 3方向催化合成RNA ；识别终止子，停止转录；和转录因子（真核）相互作用，以调节转录速度；在受阻遏的情况下进行自我调整，即借助于辅助因子切割转录产物的3端，恢复合成RNA 。6.2.1 原核生物的RNA聚合酶精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 18 页，共 32 页6.2.1.1 大肠杆菌 (E.coli)RNA聚合酶的组成及各亚基的功能E.coli和其它原核细胞一样，只有一种RNA聚合酶。正常情况下一个大肠杆菌细胞中大约有7000 个 RNA聚合酶分子。E.coli RNA聚合酶的全酶由 5 个亚基组成， 即 2 ，分子量为480KD;其中 2 构成核心酶，核心酶与 因子构成全酶。表 6-1 E.coliRNA聚合酶的基本性质亚基基因全酶中的数量分子量 D 部位可能的功能rpoA240000核心酶结合启动子rpoB1155000核心酶结合核苷酸 rpoC1160000 核心酶结合模板 rpoD 1 85000 因子起始识别因子？ 1 11000 核心酶？不同的原核生物，具有基本相同的核心酶，但其 亚基有所差别，决定了原核基因的选择性表达。因子重复使用 (Reusable 使全酶识别Sextama Box (-35), 与模板链结合修饰 RNApol 构型，降低全酶与 DNA的非专一性结合力增强全酶与R, B site的专一性结合力导致 RNA链的延伸缓慢因子； 核心酶的组建因子+促使 RNApol 与 DNA 模板链结合位于前端的 因子使双链解链为单链位于尾端的 因子使单链重新聚合为双链因子；促进 RNA pol + NTP RNA elongation 完成 NMP之间的磷酸脂键的连接与 Rho( ) 因子竞争RNA 3-end构成 Holo Enzyme 后， 因子含有两个位点I site (Rif S) ; 专一性地结合ATP or GTP 要求高浓度的ATP or GTP E site (Rif R) ; 对 NTP 非专一性结合 因子；强碱性亚基 促使 RNA与非模板链（sense strand）结合 受 K酶抑制Holo Enzyme 含有五个功能位点 sense strand DNA binding point( ) DNA/RNA hybrid site( ) D. S.DNA unwinding point() D. S.DNA rewinding point() factor point 6.2.1.2 大肠杆菌RNA聚合酶的催化活性RNA聚合酶全酶结合到启动子区，在DNA链上形成起始复合物开始转录。当酶沿着模板移动，RNA链延伸。 因子释放，由核心酶负责RNA链的延伸。核心酶覆盖大约60bp 的 DNA区域，其中解链部分17bp; 生长着的RNA链的底物NTP结合位点之前的一段模板是游离的，在结合位点之后的模板与新生RNA形成杂合链，杂合链长约12bp。RNA合成时，前面已经加到RNA链上的最后一个核苷酸的3-OH 与新核苷酸的5 三磷酸之间相互作用，失去焦磷酸基团，形成磷酸二酯键。新核苷酸能否被接受是由RNA聚合酶来监督的。6.2.2 真核生物的RNA聚合酶真核生物中已发现有三种细胞核的RNA聚合酶，分别称为RNA聚合酶、，分子量大致都在50 万道尔顿左右。它们专一性地转录不同的基因，因此由它们催化的转录产物也各不相同。RNA聚合酶合成 RNA的活性最显著，它位于核仁中，负责转录编码rRNA的基因。而细胞内绝大部分RNA是rRNA。RNA聚合酶位于核质中，负责核内不匀一RNA （hnRNA ）的合成，而hnRNA是 mRNA 的前体。RNA聚合酶负责合成tRNA和许多小的核内sRNA 。鹅膏蕈碱是真核生物RNA聚合酶特异性抑制剂，三种真核生物RNA聚合酶对鹅膏蕈碱的反应不同。表 6-2 真核生物RNA聚合酶的比较精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 19 页，共 32 页种类分布亚基种数合成的 RNA类型对 - 鹅膏蕈碱敏感性核仁 6-13 rRNA 不敏感核质8-11hnRNA低浓度敏感核质10-15tRNA，5sRNA高浓度敏感真核 RNA聚合酶区别于原核RNA聚合酶的最大特点是：原核的酶具有全能性，基本不需要其它蛋白因子参与；而真核的酶需要多种转录因子参与才能显示出起始转录的能力。6.2.3 转录过程的选择性抑制放线菌素D是原核和真核生物中RNA聚合酶的专一抑制剂。利福平也是一种重要的RNA合成抑制剂，它只抑制原核生物RNA的合成，而不抑制真核生物中RNA的合成作用。- 鹅膏蕈碱是真核细胞中RNA合成的专一抑制剂。6.3 转录的起始、延伸和终止6.3.1 原核生物基因启动子的结构原核生物的启动子长约20-200bp 不等。不同的启动子存在着保守的共同序列，主要集中在-10 和 -35 两个区域。转录起点是指与新生RNA链第一个核苷酸相对应DNA链上的碱基，通常为嘌呤（A或 G ） 。起点前面，即5末端的序列称为上游，后面即3末端的序列称为下游。通常起点位置用数字+1 表示，下游方向依次为+2、+3 ，上游方向依次为-1、-2 、-3 Pribnow 框（ -10 序列） （Pribnow box ）在转录开始位点上游-10 区域，大致在 -4-13 之间有一个典型的6bp 序列，大多为TATAAT或稍有变化的形式，称为 Pribnow 框或 -10 序列。该共同序列的频度为：T89A89T50A65A65T100目前认为， Pribnow 框决定着转录的方向，是RNA聚合酶牢固结合的位点(B site)，是启动子的关键部位。-35 序列（ Sexfama box ）(R site) 在转录起始位点上游-35 区域也有一段保守序列，共同序列是TTGACA ， 称为 -35 区。其保守频度为： T85T83G81A61C69A52lac 启动子的 -10 区和 -35 区：-10 区和 -35 区的最佳间距原核基因最佳启动子的一般结构认为是位于转录起点上游-10 序列的 6 对核苷酸和 -35 序列的 6 对核苷酸以及它们之间相隔约17bp 的一段 DNA片段。Sextama Box 与 Pribnow Box 间距，有利于 RNApol 启动间距趋近于17 bp ，up mutation间距远离于17 bp ，down mutation17bp 的间距较17bp 的序列对转录更为重要l Sextama Box or Pribnow Box mut转录率下降100X Sextama Box and Pribnow Box mut. 转录率下降1000X 下降突变 (down mutation)：启动子里核苷酸的改变造成启动子效率降低。上升突变 (up mutation)：启动子里核苷酸的改变提高了启动子的转录效率。突变后的 -10 区和 -35 区越接近共同序列，转录的RNA就越多；越远离共同序列，转录的RNA就越少。Promoter 与factor 间的结合专效性决定了 strong promoter & weak promoter 启动子中 -35, -10 区序列的差异影响与 RNApol 中因子的结合能力不同启动子的 -35 ，-10 区序列间存在较为保守的标准序列( 标准启动子 ) 精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 20 页，共 32 页10 盒和 35 盒一起又称作核心启动元件（core promoter elements）某些特殊的强启动子还有一个额外的元件，即UP元件（ UP element ）或 UAS(upstream activating sequence) 。UP元件（或 UAS)常位于核心启动元件上游-40 和 -60 之间，能够加强启动子的功能。6.3.2真核生物 (RNA聚合酶 II) 的启动子结构6.3.3 转录的起始转录起始可分为四个阶段：核心酶在 因子参与下接触到DNA上；RNA聚合酶识别启动子并与之结合，形成封闭性的起始复合物；酶结合在 -10 区，启动子活化；然后解开双链，暴露模板链；酶移动到转录起始位点，加上第一个核苷三磷酸，形成三元复合物，转录开始。6.3.3.1 因子的作用因子的功能是保证RNA聚合酶特异性地结合到DNA的启动子区，即识别启动子。6.3.3.2 RNA聚合酶与启动子的结合在 RNA聚合酶与启动子的相互作用过程中，因子帮助其发现识别位点，全酶与-35 序列结合，形成封闭型启动子复合物。然后通过蛋白质的变构作用，整个酶分子向-10 序列移动并与之牢固结合，形成封闭式起始复合物。6.3.3.3 形成开放式起始复合物封闭式起始复合物在-10 序列及转录起始位点处发生局部解链，解链区在 -9+13 范围， 此时复合物转变成开放式的 RNA pol- 启动子复合物。6.3.3.4 第一个被转录碱基的选择和三元起始复合物DNA开链是正确引入核苷酸底物的必要条件，这时第一个底物NTP依靠与模板链的互补原则进入亚基中起始位点部位。随后第二个底物NTP进入延伸位点。起始位点的模板以CAT为主。RNA合成起始后，形成三元复合物：DNA模板 /RNA pol/RNA 。6.3.3.5 因子的解离三元复合物的形成表示转录起始阶段结束，因子从全酶上解离下来。游离的 因子可再接触到其它的核心酶分子，进入下一个功能循环。（1）RNA聚合酶全酶与模板DNA接触，生成非专一的复合物在模板上移动；（2）全酶识别启动子，产生封闭的“酶- 启动子二元复合物” ；（3）全酶与启动子-10 紧密结合，模板DNA局部解链，形成开放式复合物。（4）全酶与转录起始点结合，头两个核苷酸之间形成磷酸二酯键，形成酶- 启动子 -RNA三元复合物。（5）转录起始成功，RNA聚合酶释放 因子，核心酶-DNA-新生的 RNA形成转录延伸三元复合物。6.3.4 转录的延伸形成稳定的三元复合物后，RNA的合成即进入延伸阶段，底物NTP不断地加到RNA链的 3-OH 基端， RNA链不断延伸。在 RNA聚合酶结合和转录的DNA模板区，有17bp 的 DNA形成解链区，新生的RNA有 12bp 与模板形成杂合链。在 DNA模板富含 GC的区域，转录速度会减慢甚至停顿。当发生GC AT时，可以消除停顿。影响 RNA链延伸速度的因素RNA聚合酶不同来源的酶催化RNA链延伸的速度不同。暂停信号当 RNA聚合酶遇到暂停信号时，转录速度会变慢。其它配基6.3.5 转录的终止当 RNA聚合酶移动到终止子（t ）处时 , 就停止把底物加到生长着的RNA的 3-OH 基端，释放出完成的RNA链，酶从 DNA模板上解离，称为终止反应。根据转录终止反应是否需要辅助因子蛋白，可把终止子分为两类：一类是不需要任何辅助因子的终止子，称为不依赖 因子的终止子；另一类则需要辅助因子 才能完成终止反应，称为依赖因子的终止子。不依赖 因子的终止子结构特点： RNA产物具有一个发夹结构和一段富含U的片段。这种不需要辅助因子的终止子又称为强终止子。依赖 因子的终止子因子：一种分子量为55Kd 的蛋白质，其活性形式为六聚体，具有NTPase活性。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 21 页，共 32 页依赖 因子的终止子同样具有茎环结构，但是缺少寡聚U 结构；当RNA聚合酶转录到发夹结构时发生一定时间的停顿，这时如果没有因子，转录将会继续下去；只有当因子存在时，转录才终止。抗终止破坏终止位点RNA的茎 - 环结构依赖于蛋白质因子的转录抗终止破坏终止点RNA的茎环结构原核生物由于转录翻译耦联，mRNA 立即通过核糖体合成蛋白质，氨基酸的浓度作为信号决定了核糖体的移动。Trp 操纵子6.3.6原核与真核生物mRNA 比较半衰期多/ 单顺反子5帽子结构，3的 poly （A）尾巴最大的差异是真核基因是断裂基因，其转录翻译被时空阻隔，mRNA 有一个加工成熟的阶段断裂基因表达程序先转录成初级转录物，即核内不均一RNA （hnRNA ） ，又叫前体mRNA ；然后经过删除和连接，去除无关的DNA间隔序列的转录物，便形成成熟的mRNA分子；它从细胞核中输送到细胞质，再翻译成相应的多肽链。这种在mRNA成熟过程中其转录物被剪除掉的对应DNA部分叫做间隔序列或内含子，被保留下来的对应的DNA部分叫编码序列或外显子。帽子结构的意义翻译起始的必要结构，给翻译起始因子与mRNA 的识别提供信号保护 mRNA 免遭核酸酶破坏，增加稳定性Poly （ A）尾巴的功能提高 mRNA 稳定性，利于从细胞核转运到细胞质但是组蛋白没有尾巴可能对翻译效率有影响，保持mRNA 一定的半衰期多应用于基因工程操作SD序列原核生物起始密码子AUG上游 7-12 个核苷酸处有一被称为SD序列（ Shine-Dalgarno sequence）的保守区，通常含有5-AGGAGGU- 3 序列的全部或部分的多嘌呤序列，与核糖体小亚基中的16srRNA 的 3端序列5-ACCUCCU- 3 进行碱基配对，因此称之为核糖体结合位点或SD 序列，常用于区别原核与真核生物，作用是相对于起始密码子而正确定位核糖体。现分离了一DNA片段，可能含有编码多肽的基因的前几个密码子。该片段的序列组成如下：5CAGGAGGTCTCAGTCGATGTCCTGTG 33GTCCTCCAGAGTCAGCTACAGGACAC 5-试回答： (1) 哪一条链是模板链? 哪一条是编码链？ mRNA的序列是什么? (2) 若 DNA聚合酶复合物移动的方向如箭头所示，先导链是哪条? (3) 翻译从哪里开始?朝哪个方向（左或右）进行?（ 4）试判断该 DNA来源于原核生物还是真核生物，为什么？（1）A是编码链， B是模板链， mRNA 的序列是5CAGGAGGUCUCAGUCGAUGUCCUGUG3( 因为编码链是与mRNA序列相同的链，模板链是与mRNA 序列互补的链。（2）若 DNA复制的方向如箭头所示，先导链是A （因为：先导链的复制是连续的，复制方向与DNA聚合酶复合物移动方向相同，而新生 DNA聚合方向是由5向 3延伸的， 同一方向模板走向应该是3向 5 ）（3）翻译从mRNA 的 AUG开始，朝右进行（即从mRNA5 向 3移动）（4）该 DNA来源于原核生物，因为在 mRNA 链起始密码子AUG上游有一 AGGAGGU的富含嘌呤序列，即 S-D序列，而这是原核生物mRNA 所特有的序列。6.4 真核基因转录后的加工真核基因的初始转录产物一般缺乏生物活性，需要经过剪接加工后才成为有活性的RNA 。真核基因转录产物的主要特点：精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 22 页，共 32 页真核 mRNA 一般具有5端帽子结构和3端 polyA 结构。真核生物成熟的RNA大多数需要转移到细胞质中，参与蛋白质合成，转录与翻译是两个相对独立的过程。绝大多数真核基因的结构基因均含有插入序列。6.4.1 5 端帽子结构真核生物mRNA 的 5端大多具有m7GPPPN 的帽子结构 :5端加“ G ”的反应是由腺苷酸转移酶催化完成的，帽子结构是GTP （或鸟苷）和原mRNA5 的三磷酸腺苷缩合反应的产物。mRNA 的帽子结构常常被甲基化，由尿苷酸-7- 甲基转移酶来催化。帽子结构的功能：对翻译起识别作用。可以保护mRNA 免遭核酸酶降解。不是所有的真核生物mRNA 都有 5端帽子结构。6.4.2 3 端 poly （ A ）结构真核生物mRNA 的 3端大多具有poly （A）的结构 , 长约 40-200bp 。poly （ A）是 mRNA 由细胞核进入细胞质所必需的形式，有助于保持mRNA 的稳定性。6.4.3 不连续基因真核生物在编码多肽链的核苷酸序列中间存在着与氨基酸编码无关的DNA序列，即一个基因编码序列被分隔成不连续的若干区段，称为真核生物的不连续基因。不连续基因由外显子和内含子交替排列组成。外显子：编码蛋白质的序列。内含子：初级转录产物hnRNA加工产生成熟mRNA 时被切除的间隔序列。内含子的可能功能：内含子通过启动子、起始位点的碱基配对，可以阻止或增强RNA聚合酶的作用；内含子具有各种剪接信号，不同的细胞可以选择不同的拼接点，对外显子进行有选择地拼接，形成不同的成熟mRNA ；内含子也许有自已特定的蛋白质编码。Intron 边界保守序列高度保守，成为剪接过程重要的识别序列人类许多重要疾病的病因junction seq. mut. 异常剪接 病症6.4.4 RNA的剪接mRNA 剪接的一致序列几乎所有的核内mRNA 前体内元都有相同的起始和结尾：外元/GU内元 AG/外元（主要），或者外元 /AU内元 AC/外元（次要）更确切的顺序随后又被发现如下：5-AG/GUAAGU 内元 YNCURACYNNAG/G-3 ，两端的 / 符号是外元和内元的界限， Y代表嘧啶 （U或者 C） ，YN代表大约9个嘧啶， R代表嘌呤 （A或 G ） ，N代表如何一个碱基。A是一个特殊的A，它参与分叉切割中间体的形成。在 Branch Site 的两侧存在一些短的序列，与其上游10-50Nt 处互成 IR, 形成茎环结构( 但 A不包含在 IR 序列内 , 从而被排除成芽状突起）RNA的剪接类型切除内含子的过程称为RNA的剪接。RNA的三种剪接方式：自我剪接内含子能够自发地进行剪接，又分为型内含子和型内含子两个亚类。由蛋白酶参与剪接的内含子主要在 tRNA前体中发现。由 snRNP参与剪接的内含子存在于绝大多数真核细胞的蛋白质基因中。三类内含子的分布表精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 23 页，共 32 页细胞核线粒体质粒自我剪接型rRNAmRNAmRNA rRNA rRNA型 mRNA mRNA tRNA蛋白质剪接tRNAsnRNP剪接 mRNA6.4.4.1 型内含子的自我剪接四膜虫 35S rRNA 前体的剪接反应是型的典型代表。特点是需要鸟苷参与。6.4.4.2 型内含子的自我剪接不需要鸟苷参与，而由其自身结构决定。特点是形成套索内含子。6.4.4.3 蛋白质 ( 核酶）剪接的内含子tRNA 前体在内切酶作用下，把发夹形的内含子切除，然后在连接酶的作用下，连接形成成熟的tRNA。6.4.4.4 核蛋白介导的剪接（真核mRNA 前体内含子的剪接反应）什么是“ snRNP ”？在真核生物的细胞核中，含有大量的小分子RNA ，在天然状态下， 它们以核糖核蛋白粒子形式存在，称为 snRNP 。每种 snRNP通常含有一种或二种RNA分子和 10 种左右的蛋白质。参与剪接反应的snRNP至少有 5 种： U1 、U2、U5和 U4/U6。核 mRNA 前体的剪接机制：U1snRNP结合于内含子的5端； U2snRNP结合到内含子的分支点上；U5snRNP结合到内含子的3端，U4/U6snRNP结合于 U5；U1和 U2结合，形成套索RNA结构； U4释放，内含子左侧切断，5外显子作为独立片段释放；内含子的3剪接点切断，形成套索内含子，游离出来；5外显子和3外显子连接形成成熟mRNA 。6.4.5 RNA editing 相继在真核生物及病毒中发现-U inserted & deleted in mRNA-U inserted & deleted in mRNA多头绒泡菌线粒体中 C, A, U, 的插入小麦线粒体 ND3 mRNA中 CU,G A;GU;A Isome genes edited with high frequency锥虫 mt coxIII mRNA 407 U inserted in 145 loci 19 U deleted in 9 lociediting mechanism主要在线粒体和病毒中发现Editing 的生物学意义形成 / 删除 AUG, UAA, UAG, UGA 改变 codon 信息扩大编码的遗传信息mRNA editing 较大程度地改变了DNA的遗传信息使该基因的DNA序列仅是一串简略意义模糊的序列（ abbreviated ）或称为隐秘基因、模糊基因中心法则的发展第七章蛋白质的生物合成比 DNA复制和转录更为复杂的过程氨基酸活化与转运-这个过程是在氨基酸活化酶和镁离子作用下把氨基酸激活成为活化氨基酸。起始 -核糖体与mRNA 结合并与氨酰基tRNA 生成起始复合物。延伸 -由于核糖体沿mRNA5 端向3端移动，开始了从N 端向 C 端的多肽合成，这是蛋白质合成过精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 24 页，共 32 页程中速度最快的阶段。终止以及肽链的释放，核糖体从mRNA 上解离，准备新一轮合成反应。参与蛋白合成的RNAmRNA 蛋白质合成的模板蛋白合成的三种RNA tRNA 氨基酸的运输工具 rRNA 蛋白质合成的场所7.1 遗传密码7.1.1 三联子密码的设想 mRNA上每 3 个核苷酸翻译成蛋白质多肽链上的一个氨基酸，这 3个核苷酸就称为一个密码，也叫三联子密码。翻译时从起始密码子AUG 开始，沿mRNA5 3的方向连续阅读直到终止密码子，生成一条具有特定序列的多 mRNA中只有 4 种核苷酸，而蛋白质中有20 种氨基酸，若以一种核苷酸代表一种氨基酸，只能代表 4种(41=4) 。若以两种核苷酸作为一个密码（二联子），能代表42=16 种氨基酸。而假定以3 个核苷酸代表一个氨基酸，则可以有 43=64 种密码，满足了编码20 种氨基酸的需要7.1.2 三联子密码的破译 Francis Crick 等人第一次证实只有用三联子密码的形式才能把包含在由AUGC 四个字母组成遗传信息 （核酸）准确无误地翻译成由20 种不同氨基酸组成的蛋白质序列，实现遗传信息的表达。用吖啶类试剂（诱导核苷酸插入或丢失）处理T4 噬菌体 r 位点上的两个基因，使之发生移码突变，就生成完全不同的、没有功能的蛋白质。如果同时删去3 个核苷酸，翻译出的蛋白质序列不发生变化，只是少了一个氨基酸。另外：对烟草坏死卫星病毒的研究发现，其外壳蛋白亚基由400 个氨基酸组成，相应的RNA片段长1,200 个核苷酸，与三联子密码体系设想正好相吻合。 Nirenberg的实验以均聚物、多聚物等为模板指导多肽的合成。在含有 tRNA、核糖体、 AA-tRNA 合成酶及其它蛋白质因子的细胞抽提物中加入mRNA 或人工合成的均聚物、多聚物作为模板以及ATP 、GTP 、氨基酸等成分时又能合成新的肽链，新生肽链的氨基酸顺序由外加的模板来决定。 1961 年， Nirenberg等人以多聚（U） 作为模板时发现合成了多聚苯丙氨酸，从而推出 UUU 代表苯丙氨酸 （Phe） 。以 poly （C）及 poly （ A）做模板分别得到多聚脯氨酸和多聚赖氨酸。 以特定序列的共聚物为模板指导多肽的合成。以多聚二核苷酸作模板可合成由2 个氨基酸组成的多肽: 5 UGU GUG UGU GUG UGU GUG 3不管读码从U开始还是从G开始，都只能有UGU （Cys）及 GUG （ Val ）两种密码子。 以共聚三核苷酸作为模板可得到有3 种氨基酸组成的多肽。如以多聚 （UUC ）为模板， 可能有 3 种起读方式：5 UUC UUC UUC UUC UUC3或 5 UCU UCU UCU UCU UCU3 或 5 CUU CUU CUU CUU CUU3分别产生UUC （ Phe） 、UCU （Ser）或 CUU （Leu） 。多聚三核苷酸为模板时也可能只合成2 种多肽： 5 GUA GUA GUA GUA GUA 3或 5 UAG UAG UAG UAG UAG3 或 5 AGU AGU AGU AGU AGU3由第二种读码方式产生的密码子UAG 是终止密码，不编码任何氨基酸，因此，只产生GUA （Val ）或 AGU （Ser 以随机多聚物指导多肽合成。例如， 以只含 A、C的多聚核苷酸作模板，任意排列时可出现8 种三联子， 即 CCC 、CCA 、CAC 、ACC 、CAA 、ACA 、AAC 、AAA ，获得由Asn、His 、Pro、Gln、Thr、 Lys 等 6 种氨基酸组成的多肽。 核糖体结合技术的证明在含核糖体、AA-tRNA 的反应液中加入人工合成的三核苷酸如UUU 、UCU 、UGU 等，保温后通过硝酸纤维素滤膜。加入三核苷酸可以促使其对应的AA-tRNA 结合到核糖体上。游离的AA-tRNA 因相对分子质量小可以通过滤膜，而与核糖体结合的AA-tRNA则留在滤膜上，这样可把已结合与未结合的AA-tRNA分开。7.1.3 遗传密码的特点连续性简并性与偏爱性通用性与专一性（特殊性）终止密码密码子与反密码子简并性： 由一种以上密码子编码同一个氨基酸的现象。18 种氨基酸都有一个以上的密码子。同义密码子。只有精氨酸是个例外，因为在真核生物中CG双联子出现的频率较低，所以尽管有4 个密码子同时编码，蛋白质精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 25 页，共 32 页中精氨酸的使用率仍不高。密码子使用偏爱性几乎在所用的简并密码子家族中，都有一个或者两个是优先使用的偏爱密码子；有一些密码子在各种不同基因中（不管其编码的蛋白质的丰度如何）都是最常用的，例如CCG便是编码Pro 的 4种同义密码子中优先使用的密码子；高表达活性的基因往往比低表达活性的基因呈现高程度的密码子偏爱性；简并密码子的使用频率通常反映着它们相应的tRNA 的丰度。密码子使用偏爱性的原因同工 tRNA在细胞中有丰度差异，使用频率高的密码子由丰度高的相应tRNA 负责译码，反之亦然；在某些物种中，密码子的偏爱性与以嘧啶碱基（C和 U）结尾的密码子之间的非随机选择有关。密码子使用偏爱性对基因表达效率的影响由于物种使用密码子的偏爱性不同，使得那些使用大肠杆菌罕用密码子的真核基因很难在大肠杆菌中有效表达，正是外源基因不同类型密码子的使用频率，使蛋白质的表达水平在质和量两个方面都受到影响。密码子的通用性与特殊性遗传密码不管在体内还是体外，不管是对病毒、细菌、动物还是植物都是适用的，大量事实证明生命世界从低等到高等，都使用几乎完全相同的一套密码，这是密码子的通用性( 普遍性 ) 。特殊性在支原体中， 终止密码子UGA被用来编码色氨酸， 在嗜热四膜虫中， 另一个终止密码子UAA被用来编码谷氨酰胺。对人、牛及酵母线粒体DNA序列和结构的研究还发现，在线粒体中也有不少例外情况。线粒体与核DNA密码子使用情况的比较密码子和反密码子的相互作用：在蛋白质生物合成过程中，tRNA 的反密码子在核糖体内是通过碱基的反向配对与mRNA 的密码子相互作用的。 1966 年， Crick根据立体化学原理提出摆动假说(wobble hypothesis)，解释了反密码子中某些稀有成分 ( 如 I) 的配对，以及许多氨基酸有2 个以上密码子的问题。摆动假说1. 任意一个密码子的前两位碱基都与tRNA 反密码子中的相应碱基形成Watson-Crick碱基配对。2. 反密码子第一位是A或 C时，只能识别一个密码子。当反密码子第一位是U或 G时，能识别两个密码子。当Inosine （I ）作为反密码子第一位时，能识别三个密码子。3. 如果数个密码子同时编码一个氨基酸，凡是第一、二位碱基不相同的密码子都对应于各自的tRNA。4. 根据上述规则，至少需要32 种不同的 tRNA才能翻译61 个密码子。密码子使密码子使用规律原核生物中大部分以AUG为起始密码子，少数使用GUG ，真核生物则全部使用AUG为起始密码子，而终止密码子UAA 、UAG 、 UGA全部被使用，有时连用两个密码子，以便更保险地终止肽链合成。在哺乳动物中，对同义密码子的使用差异甚大，有的广泛使用，有些则有所偏爱。在大肠杆菌中，以C、U为结尾的同义密码，若前两个碱基为A、 U，则第三位碱基优先使用C 而不是 U，若前两个碱基为C、G，则优先使用U 。例： AUC为异亮氨酸的遗传密码，在tRNA 中其相应的反密码应为 AUAG BTAG CGAU DGAT 7.2 tRNA （aa 的运输工具）7.2.1 tRNA的结构由于链内的碱基互补配对，tRNA呈现三叶草形的二级结构。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 26 页，共 32 页由不超过100 个核苷酸组成，稀有碱基和修饰碱基受体臂（ acceptor arm）: 主要由链两端序列碱基配对形成的杆状结构和3端末配对的3-4 个碱基所组成，其 3端的最后3 个碱基序列永远是CCA 。TC臂是根据3 个核苷酸命名的，其中表示拟尿嘧啶，是tRNA分子所拥有的稀有核苷酸。反密码子臂是根据位于茎环中央的三联反密码子命名的。D臂是根据它含有二氢尿嘧啶（dihydrouracil）命名的。 tRNA 的三级结构-aa accept arm 位于“ L”的一端，契合于核糖体的P位点和 A位点 , 以利肽键的形成-anti-codon arm 位于” L”另一端，与结合在核糖体小亚基上的codon of mRNA 配对- TC loop & DHU loop 位于“ L”两臂的交界处，利于“ L”结构的稳定- “L”结构中碱基堆积力大使其拓扑结构趋于稳定 wobble base 位于“ L”结构末端堆积力小自由度大，使碱基配对摇摆7.2.2 tRNA的功能tRNA 在蛋白质合成中处于关键地位。tRNA 的功能：运输的工具，运载aa; 解读 mRNA 的遗传信息。它不但为将每个三联子密码翻译成氨基酸提供了接合体，还为准确无误地将所需氨基酸运送到核糖体上提供了载体。转录过程是遗传信息从一种核酸分子（DNA ）转移至另一种结构上极为相似的核酸分子（RNA ）的过程，信息转移靠的是碱基配对。翻译阶段遗传信息从mRNA 分子转移到结构极不相同的蛋白质分子，信息是以能被翻译成单个氨基酸的三联子密码形式存在的，在这里tRNA起的是解码作用。所有的 tRNA 都能够与核糖体的P 位点和 A 位点结合，此时，tRNA 分子三叶草型顶端突起部位通过密码子: 反密码子的配对与mRNA 相结合，而其3末端恰好将所转运的氨基酸送到正在延伸的多肽上。7.2.3 tRNA的种类1）起始 tRNA 和延伸 tRNA 能特异地识别mRNA 模板上起始密码子的tRNA叫起始 tRNA，其他 tRNA统称为延伸tRNA。原核生物起始tRNA携带甲酰甲硫氨酸（fMet ） ，真核生物起始tRNA携带甲硫氨酸（Met） 。（2）同工 tRNA 代表同一种氨基酸的tRNA称为同工tRNA， 同工 tRNA既要有不同的反密码子以识别该氨基酸的各种同义密码，又要有某种结构上的共同性，能被相同的氨基酰-tRNA 合成酶识别。（3）校正 tRNA 校正 tRNA分为无义突变及错义突变校正。无义突变 : 在蛋白质的结构基因中，一个核苷酸的改变可能使代表某个氨基酸的密码子变成终止密码子（UAG 、UGA 、UAA ） ，使蛋白质合成提前终止，合成无功能的或无意义的多肽错义突变是由于结构基因中某个核苷酸的变化使一种氨基酸的密码变成另一种氨基酸的密码。错义突变的校正tRNA通过反密码子区的改变把正确的氨基酸加到肽链上，合成正常的蛋白质。（摆动原理现象）7.3 氨酰 -tRNA 合成酶蛋白质合成的真实性主要决定于AA- tRNA合成酶是否能使氨基酸与对应的tRNA相结合。 AA-tRNA合成酶既要能识别 tRNA，又要能识别氨基酸，它对两者都具有高度的专一性。tRNA 的 3端有 -CCA-OH的结构，是接受aa 的位置。形成氨基酸活化形式aa-tRNA 的过程是由aa-tRNA 合成酶催化，消耗ATP的情况下进行的。形成 aa-tRNA 的两个步骤：氨基酸接受ATP ，形成氨基酰腺苷一磷酸。氨基酰腺苷一磷酸和tRNA形成 aa-tRNA 氨酰 tRNA合成酶帮助使氨基酸结合到特定的tRNA上， 氨酰 tRNA合成酶参与氨基酸与tRNA结合的二步反应。a、氨基酸 ATP 氨酰 AMP Ppi （活化）b、氨酰 AMP tRNA 氨酰 tRNA AMP 氨酰 tRNA合成酶催化的反应是可逆的，其作用在于： a 、氨基酸与tRNA分子的结合使得氨基酸本身被活化，利于下一步肽健形成的反应。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 27 页，共 32 页 b 、tRNA可以携带氨基酸到mRNA 的特定部位，使氨基酸能够被掺入到多肽链的合适位置。(反应的专一性）7.4 核糖体（ ribosome 7.4.1 核糖体是蛋白质合成的部位Paul Zamecnik等人证实核糖体是细胞中蛋白质合成的场所。他们把放射性标记的氨基酸注射到大鼠体内，经过一段时间后收获其肝脏，进行蔗糖梯度沉淀并分析各种细胞成份中的放射性蛋白质。如果注射后经数小时（或数天）收获肝脏，所有细胞成份中都带有放射性标记的蛋白质; 如果注射后几分钟内即收获肝脏，那么，放射性标记只存在于含有核糖体颗粒的细胞质成份中。7. 4 . 2 核糖体的组成和结构核糖体由大小不同的两个亚基组成，每个亚基包含一个主要的rRNA分子和若干蛋白质分子。核糖体来 源大亚基小亚基沉降系数 RNA 沉降系数 RNA 80S 脊椎动物 60S 2029S 40S 18S 5S 5.8S 80S 无脊椎动物 60S 25S 40S 1618S 植物 5S 5.8S 70S 原核生物 50S 23S 30S 16S 5S 不同生物核糖体组成和特性比较7.4.3 rRNA rRNA在形成核糖体的结构与功能起着重要作用。5S rRNA 有两个保守序列：CGAAC 是其与 tRNA相互识别的序列；GCGCCGAAUGGUAGU 是识别 23S rRNA 的序列。是5S rRNA 与 50S 大亚基相互作用的位点。16S rRNA 在 30S 小亚基内，也有两个保守序列：ACCUCCUUA 是与 mRNA 的 5端 SD序列互补的序列； SD 序列：原核 mRNA 的起始密码子AUG 上游 -10 区有一段可与核糖体结合、富含 GC的 3-9 个核苷酸的共同序列，一般为 .AGGA.。在靠近3 处还有一段识别23S rRNA 的序列（互补） 。23S rRNA：在大亚基内，有一段与5S rRNA 上 12 核苷酸互补的序列。5.8S rRNA ：是真核生物大亚基上特有的rRNA ，含有与原核生物5S rRNA 中的 CGAAC 保守序列，是与tRNA 相互作用的识别序列。18S rRNA：真核生物小亚基上， 3 端与 16S rRNA 有广泛同源的核苷酸序列。28S rRNA：目前功能不详。7.4.4 核糖体的活性中心核糖体上必须至少有5 个以上的活性中心1）mRNA 结受部位（在小亚基上）。2）结合或接受AA tRNA 部位（ A位） （在大亚基上） 。3）结合或接受肽基tRNA 的部位。4）肽基转移部位（P位） （在大亚基上） 。5）肽健形成部位（转肽酶中心）等。7.5 与蛋白质合成有关的因子蛋白质的生物合成还要求有各种蛋白质因子的参与，包括起始因子、延伸因子和释放因子。7.5.1 E.coli的蛋白因子7.5.1.1 起始因子IF-1 分子量为9.5kd ，对 IF-2 和 IF-3 的活性有促进作用。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 28 页，共 32 页IF-2分子量为 30-12kd, 介导 fMet-tRNAfMet （原核生物起始tRNA携带甲酰甲硫氨酸fMet ） 与 30S亚基的结合，由 GTP供能。IF-3与 30S 亚基结合，保持其稳定性，并促使30S 亚基与 mRNA 结合。7.5.1.2 延伸因子有 EF-Tu、EF-Ts、EF-G等。EF-Tu负责把 AA-tRNA带到核糖体的A位点。 EF-Tu + GTP EF-Tu.GTP.AA-tRNA EF- Tu.GDP EF-Ts 可以使 EF-Tu.GDP 再生为 EF-Tu.GTP 。EF-G 是一种依赖于核糖体的GTP酶，负责延伸中的移位。7.5.1.3 释放因子功能是识别终止密码子，终止肽链的合成并释放核糖体。需要 GTP供能。 通过诱导肽基转移酶把一个水分子而不是氨基酸加到延伸中的肽链上。RF-1 识别密码子UAA 、UAG 。RF-2 识别密码子UAA 、UGA 。RF-3 促进 RF-1 和 RF-2 的功能。7.5.2 真核的蛋白因子真核细胞比原核细胞需要更多的蛋白因子，已发现10 余种功能重要的蛋白因子。7.5.2.1 起始因子功能eIF-1 稳定 40S、mRNA 和 Met-tRNA 复合物eIF-2 形成 GTP-Met-tRNA 起始复合物eIF-2B 促进 eIF-2 的再利用eIF-3 促进 40S小亚基的形成eIF-4A 辅助 mRNA 的结合eIF-4B 识别 mRNA, 具有 ATPase的活性eIF-4C 与 40S 结合，促进80S 复合物形成eIF-4D 不详eIF-4E 帽子结合蛋白，识别帽子结构eIF-45 与 60S亚基结合，释放起始因子7.5.2.2延伸因子 EF-1 帮助 AA-tRNA 进入核糖体EF-2 负责延伸中的移位 7.5.2.3 释放因子eRF 识别 UAG ，UAA ，UGA 7.6 蛋白质合成（翻译）的生物学机制定义：翻译是以mRNA 为模板，按照三联密码子的规则合成多肽链的过程。 Stop codon UAA UAG UGA Start codon AUG Met（甲硫氨酸） GUG Val （颉氨酸） 整个翻译过程包括起始、延伸和终止3 个阶段。肽链合成的方向：多肽链的合成是从N端走向 C端，合成速度极快，大肠杆菌中，一个核糖体每秒钟可延伸20个氨基酸。mRNA 上信息阅读的方向是5-37.6.1 原核 mRNA 的 5端结构原核 mRNA 的起始密码子AUG上游 -10 区有一段可与核糖体结合、富含GC的 3-9 个核苷酸的共同序列，一般为.AGGA.，称为 SD序列。该结构使得结合于核糖体30S 小亚基上的起始tRNA 能够正确地定位于mRNA 的起始密码子AUG处。翻译开始于mRNA 与核糖体的结合蛋白质合成中翻译的开始需要在mRNA 上选择合适位置的起始密码AUG ，这一过程是通过核糖体小亚基与mRNA 的结合。7.6.2 真核 mRNA 的 5端结构 所有的真核mRNA5 端均具有m7GPPPN 的帽子结构。 5 端常有较长的非翻译序列, 叫先导序列。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 29 页，共 32 页 AUG上游的 -3 处经常是嘌呤，常常为A；紧跟 AUG的+4 常常是 G。 第一 AUG规律：当 5端具有数个AUG时，其中只有第一个AUG 作为主要开放阅读框的翻译起始位点。7.6.3 原核生物蛋白质合成的过程氨基酸的活化: tRNA 的 3端有 -CCA-OH的结构，是接受aa 的位置。形成氨基酸活化形式aa-tRNA 的过程是由aa-tRNA 合成酶催化，消耗ATP的情况下进行的。形成 aa-tRNA 的两个步骤：氨基酸接受ATP ， 形成氨基酰腺苷一磷酸。氨基酰腺苷一磷酸和tRNA形成 aa-tRNA。在原核生物中，起始氨基酸是甲酰甲硫氨酸，它由甲硫氨酸经过以下两步反应合成：Met + tRNAfMet + ATP Met-tRNAfMet + AMP + PPi 然后由甲酰基转移酶转移一个甲酰基到Met 的氨基上： N10- 甲酰四氢叶酸 + Met-tRNAfMet 四氢叶酸 + fMet-tRNAfMet在真核生物中，存在两种tRNAMet:tRNAmMet和 tRNAiMet。前者携带的甲硫氨酸只能被掺入正在延伸的肽链中，后者用于起始翻译。7.6.3.1 肽链合成的起始（核糖体在mRNA 上的组装）（细菌）起始所需成分：30S 小亚基模板 mRNA fMet-tRNA fMet 起始因子（ IF）GTP 50S 大亚基Mg2翻译起始分为3 步30S 亚基与 IF-1 、IF-3结合，通过SD序列与 mRNA 模板结合在 IF-2 和 GTP帮助下， fMet-tRNA fMet进入小亚基P位点，反密码子与起始密码子配对与 50S 大亚基结合， GTP水解，释放IF 真核与原核在合成上的共同点：（1）核糖体小亚基结合起始tRNA （2）mRNA 上必须有合适的起始密码子（3）大亚基必须与已经形成复合物的小亚基，起始tRNA、 mRNA 结合。起始还需要非核糖体蛋白的起始因子（initation factor IF）的参与。当 AUG( 或 GUG) 密码子位于核糖体P 位点时，起始才能有效进行，因为只有这时tRNA 才能进入小亚基和mRNA结合所产生的P位点。7.6.3.2 肽链合成的延伸当与起始密码子紧邻的密码子被其氨酰tRNA 上的反密码子识别并结合后，延长反应就开始了。肽链延伸由许多循环组成，每加一个氨基酸就是一个循环，每个循环包括- 进位反应：主要是密码子与反密码子的识别- 转位反应：涉及肽键的形成-移位反应： tRNA 和 mRNA 相对核糖体的移动三个步骤。后续AA-tRNA 与核糖体的结合第二个AA-tRNA 在 EF-Tu 及 GTP的作用下，生成AA-tRNA.EF-Tu.GTP复合物，然后结合到核糖体的A位点。随后GTP被水解释放，通过EF-Ts 再生 GTP ，形成 EF-Tu.GTP 复合物，进入新一轮循环。肽键的生成在肽基转移酶（转肽酶）的催化下，A位点上的AA-tRNA转移到 P位点，与fMet-tRNAfMet上的氨基酸生成肽键。起始tRNA 从核糖体P位点被挤出。该过程不需要能量的输入。移位核糖体向mRNA 的 3端方向移动一个密码子。使第三位的密码子对应于A位点，准备接受新的 AA-tRNA。 移位需要GTP供能和 EF-G因子的参与7.6.3.3 肽链合成的终止在肽链延伸的过程中，当终止密码子出现在核糖体的A位点时， 没有相应的AA-tRNA能与之结合， 而释放因子却能与之结合，引发终止反应。释放因子水解P位点上多肽链与tRNA之间的二酯键；新生的肽链及tRNA从核糖体上释放；核糖体两个亚基解体，蛋白质合成结束。翻译的终止需要释放因子和终止密码子的参加 1、合成好的肽酰 tRNA 的 C端通终止涉及到二方面的解离过程过氨基酸酯键，从tRNA上的解离精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 30 页，共 32 页 2 、mRNA 与核糖体的解离第一过程：需要终止密码子和释放因子（release factors , RFs）第二过程：需要核糖体释放因子（ribosome releasing factor , RRF）细菌含 3 种不同的RF RF-1 识别 UAA和 UAG. RF-2 识别 UAA和 UGA. RF-3 不识别终止密码子，但能刺激另外二个因子的活性. 真核系统中只有一种释放因子-RF可识别 3 种终止密码子。释放因子的作用机理细胞通常无识别终止密码子的tRNA，这种识别以RF来完成。 RF的功能是识别mRNA 上的终止密码子，终止肽链的合成并释放核糖体。其机理是改变大亚基上的肽酰转移酶的专一性，使肽酰转移酶活性变成酯酶活性。它能结合水用于亲核攻击，水解肽键。7.6.4 多聚核糖体上述只是单个核糖体的翻译过程，事实上在细胞内一条mRNA 链上结合着多个核糖体，甚至可多到几百个。蛋白质开始合成时，第一个核糖体在mRNA 的起始部位结合，引入第一个蛋氨酸，然后核糖体向mRNA 的 3端移动一定距离后，第二个核糖体又在mRNA 的起始部位结合，现向前移动一定的距离后，在起始部位又结合第三个核糖体，依次下去，直至终止。两个核糖体之间有一定的长度间隔，每个核糖体都独立完成一条多肽链的合成，所以这种多核糖体可以在一条mRNA 链上同时合成多条相同的多肽链，这就大大提高了翻译的效率。多聚核糖体的核糖体个数，与模板mRNA 的长度有关，例如血红蛋白的多肽链mNRA 编码区有 450 个核苷酸组成，长约 150nm 。上面串连有5-6 个核糖核蛋白体形成多核糖体。而肌凝蛋白的重链mRNA 由 5400 个核苷酸组成，它由 60 多个核糖体构成多核糖体完成多肽链的合成。7.7 蛋白质合成后的加工和转运7.7.1 蛋白质前体的加工 N端fMet或 Met 的切除二硫键的形成特定氨基酸的修饰非功能片段的切除多聚蛋白的切割7.7.2 蛋白质转运机制蛋白质的功能： 结构支持作用酶的催化作用转运和贮存功能运动功能免疫保护功能控制生长和分化代谢调节功能接受和传递信息生物膜功能几类主要蛋白质的运转机制：蛋白性质转运机制主要类型分泌在结合核糖体上合成免疫球蛋白、卵蛋白以翻译 - 转运同步机制运输水解酶、激素细胞器发育在游离核糖体上合成核、叶绿体、线粒体乙醛酸循环体以翻译后转运机制运输过氧化物酶体等细胞器中的蛋白质膜的形成两种机制都有质膜、内质网、类囊体中的蛋白质7.7.2.1 翻译 - 运转同步机制 ( 分泌蛋白途径) 分泌蛋白 : 通过内质网分泌到cell外或细胞间质中的蛋白。游离核糖体：不与细胞内膜结构结合而进行蛋白质合成的核糖体。结合核糖体：与粗面内质网结合的核糖体。信号肽 : 进入内质网的蛋白质N 端有一段长13-36 个氨基酸的疏水性肽段，在成熟的分泌蛋白中并不存在，能够引导多肽链穿过ER膜进入 ER腔，称为信号肽。信号肽的特点：整体上是一段疏水的肽段；信号肽一般位于N端，进入ER膜后被信号肽酶水解；信号肽的中部常常由10-15 个残基构成疏水性核，前端常常有几个带正电荷的碱性氨基酸，后端为含丙氨酸的区域；信号肽酶的水解位点通常是“Ala-X-Ala” ；信号肽可以位于蛋白质分子的各个部位；精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 31 页，共 32 页普遍适用性。信号识别蛋白（SRP ）和 SRP受体蛋白（ DP ）SRP是一个小的RNA-蛋白质复合体 , 它由约 300个核苷酸的RNA 和 6种紧密结合的蛋白质( 分子量从 9KDa到 72KDa)所组成。SRP可以分为两个结构域：（）信号识别结构域, 由 RNA的大约第100 至第 250 个核苷酸部分与19KDa 、54KDa 、68KDa和 72KDa蛋白质所构成。（）由RNA的其余部分与9KDa和 14KDa蛋白质所构成, 其功能是使肽链的延伸暂停, 因而叫做延伸作用制动结构域。SRP的奇特性质是它能够与核糖体相结合并使肽链的延伸暂时受阻, 这一作用只有在新生肽链达到大约70 个氨基酸长时才发生, 因为这时信号序列才从核糖体中冒出来, 而余下的30 个 40 个氨基酸仍然处于核糖体内。SRP对翻译的阻断是暂时的, 当它碰到粗面内质网膜上的72KDa的坞蛋白 docking protein)时, 就不再阻止核糖体的翻译。这时 ,SRP离开核糖体而去识别新的信号序列；而核糖体则通过信号肽与粗面内质网膜相连。7.7.2.2 翻译后转运机制在叶绿体、 线粒体以及过氧化物酶体中有许多蛋白质和酶是由细胞质提供的，其中大都是通过翻译后转运机制进行运输的。线粒体蛋白质的跨膜运输：线粒体有大约700 种蛋白质，其中13 种由线粒体基因编码，其它的由核基因组编码。蛋白质跨线粒体膜的运输过程有如下特点：运输的是翻译结束后的完整蛋白质；通过线粒体膜的蛋白质在运送前以前体形式存在，由成熟蛋白质加上N末端的一段前导肽组成。是一个需能过程。7.7.3 细菌中蛋白质的跨膜绝大多数跨膜蛋白的N端也有大约15-30 个以疏水氨基酸为主的N端信号序列或称信号肽。信号肽的疏水段能形成一段螺旋结构。在信号序列之后的一段氨基酸残基也能形成一段螺旋，两段 - 螺旋以反平行方式组成一个发夹结构, 它很容易进入内膜的脂双层（下图）。这种发夹结构在内膜中立足以后, 肽链的继续合成则使信号序列以后肽链穿过内膜而进人周质。当组成发夹结构的两 - 螺旋之间的部分到达内膜外表面, 位于内膜外表面的信号肽酶signal peptidase将信号序列切除。当蛋白质全部翻译出来之后, 羧端穿过内膜, 在周质中折叠成蛋白质的最终构象。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 32 页，共 32 页