题目题目:恩施黑猪恩施黑猪PTGFR基因基因SNP检检测及遗传多态性分析测及遗传多态性分析学学生：生：毕四海四海指指导老老师：杨军班班级：动科科31002班班核心组成结果与分析小结与讨论致谢材料与方法前言前前言言 我们都知道，母猪有发情周期，其本质是受下丘脑垂体卵巢轴系调控而产生的周而复始的生殖生理变化。 发情周期发情前期发情期发情后期间情期发情前期发情前期黄体进一步液化，卵泡开始发育；发情期发情期卵泡发育成熟；发情后期发情后期成熟卵泡破裂、排卵，黄体开始形成；间情期间情期黄体逐渐发育，并达到最大，孕激素分泌量也随之逐渐达到最高水平，性中枢受到抑制。若是母猪未成功受孕，其子宫内膜产生的前列腺素PGF2通过逆流途径促进黄体退化，使之进入下一个发情周期；反之若母猪妊娠,则转化为妊娠黄体。这种暂时性的分泌器官分泌的孕酮是维持妊娠的主要激素。由于猪的胎盘不能分泌足够的孕酮来维持妊娠，在此不再赘述。 主要激素的变化主要激素的变化雌激素雌激素 妊娠早期,雌激素(Estrogen)主要来源于黄体。随着妊娠期的增长,在母体产生的雌激素以及胎儿皮质醇增加的影响下,胎盘产生的雌激素逐渐增加,分娩时达到最高峰。在分娩前,体内雌激素的水平增高而孕酮浓度下降,导致孕酮与雌激素的比值发生变化,使子宫肌层对催产素的敏感性增高。妊娠期间雌激素可以调节孕酮的合成和分泌。分娩时,雌激素可能可能通过对孕酮的抑制作用、刺激催产素受体的发育、刺激前列腺素的合成和释放增强子宫肌层的自发性收缩。孕酮孕酮在妊娠早期维持妊娠所需的孕酮来自于黄体。妊娠的中后期，孕酮主要作用有五个方面：促进子宫内膜的基质细胞蜕膜化；抑制雌激素和催产素等对子宫肌层的收缩作用,使子宫保持静止,保证胎儿生活在一个平衡稳定的环境中;抑制前列腺素的合成,保持子宫肌层处于静止状态,抑制子宫节律收缩的起始；能够抑制一些与免疫排斥相关的免疫反应；能够抑制T细胞介导的组织感染,赋予着床的胚胎和发育的胎盘免疫能力。动物实验证明,孕酮浓度的降低伴随有PGF2的分泌增多。孕酮浓度降低使抑制子宫肌层收缩的作用被解除。在家畜中,胎儿成熟时分泌的糖皮质激素能够刺激子宫分泌前列腺素,它可以顺着子宫颈进入母体的腹腔溶解黄体。但是临产前和分娩时孕妇的孕酮浓度反而高于妊娠的其他阶段,这有可能可能是由于孕酮受体不同亚型表达比例发生变化,导致孕酮不能够发挥作用。前列腺素前列腺素哺乳动物卵泡颗粒细胞产生的前列腺素是排卵所必需的。通过对前列腺素合成的抑制可以阻止实验动物和非人灵长类的自发排卵和诱发排卵。当内源性的前列腺素合成受阻时,注射前列腺素能够引发排卵。前列腺素是溶解黄体、刺激子宫肌收缩的重要物质。子宫内膜来源的PGF2在流经子宫静脉时通过逆流循环到达卵巢，引起黄体的溶解（Mitchell et al，1995）。高水平的PGF2引起黄体分泌催产素。另外前列腺素对子宫平滑肌有强烈的刺激作用,通过受体使肌肉收缩。敲除PGF2受体基因的小鼠可以正常发育,但不能正常分娩。前列腺素合成酶I(Cycloxygenase-1,COX-1)基因敲除的小鼠不能正常分娩,可能可能是由于黄体的退化受阻造成的(Gibb,1998)。催产素催产素催产素(Oxytixin,OXT)对分娩的发动起重要的但非分娩发动但非分娩发动的启动因子。将已妊娠绵羊或其他实验动物的垂体切除,它们仍然可以按照本身的模式分娩。将小鼠的催产素基因敲除,它仍然有正常的妊娠和分娩过程。分娩开始时血液中的OXT含量变化不大,当胎头通过产道时或者多胎动物产出一仔后,引起反射性的紧张活动,其分泌量才相对增加。妊娠早期,子宫对大剂量催产素也不发生反应,它会受到催产素酶的降解,而到妊娠后期由于降解催产素酶的逐渐消失,仅用少量催产素即可引起子宫强烈收缩。实验证明,妊娠末期子宫对催产素的敏感性可以增加20倍。临产前孕酮分泌量下降,雌激素增多,可以激发催产素的分泌。它还能刺激前列腺素的合成,进一步增强子宫的收缩。 分娩的启动分娩的启动并非单一因素所致,而是由机械扩张、神经及激素等多种因素相互关系!彼此协调所促成。 促肾上腺皮质素释放激素促肾上腺皮质素释放激素（Corticotropin Releasing Hormone，CRH）可能决定分娩的起始，分娩启动前母体的CRH水平达到最高水平。切除羊胎儿的下丘脑、垂体和肾上腺可以阻止分娩,使妊娠期延长。给切除垂体和 肾上腺的胎儿滴注促肾上腺皮质激(Adrenocorticotrophic Hormone,ACTH)或者地塞米松能诱发分娩,而且给妊娠末期的胎羔滴注合成的ACTH或者地塞米松也能诱发早产。 肺泡肺泡表面活性蛋白A(Surfactant Protein A,SP-A)在妊娠完成80%时胎肺开始表达,并在出生前达到最高峰。这有可能是皮质醇促进胎肺的成熟,其分泌的SP-A进入羊水作为巨噬细胞活化和迁移的信号,确保发生炎症反应导致分娩。 有证据表明分娩前的起始与子宫内的炎症反应炎症反应密切相关。胎膜未破的情况下发生的早产大约有30%在妊娠的末期有明显的炎 症。妊娠期的妊娠期的QTL定位定位 QTL是在基因组中占据一定染色体区域,控制某一数量性状的一组微效多基因的集合(或基因簇)。 通过基因组扫描的方法国外学者发现在1号、9号、15号染色体上可能存在控制妊娠期的QTL。但控制猪妊娠期的候选基因研究尚未见报道。根据双直接荧光原位杂交发现人的7、11号染色体与猪的9号染色体是部分同源的,而影响猪妊娠期的一段区域是和人的1号染色体的部分区域是同源的,我们从人的这部分区域寻找妊娠过程中有重要作用的基因Renin和IL-10,与猪妊娠期的相关关系进行研究。本研究的目本研究的目的的是检测影响猪妊娠期长短的候选基因PTGFR（前列腺素F2受体基因）的核酸多态性，并对其遗传多态信息进行分析，为揭示猪的妊娠期的遗传机理打下基础。 材料材料： 40头恩施黑猪来自长江大学动物科学学院实验猪场，耳组织取样。所采集的组织样均放入70%的乙醇中，-20保存。 设备：设备： Sigma常温高速离心机、Sigma冷冻高速离心机、水平电泳槽、电泳仪、低温恒温水浴槽、超纯水仪、梯度PCR仪、凝胶成像系统、海尔超低温冰箱、海尔冰柜、pH计、紫外风光光度计、高压灭菌锅、制冰机、电子天平、电热恒温鼓风干燥箱、美的微波炉、超净工作台、分子杂交炉、可调式微量移液器 药品和试剂：药品和试剂： M Tris-Cl（pH8.0)、0.5M EDTA（pH8.0）、100mM NaCl、50TAE、5M乙酸钾、6M氯化锂、10%APS、EB染色液、10mgml蛋白酶K、TE缓冲液(pH8O)、溴化乙锭（EB）、三羟甲基氨基甲烷（Tris），西班牙琼脂糖（分装）、10mM dNTP Mix、PCR引物由上海捷瑞生物合成，用超纯水配制成25pM/l的工作液，-20保存、无水乙醇、三氯甲烷、异丙醇、乙醚等常规试剂由长江大学动物科学学院动物基础实验室提供。材材料料与与方方法法方法：方法：1、猪耳组织基因组DNA提取 2、基因组DNA样品浓度和纯度检测和稀释 3、PTGFR基因扩增引物设计与合成 4、 PTGFR基因扩增 试剂体体积（l）10PCR Buffer2.5dNTPs1.0PrimerF0.25PrimerR0.25模板模板DNA1.0Taq 0.5ddH2O17.5Total volume23.0PTGFR基因基因PCR反应体系反应体系5、PCR-RFLP分析统计与分析：统计与分析： 基因型频率（Genotypic frequency）和等位基因频率（Allelic frequency） 遗传特性分析试剂剂量倍数PCR reaction mixture10l10BufferBsuR 1Nuclease-free water2l1l18l52104l52l936l酶酶切切反反应应体体系系 1、 恩施黑猪耳部组织基因组恩施黑猪耳部组织基因组DNA提取结果：提取结果： 从恩施黑猪耳部组织所提取的基因组DNA电泳条带清晰，基本没有弥散现象，且点样孔较干净。说明所提取的基因组DNA完整性好，且几乎没有多糖和蛋白质的残留，完全可以用于后续的PCR扩增和酶切反应。 结结果果与与分分析析2、PTGFR基因基因PCR扩增结果：扩增结果： 所合成的引物对40个个体均扩增出了683bp大小片段，且无杂带，可进行后续PCR-RFLP分析。3、PTGFR基因基因PCR-RFLP酶切基因型检测结果：酶切基因型检测结果： PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳和EB染色显影后，检测到3种基因型，条带清晰可辨，两种纯合子分别命名为AA基因型和BB基因型，杂合子为AB基因型。4、恩施黑猪、恩施黑猪PTGFR基因群体遗传学分析基因群体遗传学分析4.1 恩施黑猪恩施黑猪PTGFR基因的基因型频率和等位基因频率：基因的基因型频率和等位基因频率： A、B两等位基因频率完全相等，各占50%。该恩施黑猪群体PTGFR基因位点处于Hardy-Weinberg遗传平衡状态（P0.05）。基因基因型型基因型频率基因型频率等位等位基因基因等位基因频等位基因频 率率卡方值（概率）卡方值（概率）AA0.3778A0.5000AB0.24442.85（P=0.8750）BB0.3778B0.5000恩施黑猪恩施黑猪PTGFR基因频率和基因型频率基因频率和基因型频率4.2恩施黑猪恩施黑猪PTGFR基因多态性分析结果：基因多态性分析结果： 等位基因数与有效等位基因数相等，杂合度0.2444，遗传变异较低，多态性（PIC=0.3750）为中度多态。等位基因数等位基因数（Na）有效等位基因有效等位基因数（数（Ne）杂合度杂合度（He）纯合度纯合度（Ho）多态信息含多态信息含量（量（PIC）22.00000.24440.75560.3750恩施黑猪恩施黑猪PTGFR基因多态性分析基因多态性分析前列腺素对于分娩有着极其重要的作用，PTGFR是前列腺素受体基因，PTGFR核酸序列的变异可能引起前列腺素在动物体内的生物功能变化。恩施黑猪群体中AA、BB型个体相当，AB型个体相对较少，A、B等位基因频率完全相等，均为0.5。整个群体处于遗传平衡状态。本研究中，恩施黑猪群体具有中等程度多态性和中等程度遗传变异度，尚具有继续选择的可能，可进行标记辅助选择。小小结结与与讨讨论论 谨借此机会向悉心指导我的杨军老师致敬，向一直兢兢业业为我们提供方便的各位实验室老师表示衷心的感谢，向大学期间给予我无私帮助和无尽教诲的授业恩师致以最诚挚的感激，同时也要感谢一路陪伴和关心我的同窗们，谢谢你们！致致谢谢