基因工程的别名基因工程的别名操作环境操作环境操作对象操作对象操作水平操作水平结果结果实质实质DNADNA重组技术、转基因技术重组技术、转基因技术生物体外生物体外基因基因DNADNA分子水平分子水平人类需要的新的生物类型或生物产品人类需要的新的生物类型或生物产品基因重组基因重组一、基因工程的概念一、基因工程的概念优点：优点：克服远缘杂交不亲和的障碍克服远缘杂交不亲和的障碍定向改造生物的遗传性状定向改造生物的遗传性状与杂交育种相比与诱变育种相比1 1基因拼接的理论基础（从结构上分析，为基因拼接的理论基础（从结构上分析，为什么不同生物的什么不同生物的DNADNA能够能够重组重组? ?）(1)DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸。的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸。(2)双链双链DNA分子都是规则的双螺旋结构。分子都是规则的双螺旋结构。一、基因工程诞生的理论基础一、基因工程诞生的理论基础 2 2外源基因在受体内外源基因在受体内表达表达的理论基础的理论基础(1)(1)基因是控制生物性状的独立遗传单位。基因是控制生物性状的独立遗传单位。(2)(2)遗传信息的传递都遵循中心法则。遗传信息的传递都遵循中心法则。(3)(3)生物界共用一套遗传密码。（遗传密码破译）生物界共用一套遗传密码。（遗传密码破译）识别双链识别双链DNADNA分子的某种分子的某种特定的核苷酸序列特定的核苷酸序列，并，并且使每一条链中且使每一条链中特定部位特定部位的两个核苷酸之间的的两个核苷酸之间的磷酸二酯键磷酸二酯键断开。断开。( (6 6个个, ,4 4、5 5、8 8个个) ) （2 2）作用：）作用：（4 4）结果：）结果：形成两种末端形成两种末端黏性末端黏性末端平末端平末端1 1、限制酶、限制酶“分子手术刀分子手术刀”（小结）（小结）切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性核酸内切酶。磷酸二酯键磷酸二酯键大本大本考向对练考向对练（2）书写）书写限制酶存在于原核生物中的作用是什么限制酶存在于原核生物中的作用是什么? ?思考思考原核生物容易受到原核生物容易受到外源外源DNA的入侵的入侵限制酶的作用限制酶的作用:切割切割外源外源DNA,使之失效使之失效限制酶为什么不会剪切原核生物本身的限制酶为什么不会剪切原核生物本身的DNA?DNA?思考思考防御机制防御机制1.原核生物中不存在该酶的识别原核生物中不存在该酶的识别序列序列2.识别序列被修饰，让限制酶识别序列被修饰，让限制酶不能切割不能切割 如在如在甲基化酶甲基化酶 的作用下把甲基转移到碱基上的作用下把甲基转移到碱基上要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？个切口？可产生几个黏性末端？提问提问要切两个切口，产生四个黏性末端。如果把限制酶来切割的黏性末端能相连，那么这两如果把限制酶来切割的黏性末端能相连，那么这两种酶必须满足的条件是？种酶必须满足的条件是？这两种酶切割的片段会产生相同的黏性末端，双酶切指用两种限制酶分别切割切割目的基因和载双酶切指用两种限制酶分别切割切割目的基因和载体，这样做的优点是？体，这样做的优点是？防止目的基因和载体的自身环化，并防止目的基因的反向连接，从而确保目的基因定向插入到特定位置2.2.“分子缝合针分子缝合针”DNADNA连接酶连接酶 (2)分类分类注意书写注意书写E.Coli DNAE.Coli DNA连接酶连接酶T T4 4 DNADNA连接酶连接酶想一想想一想:DNA连接酶与连接酶与DNA聚合酶功能的异同？聚合酶功能的异同？(1)(1)来源：来源： (2)(2)作用：作用：(1)(1)来源：来源：(2)(2)作用：作用：(1)(1)作用：作用：恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键磷酸二酯键。大肠杆菌大肠杆菌“缝合缝合”黏性末端黏性末端T4T4噬菌体噬菌体“缝合缝合”黏性末端和平末端黏性末端和平末端DNADNA聚合酶聚合酶DNADNA连接酶连接酶区别区别2 2相同点相同点DNA连接酶与连接酶与DNA聚合酶功能的异同聚合酶功能的异同将将单个核苷酸单个核苷酸连接到连接到已有的核酸片段上。已有的核酸片段上。形成形成磷酸二酯键磷酸二酯键以以一条一条DNADNA链为模板链为模板。将将两个双链两个双链DNADNA片段片段之之间的间的切口连接切口连接起来。起来。不需要模板不需要模板。为什么要用载体？为什么要用载体？3.3. “分子运输车分子运输车” 基因进入受体细胞的基因进入受体细胞的载体载体：1 1、无法复制（原因）无法复制（原因）2 2、无法表达、无法表达（原因）（原因）3 3、目的基因是否进入到受体细胞需要借助、目的基因是否进入到受体细胞需要借助于载体上的于载体上的标记基因标记基因简单快速的简单快速的检测检测出来。出来。4 4、基因、基因直接进入直接进入细胞的概率很低；细胞的概率很低；作为载体必须具备哪些条件作为载体必须具备哪些条件1 1）能够在受体细胞中）能够在受体细胞中复制，复制，使目的基因使目的基因稳定存在稳定存在。2 2）具）具一至多个限制酶切点一至多个限制酶切点，以便外源基因，以便外源基因插入插入。3 3）具有）具有某些标记基因某些标记基因，供重组，供重组DNADNA的的鉴定和选择鉴定和选择。天然的天然的DNA分子可以直接作为载体吗？为分子可以直接作为载体吗？为什么？什么？1、载体、载体DNA必须具备自我复制能力必须具备自我复制能力2、载体、载体DNA必须具备一到多个合适的酶切必须具备一到多个合适的酶切位点供目的基因插入。位点供目的基因插入。3、载体、载体DNA必须带有标记基因。必须带有标记基因。4、载体、载体DNA必须安全并大小合适。必须安全并大小合适。实际上天然的实际上天然的DNA并不完全具备上述条件，并不完全具备上述条件，都要进行人工改造。都要进行人工改造。一一.目的基因的获取目的基因的获取1 1、目的基因主要是指、目的基因主要是指 _也也可以是一些具有可以是一些具有调控作用调控作用的因子。的因子。编码蛋白质的结构基因编码蛋白质的结构基因3 3、常用方法：、常用方法：人工合成法人工合成法反转录法反转录法化学合成法化学合成法利用利用PCRPCR技术扩增技术扩增从从基因文库基因文库中获取中获取2 2、获得途径获得途径从自然界已有物种中分离从自然界已有物种中分离人工方法合成人工方法合成基因文库基因文库 基因组文库基因组文库部分基因文库部分基因文库（如（如: :cDNAcDNA文库文库）基因文库？基因文库？(1) (1) 从基因文库中获取目的基因从基因文库中获取目的基因将含有将含有某种生物某种生物不同基因的许多不同基因的许多DNADNA片断，片断，导入到导入到受体菌受体菌的群体中储存，各个受体菌分的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库别含有这种生物的不同基因，称为基因文库基因组文库与基因组文库与cDNAcDNA文库的比较文库的比较P P1010表表文库类型文库类型基因组文库基因组文库cDNAcDNA文库文库大小大小基因中是否有基因中是否有启动子启动子基因中是否有基因中是否有内含子内含子基因多少基因多少物种间的基因物种间的基因交流交流小小大大有有无无有有无无某种生物的全部基某种生物的全部基因因某种生物的部某种生物的部分基因分基因部分基因可以部分基因可以可以可以（2 2）利用）利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因 1 1、定义、定义：PCRPCR多聚酶链式反应多聚酶链式反应 是一项生物体外复制特定是一项生物体外复制特定DNADNA片段的核酸合成技术。片段的核酸合成技术。 通过此技术，可获取大量的目的基因。通过此技术，可获取大量的目的基因。DNADNA复制复制2 2、原理：、原理：3 3、条件：、条件：4 4、过程：、过程：一段已知目的基因的核苷酸序列一段已知目的基因的核苷酸序列一对引物一对引物；模板模板DNADNA；dNTP（脱氧核糖核苷三磷酸）；热稳定热稳定DNADNA聚合酶（聚合酶（TaqTaq酶）；酶）；6 6、仪器：、仪器：PCRPCR扩增仪扩增仪根据这一序列设根据这一序列设计相应的引物计相应的引物为什么？为什么？PCRPCR反应过程反应过程PCR扩增时，退火温度的设定是成败的关键。扩增时，退火温度的设定是成败的关键。退火温度过高会破坏退火温度过高会破坏_的碱基配对。退火温度的设的碱基配对。退火温度的设定与引物长度、碱基组成有关，定与引物长度、碱基组成有关，长度相同但长度相同但_的引物需要设定更高的退火温度。的引物需要设定更高的退火温度。引物与模板引物与模板GC含量高含量高（3 3）人工合成）人工合成 原理原理 （2 2条？）条？）反转录法：反转录法： 目的基因的目的基因的mRNAmRNA杂交双链杂交双链( (单链单链RNA/RNA/单链单链DNA)DNA)单链单链DNADNA逆转录酶逆转录酶DNADNA聚合酶聚合酶双链双链DNADNA(cDNA)(cDNA)根据已知的氨基酸序根据已知的氨基酸序列合成列合成DNADNA法法 ：蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列mRNAmRNA的核苷酸序列的核苷酸序列基因的脱氧核苷酸序列基因的脱氧核苷酸序列推测推测 推测推测目的基因目的基因化学合成化学合成3.3.基因表达载体的组成：基因表达载体的组成：a a、目的基因、目的基因b b、启动子、启动子c c、终止子、终止子d d、标记基因、标记基因为什么不能将基因直接导入受体细胞？为什么不能将基因直接导入受体细胞？位于基因的首端位于基因的首端, ,是是RNARNA聚合酶聚合酶识别识别和结合位点。和结合位点。位于基因的尾端位于基因的尾端, ,终止转录。终止转录。鉴别并筛选含有目的基因的受体细胞鉴别并筛选含有目的基因的受体细胞。2 2、基因表达载体的作用、基因表达载体的作用a a、使目的基因在受体细胞中、使目的基因在受体细胞中稳定存在稳定存在并并遗传遗传给子代给子代b b、同时使目的基因能、同时使目的基因能表达和发挥作用表达和发挥作用三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞目的基因进入目的基因进入_ _内，并且在受体内，并且在受体细胞内维持细胞内维持_ _ _和和_ _的过程。的过程。转化转化: :受体细胞受体细胞稳定稳定表达表达1 1、导入、导入植物细胞植物细胞: :2 2、导入、导入动物细胞动物细胞: :3 3、导、导入微生物细胞入微生物细胞: :常用方法：常用方法：农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法显微注射法显微注射法感受态细胞法（或感受态细胞法（或Ca2+Ca2+转化法）转化法）1、将目的基因导入植物细胞将目的基因导入植物细胞（1 1）农杆菌）农杆菌转化法转化法特点特点: :能感染能感染双子叶植物双子叶植物和和祼子植祼子植物物, ,对单子叶植物无感染能力对单子叶植物无感染能力TiTi质粒的质粒的T TDNADNA可转移至受体可转移至受体细胞并整合到其染色体细胞并整合到其染色体DNADNA上上转化过程转化过程: :TiTi质粒质粒目的基因目的基因构建构建表达表达载体载体导入导入植植物物细细胞胞插入插入植物细胞植物细胞染色染色DNADNA表达表达新新性性状状转入转入农农杆杆菌菌农杆菌的作用？农杆菌的作用？3、将目的基因导入微生物细胞将目的基因导入微生物细胞常用法常用法：常用受体细胞常用受体细胞：大肠杆菌：大肠杆菌微生物作受体细胞原因：微生物作受体细胞原因： 繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少过程：过程：CaCa2+2+处理处理大肠杆菌大肠杆菌感受态感受态细胞细胞表达载体表达载体与感受态与感受态细胞混合细胞混合感受态细胞感受态细胞吸收吸收DNADNA（用用CaCa2+2+处理，增加细菌细胞壁的通透性处理，增加细菌细胞壁的通透性）感受态细胞法（或感受态细胞法（或Ca2+Ca2+转化法）转化法）为什么把大肠杆菌处理成为什么把大肠杆菌处理成感受态细胞？感受态细胞？检测转基因生物染色体的检测转基因生物染色体的DNADNA上是否上是否插入了目的基因插入了目的基因1 1、导入检测、导入检测目的：目的：方法：方法：DNADNA分子杂交技术分子杂交技术过程：过程：.首先取出首先取出转基因生物的基因组转基因生物的基因组DNADNA. .将含目的基因的将含目的基因的DNADNA片段用片段用放射性同放射性同位素等作标记位素等作标记, ,以此做以此做探针探针。使探针和转基因生物的基因组杂交使探针和转基因生物的基因组杂交, ,若若显示出显示出杂交带杂交带, ,表明目的基因已插入染色表明目的基因已插入染色体体DNADNA中中四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定从转基因生物中提取的基因组从转基因生物中提取的基因组DNADNA探针：探针：杂交的对象：杂交的对象：用用放射性放射性同位素标记同位素标记的的含目的基因的含目的基因的DNADNA片段片段1515N N1515N N1414N N探针探针探针探针转基因生转基因生转基因生转基因生物的物的物的物的DNADNA变性变性变性变性变性变性变性变性1414N N2 2、转录检测、转录检测目的：目的：检测目的基因是否转录出了检测目的基因是否转录出了mRNAmRNA方法：方法：分子杂交技术分子杂交技术用放射性同位素标记的用放射性同位素标记的含目的基因的含目的基因的DNADNA片段片段探针：探针：杂交的对象：杂交的对象： 从转基因生物中提取的从转基因生物中提取的mRNA.mRNA.3 3、翻译检测、翻译检测目的：目的：检测目的基因是否翻译成蛋白质检测目的基因是否翻译成蛋白质方法方法: :抗原抗体杂交技术抗原抗体杂交技术从转基因生物中提取的从转基因生物中提取的蛋白质蛋白质抗原：抗原：抗体：抗体：将目的基因编码的蛋白质注射进动物体将目的基因编码的蛋白质注射进动物体内进行免疫产生的相应抗体内进行免疫产生的相应抗体4 4、个体生物学水平的鉴定、个体生物学水平的鉴定 课本课本24 24 用于基因治疗的基因种类用于基因治疗的基因种类正常基因正常基因：从健康人体上分离得到的功能：从健康人体上分离得到的功能正常的基因，用以取代病变基因，或依靠正常的基因，用以取代病变基因，或依靠其表达产物。其表达产物。反义基因反义基因。即通过产生的。即通过产生的mRNAmRNA分子，与病分子，与病变基因产生的变基因产生的mRNA mRNA 进行进行互补互补，来，来阻断阻断非正非正常蛋白质的合成。常蛋白质的合成。自杀基因自杀基因：即编码可以：即编码可以杀死癌变细胞杀死癌变细胞的蛋的蛋白酶基因。白酶基因。(4)(4)对天然蛋白质进行改造，应该直接对蛋对天然蛋白质进行改造，应该直接对蛋白质分子进行操作，还是通过对基因的操作白质分子进行操作，还是通过对基因的操作来实现？来实现？_。原因是：原因是：_。应该通过对基因的操作来实现对天然蛋白质的改造应该通过对基因的操作来实现对天然蛋白质的改造 首先，天然蛋白质都是由基因首先，天然蛋白质都是由基因编码的，改造了基因也就是对蛋白质进行了改编码的，改造了基因也就是对蛋白质进行了改造，而且改造过的蛋白质可以通过改造过的基造，而且改造过的蛋白质可以通过改造过的基因遗传下去。因遗传下去。如果对蛋白质直接改造，一方面蛋白质空间结如果对蛋白质直接改造，一方面蛋白质空间结构复杂，改造困难，即使改造成功，被改造过构复杂，改造困难，即使改造成功，被改造过的蛋白质分子也无法遗传；其次，对基因进行的蛋白质分子也无法遗传；其次，对基因进行改造比对蛋白质直接进行改造要容易操作，难改造比对蛋白质直接进行改造要容易操作，难度要小得多。度要小得多。获取目的基因（例如血清白蛋白基因）获取目的基因（例如血清白蛋白基因）构建基因表达载体（在血清白蛋白基因前加特异表构建基因表达载体（在血清白蛋白基因前加特异表达的启动子）达的启动子）显微注射导入哺乳动物受精卵中显微注射导入哺乳动物受精卵中形成胚胎形成胚胎将胚胎送入母体动物将胚胎送入母体动物发育成转基因动物（只有在产下的雌性个体中，转发育成转基因动物（只有在产下的雌性个体中，转入的基因才能表达）。入的基因才能表达）。 思考思考: :用基因工程技术实现动物用基因工程技术实现动物乳腺生物反应乳腺生物反应器器来生产人类血清白蛋白的操作过程是怎样的？来生产人类血清白蛋白的操作过程是怎样的？ 乳腺生物反应器的优点乳腺生物反应器的优点：产量高；产量高；质量好；质量好； 成本低；成本低；易提取。易提取。