学习必备欢迎下载基因工程复习题题型：名词解释（10 个） 30 分；填空（每空1 分） 20 分；选择题（每题 1 分）10 分；简答题（4 个） 20 分；论述题（2 个） 20 分。第一章绪论1. 名词解释：基因工程：按照预先设计好的蓝图，利用现代分子生物学技术，特别是酶学技术，对遗传物质 DNA直接进行体外重组操作与改造，将一种生物 （供体） 的基因转移到另外一种生物（受体）中去，从而实现受体生物的定向改造与改良。遗传工程广义： 指以改变生物有机体性状为目标，采用类似工程技术手段而进行的对遗传物质的操作， 以改良品质或创造新品种。包括细胞工程、染色体工程、细胞器工程和基因工程等不同的技术层次。狭义：基因工程。克隆：无性 ( 繁殖 ) 系或纯系。 指由同个祖先经过无性繁殖方式得到的一群由遗传上同一的 DNA分子、细胞或个体组成的特殊生命群体。2什么是基因克隆及基本要点? 3. 举例说明基因工程发展过程中的三个重大事件。A) 限制性内切酶和DNA连接酶的发现（标志着DNA重组时代的开始） ；B) 载体的使用； C) 1970 年，逆转录酶及抗性标记的发现。4. 基因工程研究的主要内容是什么？基础研究：基因工程克隆载体的研究基因工程受体系统的研究目的基因的研究基因工程工具酶的研究基因工程新技术的研究应用研究：基因工程药物研究转基因动植物的研究在食品、化学、能源和环境保护等方面的应用研究第二章基因克隆的工具酶1. 名词解释：限制性核酸内切酶：一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶。回文结构：双链DNA中的一段倒置重复序列，当该序列的双链被打开后，可形成发夹结构。同尾酶：来源不同、识别序列不同，但产生相同粘性末端的酶。同裂酶：不同来源的限制酶可切割同一靶序列和具有相同的识别序列黏性末端： DNA末端一条链突出的几个核苷酸能与另一个具有突出单链的DNA末端通过互补配对粘合，这样的DNA末端，称为粘性末端。平末端： DNA片段的末端是平齐的。限制性核酸内切酶的酶活性单位（U） ：在酶的最适反应条件下，在50l 容积中， 60 分钟内完全切割1 g DNA所需的酶量为1个酶活性单位（unit 或 U）限制性核酸内切酶的星活性：指限制性内切酶在非标准条件下，对与识别序列相似的其它序列也进行切割反应，导致出现非特异性的DNA片段的现象。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 1 页，共 27 页学习必备欢迎下载连杆（ linker） ：化学合成的8 12 个核苷酸组成的寡核苷酸片段。以中线为轴两边对称，其上有一种或几种限制性核酸内切酶的识别序列，酶切后可产生一定的粘性末端，便于与具有相同粘性末端的另一DNA片段连接。衔接头 （adaptor ） ：化学合成的寡核苷酸，含有一种以上的限制性核酸内切酶识别序列。其一端或两端具有一种或两种内切酶切割产生的黏性末端。底物位点优势效应：酶对同一个DNA底物上的不同酶切位点的切割速率不同。激酶：对核酸末端羟基进行磷酸化的酶。2. 说明限制性内切核酸酶的命名原则要点。用属名第一个字母和种名的头两个字母组成的3 个字母斜体的略语表示寄主菌的物种名以及菌株（型）的代号命名。该菌株（种）中发现的不同的酶按照顺序以罗马字母编号I, II, III等。如：Escherichia coli用 Eco 表示。第四个字母代表菌株或株型、变种名，若酶存在于质粒上，则需大写字母表示非染色体遗传因子。例：Hind III 从流感嗜血菌株（Haemophilus Influenzue）d 株中分离的第三个酶。EcoR I 表示基因位于Escherichia coli中的抗药性R 质粒上。前三个字母用斜体，其他用正体表示。如果酶存在于一种特殊菌株中，三个字母后加上菌株名称符号, 名称最后部分往往包含罗马数字, ? 表示在该特殊菌株中发现这种酶的先后次序。3. 引起限制性核酸内切酶星活性的可能因素有哪些？若使用 buffer不当 , 会有 star activity，而 star activity是指限制酶对所作用的DNA及序列失去专一性, 当酶辨认切割位置的能力降低，导致相似的序列或是错误的辨认序列长度也会作用， 而产生错误的结果。所以当 DNA同时以两种限制酶处理时，选择可使两种酶之活性反应均可达75以上的restriction buffer，若找不到适当的buffer则先加低盐的buffer使其中一酶作用后，在加入高盐buffer使另一酶作用，若无法以盐的高低分别加入不同的 buffer ，则先加入一种buffer作用后，加3M NaOAc/95 alcohol沉淀 DNA ，再加另一种 buffer作用。4. DNA 片段之间的连接方式有哪些？具黏性末端的DNA片段之间的连接、具平末端DNA片段之间的连接、DNA片段末端修饰后进行连接、 DNA片段加连杆（linker）后的连接。5. 什么是 Klenow 酶?有哪些活性 ?在基因工程中有什么作用? Klenow DNA 聚合酶是 E.coli DNA polymerase 经蛋白酶（枯草杆菌蛋白酶）裂解而从全酶中除去 5-3 外切活性的肽段后的大片段肽段，而聚合活性和 3-5 外切活性不受影响。也称为 Klenow 片段（ Klenow fragment ） ，或E.coliDNA 聚合酶 大片段。 53聚合酶35 外切酶无小亚基活性6. DNA聚合酶、 RNA聚合酶、反转录酶、末端转移酶、多核苷酸激酶和碱性磷酸酯酶有哪些主要特性？它们在基因工程中的主要用途分别是什么？第三章基因工程的载体1. 名词解释：载体 : 指能够运载外源DNA片段（目的基因） 进入受体细胞， 具有自我复制能力，使外源 DNA片段在受体细胞中得到扩增和表达，不被受体细胞的酶系统所破坏的一类DNA分子。克隆载体： 用于在受体细胞中进行目的基因扩增的载体。一般具有较低的分子量、较高的拷贝数和松弛型复制子。主要由细菌质粒或与其它质粒、噬菌体及真核生物病毒的DNA重组构建。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 2 页，共 27 页学习必备欢迎下载表达载体：使目的基因在宿主细胞中得以表达的载体。可将重组体DNA导入适合的受体细胞，使所载的目的基因能够复制、转录和翻译。穿梭载体 :称双功能载体 (bifunctional vector)。能在两种不同的生物体内复制的载体。质粒 : 指独立存在于宿主细胞染色体外、能够自我复制的DNA分子。松弛型质粒 :拷贝数多于10 个的质粒。严谨型质粒 ;拷贝数为1 至几个的质粒。接合质粒； 指质粒所携带的基因的功能是使细胞彼此有效地接触，以便将质粒DNA从供体细胞转移至受体细胞。如：质粒上的tra基因使宿主细胞（大肠杆菌）产生菌毛，合成细胞表面物质，促使宿主细胞与受体细胞接合。质粒的不亲和性；显性质粒; 隐性质粒；质粒的迁移作用；多拷贝质粒；整合质粒；穿梭质粒；表达质粒；探针质粒；pUCl8 质粒； pBR322质粒；溶菌生长; 溶源生长；原噬菌体；烈性噬菌体；溶原化；柯斯载体或粘粒(cosmid) ；cos 位点；人工染色体2. 作为工程载体必备哪些基本条件？3. 试述质粒载体、噬菌体载体、柯斯载体、M13 单链丝状噬菌体载体和酵母人工染色体载体各自的组成特点及其在基因工程中的应用。4简述质粒的生物学特性有哪些？5构建人工质粒的目的？6理想质粒载体应具备的条件及构建需遵循的原则是什么？7 -DNA作为载体的优点是什么？8. 为什么野生型的噬菌体 DNA不宜作为基因工程载体?该如何改造？第四章目的基因的制备1. 名词解释：目的基因；基因文库 cDNA文库；2. 常规分离目的基因的方法有哪些？其原理分别是什么？3克隆目的基因的方法有哪些? 4什么是基因组文库(genomic library)?构建基因组文库的原理，涉及哪些基本过程?它同遗传学上的基因库、cDNA文库有什么不同? 第五章目的基因的导入和重组子的筛选1. 名词解释：受体细胞；感受态细胞；转化；转导；转染；体外装配；转换子；重组子；转化率；负筛选；正筛选；a互补筛选2. 试述几种常用的转化方法。3. 试述根据载体的选择标记进行重组子筛选的方法和原理。4.试述根据插入序列的表型特征进行重组子筛选的方法和原理。5.DNA 片断之间的连接方式有哪些？各种连接方式的优缺点及DNA重组中需要注意什么问题？6受体细胞选择的原则？第六章外源基因的表达1. 名词解释：融合蛋白；分泌蛋白；包涵体；外源基因表达体系2. 大肠杆菌表达载体构成的重要元件有哪些？3. 试比较大肠杆菌、酵母、植物和动物细胞基因表达载体各自组成的特点。4. 真核基因在大肠杆菌中表达存在的问题和高效表达的对策是什么？5. 基因表达产物的检测方法有哪些？精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 3 页，共 27 页学习必备欢迎下载第七章基因操作的基本技术1 名词解释： 分子杂交； 探针；PCR; 引物；随机引物；切口位移； 热启动；缺口翻译；Northern印迹； Southern 印迹2DNA制备的基本步骤有哪些？3碱裂解法和CTAB法的原理。4凝胶电泳有哪几类？影响琼脂糖凝胶电泳的参数有哪些？5PCR的基本原理是什么？PCR反应体系的组成成份是什么？6试述 PCR反应的程序及参数。7PCR反应引物设计需遵循的原则有哪些？8试述核酸分子杂交的类型和基本步骤。9. 探针标记的方法有哪些？10说明 Southern 杂交的原理和方法。11.Northern印迹与 Southern 印迹有什么不同? 第八章植物基因工程及应用1植物遗传转化方法主要有？2基因枪转化的优点？3天然的Ti 质粒能作为表达载体使用吗？为什么？4理想杀虫剂应具备什么特性？第九章动物基因工程及应用1. 名词解释：转基因生物；共抑制效应；多效性胚胎干细胞2转基因共机制效应的特征？3导致转基因失活的原因可能有哪些？4试述动物基因工程的载体有？5如何筛选转基因多效性干细胞？第十章医学基因工程及应用1. 名词解释 : 胰岛素 ; 基因诊断 ; 基因治疗 ; 2. 基因鉴定的作用？3. 如何进行基因治疗？基因工程原理练习题及其答案一、填空题1基因工程是 _年代发展起来的遗传学的一个分支学科。2基因工程的两个基本特点是： (1)_，(2)_ 。3基因克隆中三个基本要点是：_； _和_。4通过比较用不同组合的限制性内切核酸酶处理某一特定基因区域所得到的不同大小的片段，可以构建显示该区域各限制性内切核酸酶切点相互位置的_。5限制性内切核酸酶是按属名和种名相结合的原则命名的，第一个大写字母取自_，第二、三两个字母取自_，第四个字母则用_表示。6部分酶切可采取的措施有：(1)_(2)_ (3)_等。7第一个分离的限制性内切核酸酶是_；而第一个用于构建重组体的限制性内切精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 4 页，共 27 页学习必备欢迎下载核酸酶是 _。8限制性内切核酸酶BsuRI 和 Hae的来源不同，但识别的序列都是_，它们属于_。9 DNA 聚合酶 I 的 Klenow 大片段是用 _切割 DNA聚合酶 I 得到的分子量为76kDa的大片段，具有两种酶活性： (1)_； (2)_的活性。10为了防止DNA的自身环化，可用_去双链 DNA_ 。11 EGTA 是_离子螯合剂。12测序酶是修饰了的T7 DNA聚合酶，它只有_酶的活性，而没有_酶的活性。13切口移位 (nick translation)法标记DNA的基本原理在于利用_的 _和_的作用。14欲将某一具有突出单链末端的双链DNA分子转变成平末端的双链形式，通常可采用_或 _。15反转录酶除了催化DNA的合成外，还具有_的作用，可以将DNA- RNA杂种双链中的 _水解掉。16 基因工程中依据应用对象分有3 种主要类型的载体： _ 、 _、_。17 就 克 隆 一 个 基 因 (DNA 片 段 ) 来 说 ， 最 简 单 的 质 粒 载 体 也 必 需 包 括 三 个 部 分 ：_、_、_。另外，一个理想的质粒载体必须具有低分子量。18一个带有质粒的细菌在有EB的培养液中培养一段时间后，一部分细胞中已测不出质粒，这种现象叫。19 pBR322 是一种改造型的质粒，它的复制子来源于，它的四环素抗性基因来自于，它的氨苄青霉素抗性基因来自于。20 YAC 的 最 大 容 载 能 力 是， BAC 载 体 的 最 大 容 载 能 力是。21 pSCl01 是一种复制的质粒。22 pUCl8 质粒是目前使用较为广泛的载体。pUC系列的载体是通过和两种质粒改造而来。它的复制子来自，Amp 抗性基因则是来自。23 噬 菌 体 之 所 以 被 选 为 基 因 工 程 载 体 ， 主 要 有 两 方 面 的 原 因 ： 一是； 二是。24 野生型的M13不适合用作基因工程载体，主要原因是和。25黏粒 (cosmid) 是质粒噬菌体杂合载体，它的复制子来自、COS位点序列来自，最大的克隆片段达到 kb。26野生型的噬菌体 DNA不宜作为基因工程载体，原因是：(1) (2) (3) 。27 噬 菌 粒 是 由 质 粒 和 噬 菌 体DNA 共 同 构 成 的 ， 其 中 来 自 质 粒 的 主 要 结 构是，而来自噬菌体的主要结构是。28噬菌体载体由于受到包装的限制，插入外源DNA片段后，总的长度应在噬菌体基因组的的范围内。29在分离 DNA时要使用金属离子螯合剂，如EDTA 和柠檬酸钠等，其目的是。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 5 页，共 27 页学习必备欢迎下载30用乙醇沉淀DNA时，通常要在DNA溶液中加人单价的阳离子，如NaCl 和 NaAc，其目的是。31 引物在基因工程中至少有4 个方面的用途：(1) (2) (3) (4) 。32 Clark 发现用 Taq DNA聚合酶得到的PCR反应产物不是平末端，而是有一个突出碱基末端的双链DNA分子。根据这一发现设计了克隆PCR产物的。33在 cDNA的合成中要用到S1核酸酶，其作用是切除在。34乙醇沉淀DNA的原理是。35假定克隆一个编码某种蛋白质的基因，必须考虑其表达的三个基本条件： (1)_ (2)_ (3)_。36受体细胞的感受态是_ 。37 DNA 重组连接的方法大致分为四种：(1)_(2)_ (3)_(4)_。38将含有外源基因组一个酶切片段的质粒称之为含有一个_，各种此类质粒的集合体称之为构建了一个_。39将含有一个mRNA 的 DNA拷贝的克隆称作一个_，源于同一批RNA制备物的克隆群则构建了一个_。40只要知道基因组中某一特定区域的部分核苷酸组成，用_可以将这段DNA 进行百万倍的扩增。41人工感受态的大肠杆菌细胞在温度为_时吸附 DNA, _时摄人 DNA 。42目前，在重组体的筛选中，已经发展了许多构思巧妙、具有极高准确性的筛选方法。大致可以分为： (1)_(2)_(3)_ (4)_等。43PCR 扩增筛选重组体是比较简便的筛选方法，它适合于_。44 核酸杂交探针可分为两大类： DNA探针和 RNA探针。其中DNA探针又分为 _ 探针和 _探针。45如果用限制性内切核酸酶切割双链DNA产生 5突出的黏性末端，则可以用_进行 3末端标记。如果用限制性内切核酸酶切割DNA产生的是3突出的黏性末端，可以用 _进行 3末端标记。46单链 DNA探针的标记可以采用下列方法：(1)_ (2)_(3)_。47根据 Northern杂交的结果可以说明：_ 。48差示杂交(differential hybridization)技术需要_。49 RNA分子经凝胶电泳后按大小不同分开，然后被转移到一张硝酸纤维素膜( 尼龙膜 ) 上，同一放射DNA探针杂交的技术称_。50在 _技术中， DNA限制性片段经凝胶电泳分离后，被转移到硝酸纤维素膜( 或尼龙膜 ) 上，然后与放射性的DNA探针杂交。51可用T4 DNA 聚合酶进行平末端的DNA标记，因为这种酶具有_和_的活性。52根据外源片段提供的遗传表型筛选重组体，必需考虑三种因素： (1)_ (2)_(3)_。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 6 页，共 27 页学习必备欢迎下载53 Northern印迹和 Southern 印迹有两点根本的区别： (1)_ (2)_。54放射免疫筛选的原理基于以下三点： (1)_ (2)_ (3)_。答案 1 70 2 (1) 分子水平上的操作；(2) 细胞水平上的表达 3 克隆基因的类型；受体的选择；载体的选择4限制性酶切图谱5属名的第一个字母；种名的前两个字母；株名 6 (1) 减少酶量； (2) 缩短反应时间；(3) 增大反应体积 7 EcoK；EcoRl 8 GGCC ；异源同工酶 9 枯草杆菌蛋白酶；(1)5-3合成酶的活性；(2)3-5外切核酸酶10碱性磷酸酶；5端的磷酸基团 11 Ca2+ 12 5-3合成； 3-5外切 13 DNA 聚合酶 I ：5 一 3 外切核酸酶；5 一 3 合成酶 14 S1 核酸酶切割； DNA聚合酶补平 15 核酸水解酶H；RNA 16质粒 DNA ；病毒 DNA ；质粒和病毒DNA杂合体17复制区：含有复制起点；选择标记：主要是抗性基因；克隆位点：便于外源DNA的插入18质粒消除 ( 或治愈 ) 19， pMBl ； pSCl01 ；pSF2124(R 质粒 ) 20 1000kb ；300kb 21. 严紧22 pBR322 和 M13 ；pMBl；转座子23它在细菌中能够大量繁殖，这样有利于外源DNA的扩增；对某些噬菌体( 如噬菌 ) 的遗传结构和功能研究得比较清楚，其大肠杆菌宿主系统的遗传也研究得比较详尽24没有合适的限制性内切核酸酶识别位点；选择标记25质粒；噬菌体； 45 26 (1)分子量大， (2) 酶的多切点，(3) 无选择标记27复制区； IG区28 75 10529螯合 Mg2+离子，抑制核酸酶的活性30中和 DNA分子的负电荷，增加DNA分子间的凝聚力31 (1) 合成探针； (2) 合成 cDNA ；(3) 用于 PCR反应； (4) 进行序列分析32 T载体33第二链合成时形成的发夹环?34乙醇使DNA分子脱水35 (1) 保持正确的可读框 (2) 能够使其转录的启动子 (3) 具有翻译的起始和终止信号精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 7 页，共 27 页学习必备欢迎下载36接受外源DNA的生理状态37 (1) 黏性末端连接； (2)平末端连接； (3)同聚物接尾连接； (4)接头连接法38 基因组 DNA克隆；基因组 DNA文库39 cDNA克隆； cDNA文库40聚合酶链式反应(PCR) 41 0 C；42 C 42 (1) 遗传学方法； (2)物理筛选法； (3)核酸杂交法； (4)表达产物分析法43插入外源片段的种类较多，大小又极为相似的重组体的筛选44基因组DNA ；cDNA 45 Klenow 酶填补的方法；T4DNA聚合酶46 (1) 用 M13噬菌体载体合成单链DNA探针； (2) 从 mRNA 反转录合成单链cDNA探针； (3)用不对称PCR合成单链DNA探针47外源基因是否进行了转录48 两种不同的细胞群体能够表达不同的基因，即在一个群体中能够表达一些基因，而在另一个细胞群体中不能表达这些基因49 Northern印迹50 Southern 印迹51 53合成酶； 35外切核酸酶52 (1) 克隆的是完整的基因；(2) 使用的是表达载体；(3) 不含内含子53(1) 印迹的对象不同：Northern是 RNA ，Southern 是 DNA ；(2) 电泳条件不同，前者是变性条件，后者是非变性条件54(1) 抗体能够被吸附到固体支持物上；(2) 同一个抗原可以同几种抗体结合； (3) 抗体能够被标记二、选择题 ( 单选或多选 ) 1因研究重组DNA技术而获得诺贝尔奖的科学家是( ) (a)AKornberg (b)WGilbert (c)PBerg (d)BMcClintock 2第一个作为重组DNA载体的质粒是 ( ) (a)pBR322 (b)ColEl (c)pSCl01 (d)pUCl8 3关于宿主控制的限制修饰现象的本质，下列描述中只有( )不太恰当。 (a)由作用于同一DNA序列的两种酶构成 (b)这一系统中的核酸酶都是类限制性内切核酸酶 (c)这一系统中的修饰酶主要是通过甲基化作用对DNA进行修饰 (d)不同的宿主系统具有不同的限制- 修饰系统4型限制性内切核酸酶： ( ) (a)有内切核酸酶和甲基化酶活性且经常识别回文序列 (b)仅有内切核酸酶活性，甲基化酶活性由另外一种酶提供 (c)限制性识别非甲基化的核苷酸序列 (d)有外切核酸酶和甲基化酶活性 (e)仅有外切核酸酶活性，甲基化酶活性由另外一种酶提供5下面有关限制酶的叙述哪些是正确的?( ) (a)限制酶是外切酶而不是内切酶 (b)限制酶在特异序列( 识别位点 )对 DNA进行切割 (c)同一种限制酶切割DNA时留下的末端序列总是相同的精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 8 页，共 27 页学习必备欢迎下载 (d)一些限制酶在识别位点内稍有不同的点切割双链DNA ，产生黏末端 (e)一些限制酶在识别位点内相同的位置切割双链DNA ，产生平末端6第一个被分离的类酶是： ( ) (a)EcoK (b)Hind (c)Hind (d)EcoB 7在下列进行DNA部分酶切的条件中，控制那一项最好?( ) (a)反应时间 (b)酶量 (c)反应体积 (d)酶反应的温度8在下列试剂中，那一种可以螯合Ca2+离子 ?( ) (a)EDTA (b)柠檬酸钠 (c)SDS (d)EGTA 9在下列工具酶中，那一种可以被EGTA抑制活性 ?( ) (a)S1单链核酸酶 (b)末端转移酶 (c)碱性磷酸酶 (d)Bal 31核酸酶10限制性内切核酸酶可以特异性地识别： ( ) (a)双链 DNA的特定碱基对 (b)双链 DNA的特定碱基序列 (c)特定的三联密码 (d)以上都正确11下列关于限制性内切核酸酶的表示方法中，正确一项的是( )。 (a)Sau3A I (b)EcoRI (c)hind III (d)Sau 3A1 12限制性内切核酸酶的星号活性是指：( ) (a) 在非常规条件下，识别和切割序列发生变化的活性。 (b)活性大大提高 (c)切割速度大大加快 (d)识别序列与原来的完全不同13下面哪一种不是产生星号活性的主要原因?( ) (a)甘油含量过高 (b)反应体系中含有有机溶剂 (c)含有非 Mg2+ 的二价阳离子 (d)酶切反应时酶浓度过低14关于宿主控制的限制修饰现象的本质，下列描述中只有( )不太恰当 (a)由作用于同一DNA序列的两种酶构成 (b)这一系统中的核酸酶都是类限制性内切核酸酶 (c)这一系统中的修饰酶主要是通过甲基化作用对DNA进行修饰 (d)不同的宿主系统具有不同的限制- 修饰系统15在长模板链的指导下引物延伸合成长的DNA互补链时应选用( ) (a)T4DNA聚合酶 (b)Klenow酶 (c)大肠杆菌DNA聚合酶 I (d)T7DNA聚合酶16末端转移酶是合成酶类，( ) (a)作用时不需要模板 (b)在 Ca2+的存在下，可以在突出的3，末端延长DNA链 (c)在 Ca2+的存在下，可以在隐蔽的3，末端延长DNA链(d) 上述说法有两种是正确的17在基因工程中，可用碱性磷酸酶( ) (a)防止 DNA的自身环化 (b)同多核苷酸激酶一起进行DNA的 5，末端标记 (c)制备突出的3，末端 (d)上述说法都正确18下列酶中，除( )外都具有磷酸酶的活性 (a)核酸外切酶 (b)外切酶 (c)单核苷酸激酶 (d)碱性磷酸酶19下列哪一种酶作用时需要引物? ( ) (a)限制酶 (b)末端转移酶 (c)反转录酶 (d)DNA连接酶20 S1核酸酶的功能是( ) (a)切割双链的DNA (b)切割单链的RNA (c) 切割发夹环 (d)以上有两项是正确的21 Klenow 酶与 DNA聚合酶相比，前者丧失了( )的活性。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 9 页，共 27 页学习必备欢迎下载 (a)5，-3 ，合成酶， (b)3，-5 ，外切酶 (c)5，-3 ，外切酶 (d)转移酶22下面关于松弛型质粒(relaxed plasmid)性质的描述中，( )是不正确的 (a)质粒的复制只受本身的遗传结构的控制，而不受染色体复制机制的制约，因而有较多的拷贝数 (b)可以在氯霉素作用下进行扩增 (c)通常带有抗药性标记 (d)同严紧型质粒融合后，杂合质粒优先使用松弛型质粒的复制子23基因工程中所用的质粒载体大多是改造过的，真正的天然质粒载体很少，在下列载体中只有 ( )被视为用作基因工程载体的天然质粒载体 (a)pBR322 (b)pSCl01 (c)pUBll0 (d)pUCl8 24下列哪种克隆载体对外源DNA的容载量最大 ?( ) (a)质粒 (b)黏粒 (c)酵母人工染色体(YAC) (d) 噬菌体 (e) cDNA表达载体25. 松弛型质粒： ( ) (a)在寄主细胞中拷贝数较多 (b)可用氯霉素扩增 (c)一般没有选择标记 (d)上述 (a) 、(b) 两项正确26 Col El是惟一用作基因工程载体的自然质粒，这种质粒： ( ) (a)是松弛复制型（b)具有，四环素抗性 (c)能被氯霉素扩增 (d)能产生肠杆菌素27同一种质粒DNA ，以三种不同的形式存在，电泳时，它们的迁移速率是：( ) (a)OCDNASCDNALDNA (b)SCDNALDNAOCDNA (c)LDNAOCDNASCDNA (d)SCDNAOCDNALDNA 28pBR322是一种改造型的质粒，含有两个抗性基因，其中四环素抗性基因来自： ( ) (a)ColEl (b)Ri质粒 (c)pSCl01 (d)pUCl8 29关于穿梭质粒载体，下面哪一种说法最正确?( ) (a)在不同的宿主中具有不同的复制机制 (b)在不同的宿主细胞中使用不同的复制起点 (c)在不同的宿主细胞中使用不同的复制酶 (d)在不同的宿主细胞中具有不同的复制速率30能够用来克隆32kb 以下大小的外源片段的质粒载体是( ) (a)charomid (b)plasmid (C)cosmid (d)phagemid 31第一个作为重组DNA载体的质粒是( ) (a)pBR322 (b)ColEl (c)pSCl01 (d)pUCl8 32. Ti质粒： ( ) (a)可从农杆菌转到植物细胞中 (b)作为双链DNA被转移 (c)在植物中导致肿瘤 (d)介导冠瘿碱的合成， 作为细菌的营养物和植物的生长激素 (e)需要细菌的vir基因帮助转移 (f)在植物细胞中作为染色体外质粒33黏粒 (cosmid) 是一种人工建造的载体，( ) (a)它具有 COS位点，因而可进行体外包装 (b)它具有质粒DNA的复制特性 (c)进入受体细胞后，可引起裂解反应 (d)进入受体细胞后，可引起溶源化反应34有两种确定核酸中核苷酸序列的方法：化学序列分析法(Maxam-Glbert)和酶学序列分析法(Sanger) 。酶学测序法的基本原理优点是：( ) (a)碱基与特殊染料间不同的相互作用 (b)一个合成引物的延伸和DNA修复合成的可靠终止 (c)限制性位点与DNA末端标记的相关性精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 10 页，共 27 页学习必备欢迎下载 (d)可同时对DNA双螺旋的两条链进行测序 (e)反应是 DNA特异的， RNA不会带来干扰。这样既减少纯化步骤，也节约了开支。35关于 cDNA的最正确的说法是：( ) (a)同 mRNA 互补的单链DNA (b)同 mRNA 互补的双链DNA (c)以 mRNA 为模板合成的双链DNA (d)以上都正确36用碱法分离质粒DNA时，染色体DNA之所以可以被除去，是因为：( ) (a)染色体 DNA断成了碎片 (b)染色体 DNA分子量大，而不能释放 (c)染色体变性后来不及复性 (d)染色体未同蛋白质分开而沉淀37. 关于碱解法分离质粒DNA ，下面哪一种说法不正确?( ) (a)溶液 I 的作用是悬浮菌体 (b)溶液的作用是使DNA变性 (c)溶液的作用是使DNA复性 (d)质粒 DNA分子小，所以没有变性，染色体变性后不能复性38. Clark做了一个有趣的实验，发现TaqDNA聚合酶可以不需要模板，在双链DNA的末端加一个碱基，主要是加( ) (a)dGTP (b)dATP (c)dCTP (d)dTTP 39根据构建方法的不同，基因文库分为基因组文库、cDNA文库等。在下列文库中， ( )属 cDNA文库 (a) YAC文库 (b) MAC文库 (c) 扣减文库 (d) BAC文库40下面关于多克隆位点(multiple clone site,MCS)的描述，不正确的句是( ) (a)仅位于质粒载体中 (b)具有多种酶的识别序列 (c)不同酶的识别序列可以有重叠 (d)一般是人工合成后添加到载体中41在 cDNA技术中，所形成的发夹环可用( ) (a)限制性内切核酸酶切除 (b)用 31外切核酸酶切除 (c)用 S1核酸酶切除 (d)用 51外切核酸酶切除42在 DNA的酶切反应系统中，通常：( ) (a)用 SSC缓冲液 (b)加入 Mg2+作辅助因子 (c)加入 BSA等保护剂 (d)上述说法中，有两项是正确的43黏性末端连接法，不仅操作方便，而且( ) (a)产生新切点 (b)易于回收外源片段 (c)载体不易环化 (d)影响外源基因的表达44在下列表型中，( )是基因工程上理想的受体菌表型 (a)r+m+rec* (b)r-m-rec- (C)r-m-rec+ (d)r+m+rec-45关于 DNA接头在基因工程中的作用，下列说法中哪一项不正确?( ) (a)给外源 DNA添加适当的切点 (b)人工构建载体 (c)调整外源基因的可读框 (d)增加调控元件46 cDNA文库包括该种生物的( ) (a)某些蛋白质的结构基因 (b)所有蛋白质的结构基因 (c)所有结构基因 (d)内含子和调控区47下列关于建立cDNA文库的叙述中，哪一项是错误的?( ) (a)从特定组织或细胞中提取DNA或 RNA (b)用反转录酶合成mRNA 的对应单链DNA (c)以新合成的单链DNA为模板合成双链DNA (d)新合成的双链DNA甲基化48下列对黏性末端连接法的评价中，哪一项是不正确的? ( ) 精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 11 页，共 27 页学习必备欢迎下载 (a)操作方便 (b)易于回收片段 (c)易于定向重组 (d)载体易于自身环化，降低重组率49关于感受态细胞性质的描述，下面哪一种说法不正确?( ) (功具有可诱导性 (b)具有可转移性 (c)细菌生长的任何时期都可以出现 (d)不同细菌出现感受态的比例是不同的50下面关于用T4多核苷酸激酶标记5 端制备探针的描述中( )是不正确的。 (a)既能标记DNA ，又能标记RNA (b)既能标记双链DNA又能标记单链DNA (c)只能标记突出的5 端不能标记其他类型末端 (d)DNA或 RNA必须有 5-OH 的存在51 Southem印迹的 DNA探针 ( )杂交。 (a)只与完全相同的片段 (b)可与任何含有相同序列的DNA片段 (c)可与任何含有互补序列的DNA片段 (d)可与用某些限制性内切核酸酶切成的DNA片段 (e)以上都是52 用下列方法进行重组体的筛选，只有( )说明外源基因进行了表达。 (a)Southem印迹杂交 (b)Northem印迹杂交 (c)Western印迹 (d)原位菌落杂交53下列哪一个不是Southern 印迹法的步骤?( ) (a)用限制酶消化DNA (a)DNA与载体的连接 (c)用凝胶电泳分离DNA片段 (d)DNA片段转移至硝酸纤维素膜上 (e)用一个标记的探针与膜杂交54 报告基因 ( ) (a)以其易于分析的编码序列代替感兴趣基因的编码序列 (b)以其易于分析的启动子区代替感兴趣基因的启动子区 (c)能用于检测启动子的活性 (d)能用于确定启动子何时何处有活性55 在利用 lacZ 失活的显色反应筛选法中，IPTG的作用是 ( ) (a)诱导宿主的肽的合成 (b)诱导宿主的肽的合成 (c)作为酶的作用底物 (d)作为显色反应的指示剂56. 切口移位是指在( )作用下，使 ( )带上放射性标记。 (a)DNA聚合酶 I ，RNA (b)DNA聚合酶 I ，DNA (c)DNA聚合酶， RNA (d)DNA聚合酶， DNA 57用于核酸分子杂交的探针可以是放射性标记的( ) (a)DNA (b)RNA (c)抗体 (d)抗原58 Southern 印迹是用DNA探针检测 DNA片段，而Northern印迹则是： ( ) (a)用 RNA探针检测DNA片段 (b)用 RNA探针检测RNA片段 (c)用 DNA探针检测RNA片段 (d)用 DNA探针检测蛋白质片段59用免疫化学法筛选重组体的原理是( ) (a)根据外源基因的表达 (b)根据载体基因的表达 (c)根据 mRNA 同 DNA的杂交 (d)根据 DNA同 DNA的杂交 60 随机引物标记探针，下列各项中哪一项是不正确的?( ) (a)双链 DNA 、单链 DNA 、RNA都是可以标记的 (b)不需要用 Dnase I预处理 (c)反应时可用Klenow 酶 (d)反应时可用DNA聚合酶 1 61 在切口移位标记DNA探针时只能使用( ) (a)Klenow酶 (b)DNA聚合酶 I (c)DNA聚合酶 (d)DNA聚合酶 62 要对一双链的DNA分子进行31末端标记，可用( ) 精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 12 页，共 27 页学习必备欢迎下载 (a)Klenow酶 (b)DNA聚合酶 I (c)T4DNA聚合酶 (d)T7DNA聚合酶答案1c；2c； 3 b； 4 b 5b，C，d，e； 6 c； 7 b； 8 d；9d； 10 B； 11 d；12a； 13 d； 14 b 15 d； 16 c；17a，b；18a；19c；20d；21c；22C；23b； 24 C；25d；26a，C，d；27b；28c； 29 b；30a；31c； 32 a,c,d,e，33 a，b，c；34b； 35 c；36c； 37 d； 38 b；39c；40a； 41c； 42 a，b，c； 43 b； 44 b； 45 d； 46 a；47a； 48 c； 49 c；50b；51c； 52 c；53 b； 54 a,c,d ；55a； 56 b； 57a，b； 58 c；59a；60d；61b； 62 c；三、简答题1说明 Sanger DNA 测序法的原理。2某学生在用EcoRI 切割外源DNA片段时，出现了星号活性，请分析可能的原因? 3在序列 5-CGAACATATGGAGT-3 中含有一个6bp 的类限制性内切核酸酶的识别序列，该位点的序列可能是什么? 4下面几种序列中你认为哪一个( 哪些 ) 最有可能是类酶的识别序列： GAATCG ，AAATTT ， GATATC， ACGGCA? 为什么 ? 5当两种限制性内切核酸酶的作用条件不同时，若要进行双酶切，应采取什么措施? 为什么 ? 6为什么反转录酶在聚合反应中会出错? 7什么是测序酶 (sequenaseTM)? 8什么是 S1核酸酶作图 (S1 nuclease mapping)? 9 YAC载体具有什么样的功能性DNA序列 ?为什么在克隆大片段时，YAC具有优越性? 10 列举质粒载体必须具备的4 个基本特性。11 什么叫穿梭载体？12如何将野生型的噬菌体改造成为一个理想的载体? 13 PCR 的基本原理是什么?用 PCR扩增某一基因，必须预先得到什么样的信息? 14 cDNA 克隆与基因组克隆有何不同? 15怎样将一个平末端DNA片段插入到EcoR I 限制位点中去? 16简述以黏粒为载体构建基因文库的原理。17酵母人工染色体要在酵母细胞中稳定存在，必须有哪些基本的结构? 18何谓 YAC? 主要特性是什么? 19 Muller的 PCR反应同大肠杆菌体内的DNA复制有哪些不同?你认为根本的差别在哪里 ? 20欲将一真核生物的结构基因克隆后转移到原核生物( 如 Ecoli)中进行表达，克隆时应注意哪些问题? 21假定你分离到一个Ecoli的 Thy- 突变体，并推测有可能是ThyA基因突变。请设计一个方案用PCR从染色体DNA扩增突变的ThyA基因，测定突变的序列。( 注： Ecoli 野生型的 ThyA基因的序列是已知的) 22 你在做 Southern 印迹分析，并且刚完成了凝胶电泳这一步。根据方案，下面一步骤是用 NaOH 溶液浸泡凝胶，使DNA变性为单链。为了节省时间，你略过了这一步，直接将 DNA从凝胶转至硝酸纤维素膜上。然后用标记探针杂交，最后发现放射自精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 13 页，共 27 页学习必备欢迎下载显影片是空白。错在哪里? 23切口移位 (nick translation)标记探针的主要步骤有哪些? 24用 EcoRI 和 Hind 分别切割同一来源的染色体DNA ，并进行克隆，在前者的克隆中筛选到 A基因，但在后者的克隆中未筛选到A基因，请说明原因。25什么是Western 印迹 ?它与 Southern 印迹有什么不同? 26用一限制性内切核酸酶切割Lac+ Tet+的质粒载体，已知该酶识别的是4 个碱基序列，并产生有两个碱基突出的单链末端，该酶在lac 基因内有切割位点，并在第二个氨基酸密码子内，该位点可以被任何氨基酸所取代而不影响酶活性。用该酶切割后，用DNA聚合酶将单链末端补齐为双链的平末端，然后重新连接成环，转化Lac- Tets受体菌，筛选Tetr转化子，问：Lac 的基因型是什么?并说明原因。27在基因工程中，为了在细菌细胞中表达真核生物的基因产物，为什么通常要用cDNA 而不用基因组DNA? 为什么要在cDNA前加上细菌的启动子? 答案 1 答： Sanger DNA测序法是建立在两个基本原理之上：(1) 核酸是依赖于模板在聚合酶的作用下由5 端向 3 端聚合 (DNA聚合酶参与了细菌修复DNA合成过程 ) ；(2) 可延伸的引物必须能提供游离的3 羟基末端，双脱氧核苷酸由于缺少游离的3 羟基末端，因此会终止聚合反应的进行。如果分别用4 种双脱氧核苷酸终止反应，则会获得 4 组长度不同的DNA片段。通过比较所有DNA片段的长度可以得知核苷酸的序列。 2 答：盐离子浓度不对，温度不对，甘油浓度过高。 3 答：回文序列是：5-CATATG-3， 4 答： GATATC； AAATTT ，因为它们是回文序列。5答：注意星活性，先低盐，后高盐；先低温酶，后高温酶；并且可以直接在换酶前将第一种酶失活，再加第二种酶，否则，易产生星活性。或使用通用缓冲液。 6 答：由于反转录酶缺少在E coli DNA聚合酶中起校正作用的3-5外切核酸酶活性，所以聚合反应往往会出错，在高浓度的dNTP和 Mg2+ 下，每 500 个碱基中可能有一个错配。 7 答：所谓测序酶即是修饰了的T7 DNA聚合酶，是采用缺失的方法，从外切核酸酶结构域中除去 28个氨基酸，这样使 T7 DNA 聚合酶完全失去了3-5的外切核酸酶活性， 只有 5-3聚合酶的活性，而且聚合能力提高了39 倍，测序时常用此酶。8答： S1核酸酶作图是一种对RNA转录产物的末端和剪接位点进行作图的方法。9. 答： YAC 带有天然染色体所有的功能元件，包括一个着丝粒，一个DNA复制起点，两个端粒。YAC能够容纳长达几百kb 的外源 DNA ，这是质粒和黏粒办不到的。大片段的插入更有可能包含完整的基因，在染色体步移中每次允许更大的步移距离，同时能够减少完整基因组文库所需的克隆数目。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 14 页，共 27 页学习必备欢迎下载10答： (1)独立复制； (2)有选择标记； (3)有独特的酶切位点； (4)能转化但不扩散。11答：含有细菌质粒和克隆的真核生物DNA片段的杂种质粒，有两个复制起点和既能在细菌又能在真核细胞中进行选择的选择标记，所以，很容易从一宿主转到另一个宿主( 来回穿梭) 。12. 答： (1)削减分子量 (除去非必需区和整合区) ； (2)削减酶切位点； (3)添加选择标记； (4)引入终止突变13答： (1)DNA半保留复制的原理，在体外进行DNA的变性、复性和引物延伸。 (2)至少要预先知道足够合成一对引物的靶DNA序列。14答：基因组克隆包含所有不在cDNA中出现的内含子。15答：化学合成一些长为10bp 含有 EcoRI 识别位点的短的DNA片段，然后与待克隆片段两端连接起来，如果用EcoRI 切割这种连接片段，就会产生EcoRI 的单链末端。这种片段就可以插入到任何EcoRI 的限制性内切酶位点中。16答： (1)COS位点可以自身环化； (2)可以利用 COS 位点包装噬菌体颗粒； (3)可以感染寄主细胞； (4)利用质粒复制子复制，不整合、不裂解。17答： (1)着丝粒； (2)端粒； (3)ARS序列。18答： (1)含有来自其他生物DNA的酵母人工染色体，叫YAC ； (2)主要特性是可以克隆较大的外源片段。19答： PCR 用双引物，体内复制用单引物。20答：应注意的问题有：启动子、密码子、剪接、分泌。21答：为了扩增突变体的thyA 基因，先设计一对引物，其中一个引物的序列与thyA 基因的 5端相同，另一个引物同该基因的3端互补。在引物的5端加上合适类限制性内切核酸酶的识别序列，以便于后来的克隆。将染色体DNA同引物混合后，进行PCR扩增。然后进行琼脂糖凝胶电泳，纯化扩增片段，可以直接测序或克隆到合适的载体再测序。22答：如果你的杂交探针是双链的，可能因为在加人杂交混合物之前忘记将探针变性而得到空白的放射自显影结果。23答： (1)DNaseI造成切口； (2)DNA聚合酶 III的 53外切核酸酶进行切割； (3)DNA聚合酶的53合成酶进行修补； (4)在修补过程中，随着切口(nick)的移动，将放射性的底物掺人到双链DNA中。24答：精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 15 页，共 27 页学习必备欢迎下载原因是： Hind 的切点在A基因内。25答： Western印迹是将蛋白质经电泳分离后从凝胶中转移到固相支持物上，然后用特异性的抗体进行检测。它与Southern 的不同在于探针的性质不同，在Western 印迹中使用的探针是抗体 ( 蛋白质 ) 。26答：基因型是lac-原因是在该密码子中插入了两个碱基，造成了移码突变，所以Lac 的基因是缺陷的。27答：这是因为细菌没有内含子剪接系统，并且不能识别真核生物的启动子之故。四、问答题：1说明限制性内切核酸酶的命名原则要点。2什么是限制性内切核酸酶的星号活性? 受哪些因素影向? 3影响 DNA连接酶催化连接反应的因素有哪些? 4什么是 Klenow 酶?有哪些活性 ?在基因工程中有什么作用? 5细菌碱性磷酸酯酶和小牛肠碱性磷酸酯酶有什么不同?在基因工程中有什么用途? 6外切核酸酶(1ambda exonuclease)基本活性是什么?在基因工程中有什么应用? 7Mn2+ 、Mg2+ 对 Dnase I(deoxyribonuclease ?) 的活性有什么影响?Dnase I 在基因工程中有什么作用 ? 8质粒如何维持在细胞中的稳定？9由于基因工程是人为改变遗传信息的操作，因此必须注意被操作基因的安全，进行严格的监控，质粒载体的安全性是十分重要的。请问质粒载体的安全条件包括哪几个方面 ? 10为什么野生型的噬菌体 DNA不宜作为基因工程载体? 11 什么是蓝白斑筛选法? 12 蓝白斑筛选法为什么也会有假阳性? 13 M13 系列载体具有哪些优缺点? 14黏粒载体具有哪些特点与不足? 15辅助噬菌体DNA和相应的噬菌粒是如何协同工作的? 16 如果知道某一基因的功能及其相应的蛋白质的氨基酸序列组成，可以通过何种方法克隆该基因 ? 17 什么是基因文库? 18 什么是基因组文库(genomic library)?构建基因组文库，涉及哪些基本过程?它同遗传学上的基因库有什么不同? 19 什么是 cDNA文库 (complementDNAlibrary)?同基因组文库有何差别? 20 黏性末端连接法是最常用的连接方法，具有许多优点，但是也有一些不足，请指出这些不足之处。21什么是同聚物加尾连接法(homopolymer tails joining)?用何种方法加尾?具有哪些优缺点 ? 22何谓接头连接法(1inker ligation)? 23什么是同裂酶?为什么说用同裂酶进行体外重组效率最高? 24为了大量获得许多用于生化鉴定的产物，你想将拟南芥中的一个序列已知、编码单精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 16 页，共 27 页学习必备欢迎下载体酶蛋白的基因在单细胞微生物中表达，你如何确保最终能得到产物? 25某一质粒载体具有Tetr和 Kanr的表型，在Kan 抗性基因内有一Bgl I的切点。现用 Bgl I切割该载体进行基因克隆，问：(1) 转化后涂皿时应加什么样的抗生素?(2) 培养后长出的菌落具有什么样的抗性基因型?(3) 如何利用抗性变化筛选到含有插入片段的重组体 ? 26 以 pBR322 DNA作为载体，从四环素抗性基因区克隆外源DNA时，可采用环丝氨酸富集法筛选重组体，说明其基本原理和基本操作过程。27 放射性抗体检测法(radioactive antibody test)的基本原理是什么? 28 什么是随机引物(random primer)?如何标记DNA? 29什么是印迹(blotting)杂交 ? 30什么是原位菌落杂交(colony hybridization)? 31说明 Southern 杂交的原理和方法。32 Northern印迹与 Southern 印迹有什么不同? 33建立了一个基因文库后，如何鉴定一个携带目的基因的克隆? 答案： 1 答：限制性内切核酸酶采用三字母的命名原则，即属名+种名 +株名的各一个首字母，再加上序号。基本原则： 3-4个字母组成， 方式是：属名 +种名 +株名 +序号； 首字母：取属名的第一个字母，且斜体大写；第二字母：取种名的第一个字母，斜体小写；第三字母： (1)取种名的第二个字母，斜体小写； (2)若种名有词头，且已命名过限制酶，则取词头后的第一字母代替。第四字母：若有株名，株名则作为第四字母，是否大小写，根据原来的情况而定，但用正体。顺序号：若在同一菌株中分离了几种限制酶，则按先后顺序冠以I 、等，用正体。2答：类限制酶虽然识别和切割的序列都具有特异性，但是这种特异性受特定条件的限制，即在一定环境条件下表现出来的特异性。条件的改变，限制酶的特异性就会松动，识别的序列和切割都有一些改变，改变后的活性通常称第二活性，而将这种因条件的改变会出现第二活性的酶的右上角加一个星号表示，因此第二活性又称为星活性。概括起来，诱发星活性的因素有如下几种：(1) 高甘油含量 (5 , v v) ；(2) 限制性内切核酸酶用量过高(100UugDNA) ； (3) 低离子强度 (1000 对照 3 省去磷酸酶处理，无cDNA TMTC 0 435 对照 4 无 cDNA TMTC 0 25 实验样品 TMTC 0 34 注： TMTC=too many to count，多到无法计数。4. 打算在细菌中表达一种稀有的人类某种蛋白质，以便能够大量制备这种蛋白。为确保分离纯化， 决定将一段6 个组氨酸的短肽加到该蛋白质的N端或 C端。这些带有组氨酸标签的蛋白质能够紧紧地同Ni2+柱结合，但很容易被EDTA或咪唑溶液洗脱。此法可以一步完成大量蛋白质的纯化。图 229 是编码该蛋白的核苷酸序列。请设计一对PCR引物，各含有18 个同该基因同源的核苷酸，能够用于扩增该基因的编码序列，另外，在N端有一个起始密码，其后是6 个组氨酸密码子。另外设计一对引物，能够在C端加上 6 个组氨酸和一个终止密码。 L R D P Q G G V I 5-CTTAGAGACCCGCAGGGCGGCGTCATC-3N末端 M A T R R A A 5-GGT CGT ATG GCT ACT CGT CGC GCT GCT CTT GCT GCA AGT CTC TCT TAG AAG TGT-3 L A A S L S * C末端答案1 要使动物中编码激素的基因在大肠杆菌中表达，通常遇到的问题有： (1)细菌的 RNA聚合酶不能识别真核生物的启动子。 (2)大多数真核基因有内含子，这些内含子在转录后从前体mRNA中被切除而形成成熟mRNA 。细菌细胞没有这样的机制来去除内含子。 (3)有些真核生物的蛋白质是通过前体分于加工而来的，例如胰岛素就是通过加工去除前体分子内部的33 个氨基酸残基而来，剩下的两段肽链分别形成胰岛素的、 链。 (4)产生的真核生物的蛋白质产物可以被细菌的蛋白酶所识别和降解。针对上述可能出现的问题，建议在克隆的过程中采取以下措施：应将激素的编码序列置于含有核糖体结合位点和起始密码子ATG的细菌强启动子的附近( 含有这种序列的载体称表达载体) 。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 25 页，共 27 页学习必备欢迎下载可以以激素的mRNA 为模板用反转录酶合成激素的基因。这种 DNA不含内含子可插入到载体中进行克隆。此外， 如果蛋白质序列短则可通过化学合成得到该基因。合成的基因应含起始密码ATG 、通过该激素蛋白的氨基酸序列推测而来的编码序列，以及1 2 个终止密码： ATG编码序列TGA TAG 现在，这个合成基因可被插入载体中。有时加工过程可以在离体条件下进行。如果加工有困难，可以用合成基因，从而免除加工过程。选用合适的突变型宿主从而防止蛋白酶水解。如果用酵母作为宿主上述许多问题都可以较容易地解决，尤其是现在有既能在大肠杆菌中又能在酵母中复制的穿梭质粒载体。说明： 1)ATG,TAG和 TGA是对应 mRNA 中的转录起始信号AUG 和终止信号UAG,UGA 的 DNA序列。 2)克隆生长素释放抑制因子基因时采用化学合成基因的方法。生长索释放抑制因子是一种由下丘脑分泌的激素，长14 个氨基酸残基，因此人工合成的基因，包括在宿主菌中表达所需的转录的起始和终止信号，仅51bp 长。2答： (1)KpnI-BamHI的接头及它的寡聚核苷酸片段示于图A22 4-A。 这种接头片段可以用于两种连接，即BamHI末端和 KpnI 末端连接。 (2)用 DNA连接酶处理混合物得到图A224-B 所示的重组DNA分子。如图中箭头所指，BamH I-Kpn I 接头中三个缺口有两个可被连接起来。这就足以将KpnI 切割的片段连接到 BamHI切割的载体中去。 (3)你朋友的方案无论是在理论上还是在实验上都很好。当 DNA被转化到细胞之后，剩下的一个缺口能够被修复。应该注意到，可以用多核苷酸激酶和ATP将寡聚核苷酸的5端加上一个磷酸，经这种处理寡聚核苷酸上的所有缺口都可以用连接酶进行封口。（A） BamHI Kpn I 5-GGTACGATCC-3 3-C C-5 3CATGCTAG5寡居拼接片段图 A22.4 BamH I-Kpn I的接头(A)KpnI-BamHI接头所需要的寡聚核苷酸片段，它的序列同第一个寡聚核苷酸的序列相同。(B)BamHI-KpnI接头片段介导KpnI 切割的片段连接到BamHI切割的载体中。箭头表示可以连接的缺口。 打开的环表示只有经酶促修复后才能连接的缺口。划线部分是两种寡聚核苷酸的序列3. (1) 如果仅是细胞本身就能产生菌落，意味着发生了某种错误，这有几种可能性。首先是错误地选用了带有克隆载体并具有抗生素抗性的细胞制备感受态；或是感受态细胞已经污染上了具有抗生素抗性的细胞。最后一种可能性是忘记了在平板中添加抗生素，或是抗生素的量加得不够。因此，对照1 就是要确认感受态细胞和培养平板没有问题GGATCGTACC CCTAGCATGG GGTACGTACC CCTAGCATGG 精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 26 页，共 27 页学习必备欢迎下载（2）如果用为切割的载体转化细胞得不到菌落，也是由于某种错误所致。这也有几种可能性。其中是感受态细胞制备的不合适，以而不能摄取DNA ；其二是平板中抗生素太多；其三可能是平板制备的不正确，不能支持细菌的生长。因此，对照2 如同对照1 一样，确认细胞和平板都能像预期的那样，能够很好地工作。（3）对照 3 是检查切割载体的末端是否同预期的一样，以及连接酶是否具有活性。限制性内切酶的制备物 （或是所用的缓冲液）偶尔也会污染上外切核酸酶，这就会修饰末端，使得不能连接。或者是缓冲液的成分不合适，这也会妨碍连接酶的作用。对照 4 是检查碱性磷酸酶是否有活性。（4）用碱性磷酸酶处理载体，以除去5磷酸可防止载体自我连接。载体重新连接可以产生很高的带有载体而没有插入物的菌落本地。因为cDNA没有用磷酸酶处理，它保留5磷酸，仍然能同载体连接。因此采用磷酸酶处理载体以降低仅有载体的菌落数，增加携带重组克隆的比例。4. （A）N末端组氨酸标签左边引物： 5 ATGCATCATCATCATCATCATATGGCTACTCGTCGCGCT M H H H H H H 右边引物：5ACACTTCTAAGAGAGACTTGC （B）C末端组氨酸标签左边引物： 5 ATGGCTACTCGTCGCGCT 右边引物：5CATATGATGATGATGATGATGACACTTCTAAGAGAGACTTGC * H H H H H H 精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 27 页，共 27 页