XI. Observation on XI. Observation on cytocytoskeletonskeleton A、dye by Coomassie blue 【Purpose】 掌握用考马斯亮蓝（掌握用考马斯亮蓝（Coomassie blue） R250染色法观察植物细胞骨架染色法观察植物细胞骨架的方法。的方法。 【Principle】细胞骨架细胞骨架(Cytoskeleton) 组成组成：主要包括微：主要包括微管、微丝和中间纤维以及核骨架管、微丝和中间纤维以及核骨架-核纤层体系。核纤层体系。微管主要分布在核周围，呈放射状向四周扩散，微管主要分布在核周围，呈放射状向四周扩散，微丝主要分布于细胞质膜的内侧，而中间纤维微丝主要分布于细胞质膜的内侧，而中间纤维则分布在整个细胞中。则分布在整个细胞中。细胞骨架作用：细胞骨架作用：具有维持细胞形态结构和内部具有维持细胞形态结构和内部结构的有序性、参与细胞运动、物质运输、能结构的有序性、参与细胞运动、物质运输、能量转换、信息传递和细胞分裂等重要功能。量转换、信息传递和细胞分裂等重要功能。细胞骨架的研究方法：细胞骨架的研究方法：考马斯亮兰考马斯亮兰R250染色染色法法、荧光素标记的鬼笔环肽染色法荧光素标记的鬼笔环肽染色法、间接免疫、间接免疫荧光法等。荧光法等。考马斯亮兰考马斯亮兰R250染色法的原理：染色法的原理：考马斯亮蓝考马斯亮蓝R250可以对各种蛋白质进行染色。细胞骨架可以对各种蛋白质进行染色。细胞骨架有一个特性，即用非离子去垢剂（如有一个特性，即用非离子去垢剂（如Triton X-100）处理时，可以保持非溶解状态。当用处理时，可以保持非溶解状态。当用这类试剂处理细胞时，细胞内其它可溶性的这类试剂处理细胞时，细胞内其它可溶性的物质和膜成分都被抽提出来，只留下细胞骨物质和膜成分都被抽提出来，只留下细胞骨架。考马斯亮蓝架。考马斯亮蓝R250虽不能对微丝进行特异虽不能对微丝进行特异性染色，但当其它蛋白成分被抽提后，就能性染色，但当其它蛋白成分被抽提后，就能清晰地显示微丝束的形态。清晰地显示微丝束的形态。Apparatus, material and reagent光学显微镜；烧杯、吸管、镊子、玻片染色光学显微镜；烧杯、吸管、镊子、玻片染色缸、载玻片、盖玻片；缸、载玻片、盖玻片；新鲜洋葱鳞茎新鲜洋葱鳞茎; 6mM磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液（pH6.8）、）、M缓冲液、缓冲液、1%Triton X-100、0.2%考马斯亮蓝考马斯亮蓝R250、3%戊二醛。戊二醛。experiment protocol1、撕取洋葱鳞茎内表皮、撕取洋葱鳞茎内表皮(约约1平方厘米平方厘米)置于置于23ml pH6.8 磷酸缓冲液磷酸缓冲液中待其下沉中待其下沉(烧杯烧杯1) ；2、用、用23ml 1%Triton X-100处理处理20 min(烧杯烧杯1) ；3、吸去、吸去Triton X-100，用，用M缓冲液缓冲液23ml洗洗2次次，每，每次次5 min (烧杯烧杯1) ；4、 23ml 3%戊二醛固定戊二醛固定40 min(烧杯烧杯2) ；5、pH6.8磷酸缓冲液磷酸缓冲液23ml洗洗2次次，每次，每次5 min，滤，滤纸吸去残液纸吸去残液(烧杯烧杯1) ；6、 23ml 0.2%考马斯亮蓝考马斯亮蓝R250染色染色15分钟，然后分钟，然后用蒸馏水小心冲洗用蒸馏水小心冲洗12次次(烧杯烧杯1) ；7、将表皮铺放在载玻片上，加盖玻片，在高倍显微、将表皮铺放在载玻片上，加盖玻片，在高倍显微镜或者油镜下进行观察。镜或者油镜下进行观察。cytoskeletonCytoskeleton of onion cellB、 dye by Rhodamine-Phalloidin【purpose】 熟悉细胞骨架固定染色的方法，掌熟悉细胞骨架固定染色的方法，掌握用荧光标记的鬼笔环肽显示微丝的原握用荧光标记的鬼笔环肽显示微丝的原理和方法。理和方法。【principle】 鬼笔环肽能够特异地与微丝紧密结合。鬼笔环肽能够特异地与微丝紧密结合。荧光标记的鬼笔环肽能够在荧光显微镜荧光标记的鬼笔环肽能够在荧光显微镜下显示微丝的形态和结构。下显示微丝的形态和结构。apparatus, material and reagent试剂试剂 1.细胞骨架稳定液细胞骨架稳定液(CSB ，pH 6.1)：10 mM MES; 138 mM KCl; 3 mM MgCl; 2 mM EGTA; 0.4M 甘甘露醇露醇 2. PBS：含：含0.1% 的的TritonX-100 3.封闭液封闭液：PBS; 0.1% Ttiton X-100; 2% BSA 4.微丝荧光染料微丝荧光染料：0.4 g/ml罗丹明标记的鬼笔环肽罗丹明标记的鬼笔环肽（Rhodamine-Phalloidin） (用封闭液配制；贮存用封闭液配制；贮存液为液为0.2mg/ml，临用前稀释，临用前稀释) 5.封片液封片液： PBS; 0.1% p-phenylenediamine(抗淬灭抗淬灭剂剂); 90% 甘油甘油光学显微镜；烧杯、吸管、镊子、玻片染色光学显微镜；烧杯、吸管、镊子、玻片染色缸、载玻片、盖玻片；缸、载玻片、盖玻片；新鲜洋葱鳞茎新鲜洋葱鳞茎;Experiment protocol1.撕取洋葱内表皮撕取洋葱内表皮,用用5ml含有含有0.25%戊二醛和戊二醛和0.25% Triton X-100的的CSB处理处理1-2分钟分钟(烧杯烧杯1)；2.03.用用5ml含有含有1%戊二醛的戊二醛的CSB固定固定20分钟分钟(烧杯烧杯2) ；4.用用5ml含有含有0.1%NaBH4 和和0.1% Ttiton X-100的的PBS清清 洗洗10分钟分钟(临用前配置临用前配置)(烧杯烧杯3) ；4.用用5ml含有含有0.1% Ttiton X-100的的PBS清洗两遍，每次清洗两遍，每次5分钟分钟(烧杯烧杯4) ；5.用用5ml封闭液处理封闭液处理10分钟分钟(烧杯烧杯4) ；6.用用0.3ml 的的0.4 g/ml荧光染料荧光染料避光避光染色染色20分钟分钟(EP管管)；7.用用5ml含有含有0.1% Triton X-100的的PBS清洗两遍，每次清洗两遍，每次5分钟分钟(烧杯烧杯4) ；8.在载玻片上滴加在载玻片上滴加1-2滴封片液，将洋葱表皮平铺其上，盖滴封片液，将洋葱表皮平铺其上，盖上盖玻片，荧光显微镜下观察。上盖玻片，荧光显微镜下观察。肌肉细胞微丝染色