氨基酸发酵的工艺控制培养基pH温度氧培养基培养基1、碳源：、碳源：淀粉水解糖、糖蜜淀粉水解糖、糖蜜、醋酸、乙醇、 烷烃 碳源浓度过高时，对菌体生长不利，氨基酸的转化率降低。 菌种性质、生产氨基酸种类和所采用的发酵操作决定碳源种类2、氮源：铵盐、尿素、氨水、氮源：铵盐、尿素、氨水同时调整pH值。营养缺陷型添加适量氨基酸主要以添加有机氮源水解液。需生物素和氨基酸，以玉米浆作氮源。尿素灭菌时形成磷酸铵镁盐，须单独灭菌。可分批流加。氨水用pH自动控制连续流加3、合适、合适C/N氮源用于调整氮源用于调整pH。合成菌体。合成菌体。生成氨基酸，因此比一般微生物发酵生成氨基酸，因此比一般微生物发酵的的C/N低。低。4、磷酸盐：、磷酸盐：对发酵有显著影响。不足时糖代谢受抑制。5、镁：、镁：是已糖磷酸化酶、柠檬酸脱氢酶和羧化酶的激活剂，并促进葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活力。6、钾：、钾：促进糖代谢。谷氨酸产酸期钾多利于产酸，钾少利于菌体生长。7、钠：调节渗透压作用，一般在调节pH值时加入。8、锰：、锰：是许多酶的激活剂。9、铁：、铁：是细胞色素、细胞色素氧化酶和过氧化氢酶的活性基的组成分，可促进谷氨酸产生菌的生长。10、铜离子：、铜离子：对氨基酸发酵有明显毒害作用。11 生长因子：生物素生长因子：生物素 作用：影响细胞膜透性膜透性和代谢途径代谢途径。 浓度：过多促进菌体生长，氨基酸产量低。过少菌体生长缓慢，发酵周期长。 与其它培养条件的关系：氧供给不足，生物素过量时，转化俄为乳酸发酵。 种类：玉米浆、麸皮水解液、甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜为来源。pH对氨基酸发酵的影响及其控制作用机理：主要影响酶的活性和菌的代谢。控制pH方法：流加尿素和氨水流加方式：根据菌体生长、pH变化、糖耗情况和发酵阶段等因素决定。控制：控制：（1）菌体生长或耗糖慢时，少量多次流加尿素，避免pH过高（2）菌体生长或耗糖过快时，流加尿素可多些，以抑制菌体生长。（3）发酵后期，残糖少，接近放罐时，少加或不加尿素，以免造成氨基酸提取困难。（4）氨水对pH影响大，应采取连续流加。温度对氨基酸发酵的影响及其控制温度对氨基酸发酵的影响及其控制菌体生长达一定程度后再开始产生氨基酸，因此菌体生长最适温度和氨基酸合成的最菌体生长最适温度和氨基酸合成的最适温度是不同适温度是不同的。菌体生长温度过高，则菌体易衰老，pH高，糖耗慢，周期长，酸产量低。采取措施：少量多次流加尿素，维持最适生长温度，减少风量等，促进菌体生长。氧对氨基酸发酵的影响及其控制氧对氨基酸发酵的影响及其控制要求供氧充足的谷氨酸族氨基酸发酵：生要求供氧充足的谷氨酸族氨基酸发酵：生物合成与物合成与TCA循环有关。循环有关。适宜在缺氧条件下进行的亮氨酸、苯丙氨适宜在缺氧条件下进行的亮氨酸、苯丙氨酸和缬氨酸发酵：菌体呼吸受阻时产量最酸和缬氨酸发酵：菌体呼吸受阻时产量最大。大。供氧不足时产酸受轻微影响的天冬氨酸族供氧不足时产酸受轻微影响的天冬氨酸族氨基酸发酵氨基酸发酵发酵工艺实例介绍发酵工艺实例介绍谷氨酸谷氨酸 一、概述一、概述l l工业化生产开始于由水解小麦工业化生产开始于由水解小麦面筋或大豆蛋白质面筋或大豆蛋白质面筋或大豆蛋白质面筋或大豆蛋白质而制而制取。取。l l19571957年年年年，日本率先采用，日本率先采用微生物发酵法微生物发酵法微生物发酵法微生物发酵法生产，并投入大生产，并投入大规模工业化生产，这是被誉为现代发酵工业的重大创规模工业化生产，这是被誉为现代发酵工业的重大创举，使发酵工业进入调节代谢的调控阶段。举，使发酵工业进入调节代谢的调控阶段。l l目前世界产谷氨酸钠目前世界产谷氨酸钠210210吨吨吨吨/ /年，占氨基酸总量的年，占氨基酸总量的年，占氨基酸总量的年，占氨基酸总量的2/32/3。l l我国现有我国现有5050余家生产，年产量达余家生产，年产量达160160万吨万吨万吨，居世界万吨，居世界首位。首位。二、谷氨酸的生物合成机理二、谷氨酸的生物合成机理 1. 1. 谷氨酸谷氨酸 （ - -氨基戊二酸）氨基戊二酸） O C-OH 第一代鲜味剂第一代鲜味剂 H2N- C- H L-L-谷氨酸单钠盐谷氨酸单钠盐味精味精 H-C-H H-C-H H-C O OH L-型谷氨酸谷氨酸谷氨酸谷氨酸脱氢酶脱氢酶脱氢酶脱氢酶NH4抑抑 制制2.2.谷氨酸的生物合成谷氨酸的生物合成（1）EMP:丙酮酸，丙酮酸，ATP,NADH2（2）HMP:6磷酸果糖磷酸果糖 3磷酸甘油醛磷酸甘油醛 NADPH2: 酮戊二酸还原氨基化必需的供氢体。酮戊二酸还原氨基化必需的供氢体。（3）TCA循环循环:生成谷氨酸前体物质生成谷氨酸前体物质 酮戊二酸。酮戊二酸。（4）CO2固定反应固定反应:补充草酰乙酸。补充草酰乙酸。（5）乙醛酸循环）乙醛酸循环:使琥铂酸、延胡索酸和苹果酸的量得使琥铂酸、延胡索酸和苹果酸的量得 到补充，维持到补充，维持TCA循环的正常运转。循环的正常运转。 谷氨酸脱氢酶谷氨酸脱氢酶（6）还原氨基化反应）还原氨基化反应: 酮戊二酸酮戊二酸 谷氨酸谷氨酸丙酮酸丙酮酸回补反应 3.3.谷氨酸生产菌的生化特征谷氨酸生产菌的生化特征 （1 1）有苹果酸酶和丙酮酸羧化酶。）有苹果酸酶和丙酮酸羧化酶。 （2 2） 酮戊二酸脱氢酶活性弱，异柠檬酸脱酮戊二酸脱氢酶活性弱，异柠檬酸脱氢氢 酶活性强，异柠檬酸裂解酶活性弱。酶活性强，异柠檬酸裂解酶活性弱。 （3 3）谷氨酸脱氢酶活性高，经呼吸链氧化）谷氨酸脱氢酶活性高，经呼吸链氧化NADPHNADPH2 2 的能力弱。的能力弱。 （4 4）菌体本身利用谷氨酸的能力低。）菌体本身利用谷氨酸的能力低。 4.4.谷氨酸产生菌（全是细菌）谷氨酸产生菌（全是细菌） 棒杆菌属棒杆菌属 北京棒杆菌北京棒杆菌 C. C. pekinensepekinense CorynebacteriumCorynebacterium 钝齿棒杆菌钝齿棒杆菌 C. C. crenatumcrenatum 谷氨酸棒杆菌谷氨酸棒杆菌 C. C. glutamicumglutamicum 短杆菌属短杆菌属 黄色短杆菌黄色短杆菌 B. B. flvumflvum BrevibacteriumBrevibacterium 产产氨短杆菌氨短杆菌 B. B. ammoniagenesammoniagenes 小小杆菌属杆菌属 嗜氨小杆菌嗜氨小杆菌 M. M. ammoniaphilumammoniaphilum MicrobacteriumMicrobacterium 节杆菌属节杆菌属 球形节杆菌球形节杆菌 A.A. globiformisglobiformis ArthrobacterArthrobacter 共同点：共同点： 1 1）革兰氏阳性。）革兰氏阳性。 2 2）不形成芽孢。）不形成芽孢。 3 3）没有鞭毛，不能运动。）没有鞭毛，不能运动。 4 4）需要生物素作为生长因子。）需要生物素作为生长因子。 5 5）在通气条件下产谷氨酸（需氧微生物）。）在通气条件下产谷氨酸（需氧微生物）。三、谷氨酸发酵的工艺控制三、谷氨酸发酵的工艺控制 培养基培养基 1. 1. 碳源：淀粉水解糖、糖蜜、乙醇、烷烃碳源：淀粉水解糖、糖蜜、乙醇、烷烃 （1 1）淀粉水解糖的制备）淀粉水解糖的制备 （2 2）糖蜜原料）糖蜜原料（1）淀粉水解糖的制备：酸水解淀粉水解糖的制备：酸水解1、调浆调浆：干淀粉用水调成淀粉乳，加盐酸0.5-0.8至pH1.5。2、糖化糖化：蒸汽加热，加压糖化25min。冷却至80下中和。3、中和：中和：烧碱中和，至pH4.0-5.04、脱色：脱色：活性炭脱色和脱色树脂。活性炭用量为0.6-0.8，在70及酸性条件下搅拌后过滤。酶法糖化：以大米或碎米为原料时采用工艺流程：大米清洗 浸泡粉碎调浆液化添酶压滤（调浆）滤液加酸调pH 1.8糖化中和脱色压滤糖液（2）糖蜜原料：不宜直接用来作为谷氨酸发酵的碳源，因含丰富的生物素。预处理方法：活性碳或树脂吸附法和亚硝酸法吸附或破坏生物素。也可以在发酵液中加入表面活性剂吐温60或添加青霉素。 2.2.氮源：铵盐、尿素、氨水氮源：铵盐、尿素、氨水 C/NC/N100100：1515 2121，实际高达实际高达100100：2828 因为：因为：1 1）用于调整）用于调整pHpH。 2 2）分解产生分解产生的的NHNH3 3从发酵液中逸出。从发酵液中逸出。 产酸阶段：产酸阶段： NHNH4 4+ +不足不足：使：使 - -酮戊二酸蓄积而很少有谷氨酸生成。酮戊二酸蓄积而很少有谷氨酸生成。 NHNH4 4+ +过量：促使谷氨酸生成谷氨酰胺。过量：促使谷氨酸生成谷氨酰胺。3.3.无机盐：磷酸盐、镁、钾、钠、铁、锰、铜，其中无机盐：磷酸盐、镁、钾、钠、铁、锰、铜，其中 磷酸盐对发酵有显著影响：磷酸盐对发酵有显著影响： 不足：糖代谢受抑制，菌体生长不足。不足：糖代谢受抑制，菌体生长不足。 过多：过多：a.a.细胞膜磷脂生成量多，不利于谷氨酸排出。细胞膜磷脂生成量多，不利于谷氨酸排出。 b.b.促使丙酮酸和乙醛（由丙酮酸脱羧生成）缩促使丙酮酸和乙醛（由丙酮酸脱羧生成）缩 合生成缬氨酸的前体物合生成缬氨酸的前体物 乙醛乳酸，乙醛乳酸， 使使缬氨酸在发酵液中蓄积。缬氨酸在发酵液中蓄积。 4. 4. 生长因子：生物素生长因子：生物素 作用：影响细胞膜通透性和代谢途径。作用：影响细胞膜通透性和代谢途径。 （1 1）作为催化脂肪酸生物合成最初反应的关键酶乙酰）作为催化脂肪酸生物合成最初反应的关键酶乙酰 CoACoA的辅酶，参与脂肪酸的生物合成，进而影响的辅酶，参与脂肪酸的生物合成，进而影响 磷酯的合成。磷酯的合成。 （2 2）浓度过大：促进菌体生长，谷氨酸产量低。因为：）浓度过大：促进菌体生长，谷氨酸产量低。因为： a.a.乙醛酸循环活跃，乙醛酸循环活跃， - -酮戊二酸生成量减少。酮戊二酸生成量减少。 b.b.转氨酶活力增强，谷氨酸转变成其它氨基酸。转氨酶活力增强，谷氨酸转变成其它氨基酸。（二）（二）pHpH的影响及其控制的影响及其控制 作用机理：主要影响作用机理：主要影响酶的活性和菌的代谢酶的活性和菌的代谢。 在氮源供应充分和微酸性条件下，谷氨酸发在氮源供应充分和微酸性条件下，谷氨酸发酵转向谷氨酰胺发酵。酵转向谷氨酰胺发酵。 pHpH控制在中性或微碱性。控制在中性或微碱性。 方法：流加尿素和氨水。方法：流加尿素和氨水。（三）温度的影响及其控制（三）温度的影响及其控制菌体菌体生长达一定程度后开始产生氨基酸，菌体生长达一定程度后开始产生氨基酸，菌体生长最适温度和氨基酸合成的最适温度不同。生长最适温度和氨基酸合成的最适温度不同。菌体生长阶段：菌体生长阶段：3030 3434产酸阶段：产酸阶段：3434 3636控制控制因子因子产物产物氧氧( (不足不足) )乳酸或琥珀酸乳酸或琥珀酸 谷氨酸谷氨酸( (充足充足) -) -酮戊二酸酮戊二酸( (过量过量) ) NHNH+ +4 4( (不足不足)-)-酮戊二酸酮戊二酸 谷氨酸谷氨酸( (适量适量) ) 谷氨酰胺谷氨酰胺( (过量过量) )生物生物素素谷氨酸谷氨酸 ( (限量限量) ) 乳酸或琥珀酸乳酸或琥珀酸( (充足充足) )pHpH( (酸性酸性)N-)N-乙酰乙酰- -谷氨酰胺谷氨酰胺 谷氨酸谷氨酸( (中性或微碱性中性或微碱性) ) 磷酸磷酸盐盐( (适量适量) )谷氨酸谷氨酸 缬氨酸缬氨酸 环境条件引起谷氨酸合成的代谢转换环境条件引起谷氨酸合成的代谢转换 菌种扩大培养菌种扩大培养1、斜面培养：主要产生菌是棒状杆菌属、短杆菌属、小杆菌属、节杆菌属。 我国各工厂目前使用的菌株主要是钝齿钝齿棒杆菌和北京棒杆菌棒杆菌和北京棒杆菌及各种诱变株。 生长特点：适用于糖质原料，需氧，以生物素为生长因子。 斜面培养基：蛋白胨、牛肉膏、氯化钠组成的pH7.0-7.2琼脂培养基，32培养18-24h。 2、一级种子培养：由葡萄糖、玉米浆、尿素、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸铁及硫酸锰组成。pH6.5-6.8。1000ml装200-250ml振荡，32 培养12h。3、二级种子培养：用种子罐培养，料液量为发酵罐投料体积的1，用水解糖代替葡萄糖，于32 进行通气搅拌7-10h。种子质量要求：二级种子培养结束时，无杂菌或噬菌体污染，菌体大小均一，呈单个或八字排列。活菌数为108-109 /ml。 谷氨酸发酵1、适应期：尿素分解出氨使、适应期：尿素分解出氨使pH上升。糖不利用。上升。糖不利用。2-4h。 措施：接种量和发酵条件控制使适应期缩短。措施：接种量和发酵条件控制使适应期缩短。2、对数生长期：糖耗快，尿素大量分解使、对数生长期：糖耗快，尿素大量分解使pH上上升，氨被利用升，氨被利用pH又迅速下降。溶氧急剧下降后又迅速下降。溶氧急剧下降后维持在一定水平。菌体浓度迅速增大，菌体形态维持在一定水平。菌体浓度迅速增大，菌体形态为排列整齐的八字形。不产酸。为排列整齐的八字形。不产酸。12h。 措施：及时供给菌体生长必须的氮源及调节措施：及时供给菌体生长必须的氮源及调节pH，在，在pH7.5-8.0时流加尿素；维持温度时流加尿素；维持温度30- 323、菌体生长停滞期：谷氨酸合成。 措施：提供必须的氨及pH维持在7.2-7.4。大量通气，控制温度34-37 。4、发酵后期：菌体衰老，糖耗慢，残糖低。 措施：营养物耗尽酸浓度不增加时，及时放罐。 发酵周期一般为30h。下游过程下游过程（一）谷氨酸的提取方法（一）谷氨酸的提取方法 1.1.等电点沉淀法等电点沉淀法 操作简单，收率60。周期长， 占地面积大。2. 2. 不溶性盐沉淀法不溶性盐沉淀法（1 1）锌盐法）锌盐法谷氨酸锌离子谷氨酸锌离子 谷氨酸锌沉淀谷氨酸锌沉淀 溶液溶液 谷氨酸结晶谷氨酸结晶pH6.3加酸加酸pH2.4（2 2）盐酸盐法：）盐酸盐法： GluGlu在浓盐酸中生成并析出谷氨酸盐酸盐。在浓盐酸中生成并析出谷氨酸盐酸盐。 这是用盐酸水解面筋生产谷氨酸的原理。这是用盐酸水解面筋生产谷氨酸的原理。（3 3）钙盐法：）钙盐法： 高温谷氨酸钙溶解度大，与菌体等不溶性杂质高温谷氨酸钙溶解度大，与菌体等不溶性杂质 分开，降温，析出谷氨酸钙沉淀，加分开，降温，析出谷氨酸钙沉淀，加NaHCONaHCO3 3 直接得直接得 到味精。到味精。 3.3.离子交换法离子交换法 用阳离子交换树脂吸附谷氨酸形成的阳用阳离子交换树脂吸附谷氨酸形成的阳离子，再用热碱（离子，再用热碱（ 60 60 4% 4% NaOHNaOH ）洗脱，洗脱，收集相应流分，加盐酸结晶。收集相应流分，加盐酸结晶。 GA+ GA GA- GA= 12 pI 谷氨酸是酸性氨基酸，含谷氨酸是酸性氨基酸，含2 2个羧基个羧基1 1个个氨基，与阴离子交换树脂要比与阳离子交换氨基，与阴离子交换树脂要比与阳离子交换树脂强，但阴离子机械强度差，价格贵，因树脂强，但阴离子机械强度差，价格贵，因而用阳离子交换树脂。而用阳离子交换树脂。 理论上讲发酵液上柱的理论上讲发酵液上柱的pHpH值应低于值应低于3.223.22，但实际上控制在，但实际上控制在5.0 5.0 6.06.0之间，之间，因因NaNa+ +、NHNH4 4+ +交换能力交换能力 谷氨酸，优先交换，谷氨酸，优先交换，置换出置换出H H+ +使使pHpH值低于值低于3.23.2，使谷氨酸成为，使谷氨酸成为阳离子，但不能阳离子，但不能6.06.0。（二）味精制造（二）味精制造 谷氨酸溶于水谷氨酸溶于水活性炭脱色活性炭脱色加加NaNa2 2COCO3 3中和中和谷氨酸单钠（味精粗品）谷氨酸单钠（味精粗品）除铁除铁过滤过滤活性活性炭脱色炭脱色减压浓缩减压浓缩结晶结晶离心分离离心分离干燥干燥成品成品我国味精技术进展情况我国味精技术进展情况制糖工艺进展：制糖工艺进展：酸法水解酸法水解酶酸法水解酶酸法水解双酶法水解。双酶法水解。发酵工艺进展发酵工艺进展：亚适量生物素水平（产酸：亚适量生物素水平（产酸4 46g6gdldl） 高生物素水平（产酸高生物素水平（产酸121215g15gdldl）。）。提取工艺进展提取工艺进展：等电点法（少数锌盐法）：等电点法（少数锌盐法）等电离交法等电离交法 低温连续等电点法（少数厂家采用）。低温连续等电点法（少数厂家采用）。精制工艺进展：精制工艺进展：全粉炭脱色、硫化碱除铁全粉炭脱色、硫化碱除铁颗粒炭脱颗粒炭脱 色、树脂除铁。色、树脂除铁。课课 外外 作作 业业从哪几个方面进行氨基酸发酵的代谢控制？控制细胞膜通透性有几种方法？