微生物遗传育种知识点第一章绪论第一节工业微生物菌种定义：利用微生物特定代谢过程，规模化加工或转化特定底物或环境物料的微生物菌株。意义：工业微生物学的核心研究内容；好的菌种，可以带动一个产业；是研究生命现象的重要模式生物。第二节微生物育种的遗传学基础1、遗传：指亲代的性状在子代表现的现象。2、变异：指同种生物世代之间或同代不同个体之间的性状的差异。3、遗传与变异是生物界的共同特征，它们之间是辩证统一的。2.1 经典遗传学简述一、分离定律1、概念： （1）基因型：生物体全部遗传因子的总称。（2）表型：生物体表现出来的性状的总和。 （3）杂交、亲本 (P) 、子一代 (F1) 、子二代 (F2) 、相对性状、显性、隐性。2、Mendel：单因子杂交实验。3、分离定律内容： 控制一对相对性状的等位基因在形成配子时彼此分离，每个配子只能获得一个等位基因。4、分离定律的染色体基础：位于同源染色体上的一对等位基因在减数分裂时随同源染色体分离而发生分离。二、自由组合定律-遗传学第二定律1、两对因子的杂交实验，当考察性状为n 成对因子：基因型：3n 种，分布为（1：2：1）n 的展开，表现型：2n 种，分布为（ 3： 1）n 的展开。2、一个基因的等位基因的分离独立于其它基因的等位基因的分离，不同对的因子在形成配子时自由组合。3、染色体基础：非等位基因位于不同的染色体上，在减数分裂时独立分离，自由组合。三、连锁与交换定律1、连锁： 位于同一染色体上的基因伴同遗传的现象。交换：由于同源染色体相互之间发生交换而使原来在同一染色体上的基因不再伴同遗传的现象。2、染色体基础：连锁：受考察两基因间未发生断裂再接；交换：受考察两基因间发生了断裂再接。3、生物学意义： （1）连锁：保持物种遗传稳定性；交换：造成生物的多样性，通过自然选择而使强者生存。（2）微生物中：连锁可保持高产菌种的稳定性，交换有利于高产菌种的选育。（ 3）生产菌株：多利用无性繁殖而扩大培养，避免交换的发生。2.2 遗传的物质基础一、遗传物质化学本质的确证1、肺炎链球菌转化实验：体内转化实验DNA是遗传物质的证明。转化：一个品系的生物吸收了来自另一品系生物的遗传物质，从而获得后一品系的某些遗传性状的现象。2、噬菌体感染实验，结论：DNA是遗传物质。3、病毒的拆分和重建实验，结论：HR病毒的遗传物质是RNA 。结论：生物的遗传物质的化学本质是核酸，在绝大多数生物中是DNA ，在少数病毒中是RNA 。二、染色体存在于真核生物细胞核内，由DNA 、蛋白质及少量RNA组成的嗜碱性丝状或杆状小体。1、化学组成： 1/3DNA，1/3 组蛋白， 1/3 非组蛋白及少量RNA和磷脂。 （1） DNA ：携带传递遗传信息，染色体的功能体现者；（2）组蛋白：染色体中与DNA联结的碱性蛋白质， 是染色体主要的结构蛋白。近乎所有的染色体中都含有5 种组蛋白，除 H1外，无种或组织特异性。（3）非组蛋白：染色体中除组蛋白外的其他蛋白，其种类比组蛋白复杂得多，具种和组织特异性。2、染色体的结构： 染色体基本结构单位为核小体，核小体连接成染色质丝，经卷曲形成螺线管，（中期）后者进一步卷曲成超粗纤维，再进一步浓缩即为染色体。高度浓缩的染色体长度只有DNA双螺旋的1/104左右。3、 染色体的特点：（1） 各条染色体的长度、着丝粒位置， 随体及次级溢痕数目、大小、位置各不相同； （2）不同生物染色体数目不同；（3）细菌等原核生物细胞中不存在形态与结构上的染色体，只有DNA长链分三、 DNA （ATGC ）, 双螺旋线性结构。1、线性的碱基序列提供了真实的遗传信息；DNA互补结构使得细胞分裂过程中的精确复制和传递。2、微生物遗传物质存在状态。真核生物： （1） 染色体 DNA （2）染色体外 DNA-质粒 DNA及细胞器DNA 、部分生物染色体DNA 。原核生物： （1）染色体DNA （2）质粒 DNA 四、基因1、孟德尔“遗传因子”生物性状遗传的符号。2、基因位于染色体上的遗传功能单位。（1）等位基因： 一对同源染色体同一基因座上的一对基因。等位基因之间存在相互作用显隐性关系。一个二倍体细胞中等位基因的关系：（1）完全显性：一个等位基因的功能已足够使某个性状表现。（2）不完全显性：当性状的表现对等位基因的功能有数量上的要求。（3）共显性：杂合子同时表现出双亲的特性。（2）野生型和突变型。野生型。 突变型最常见的是等位基因丧失功能，野精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 1 页，共 14 页生型对突变型而言是显性的。特殊情况：突变型等位基因是获得功能型，产生的蛋白赋予生物体以新的性状，突变型是显性的。（3）非等位基因。 非等位基因：位于同一染色体的不同基因座，或位于不同染色体上的基因。非等位基因之间也存在相互作用。3. 顺反子一个基因一条多肽。顺反子概念把基因具体化为DNA分子的一段序列负责传递遗传信息决定一条多肽链的完整的功能单位又是可分的，组成顺反子的核苷酸可以独自发生突变或重组。4、操纵子遗传信息传递和表达调控的统一体。操纵子是指操纵基因与由它操纵的几个结构基因连锁；并由一个启动子 （转录成为一个mRNA 分子， 并进一步翻译成几种蛋白质）这样的DNA序列结构。5、外显子和内含子基因结构是断裂的。6、重叠基因基因不是一个个分离的实体。有两个基因在编码生成蛋白质时，是从同一个起点开始的；两个基因共有一段重叠的核苷酸序列。7、可动基因或转座元件基因并不是固定在染色体的一个位置上的。（1）有些基因在染色体上的位置是可移动的。（2）微生物中的转座因子。（3）细菌转座因子：插入序列、转座子、接合型转座子、温和性噬菌体完整。第三节 DNA复制转录翻译复制：通过复制，遗传信息能够在细胞带间传递，同时是转录翻译的前奏。转录：在一个DNA模板上合成一个与之互补的RNA链， mRNA ，rRNA，tRNA。翻译：是蛋白质生物合成过程中的第一步。翻译是根据中心法则，将成熟的mRNA 解码，并生成对应的特定氨基酸序列的过程。3.1DNA 复制1、DNA的半保留复制模型；2、DNA的二向复制模型( 模型 ) ；3、DNA的滚环复制模型。3.2 转录1、转录的起始： （1）全酶与模板的DNA接触，生成非专一的, 不稳定的复合物在模板上移动； （2）起始识别：全酶与-35 序列结合，产生封闭的酶- 启动子二元复合物；（3）全酶紧密地结合在-10 序列处，模板DNA局部变性，形成开放的启动子二元复合体； （4）酶移动到 I ，第一个 rNTP转录开始 , 因子释放 , 形成酶- 启动子 -rNTP 三元复合体。2、转录的延伸“尺蠖运动”。3、转录的终止。强终止子内部终止子；弱终止子需要因子，又称为依赖性终止子。3.3 翻译遗传密码的特点： （1）遗传密码是三联体密码。（2）遗传密码无逗号。 （ 3）遗传密码是不重迭的。 （4） 遗传密码具有通用性。 （5）遗传密码具有简并性。 （6）同义密码子。（7） 密码子有起始密码子和终止密码子。（8） 反密码子中的 “摆动”。翻译的起始、延伸、终止。*第四节基因表达规则1、进化过程中，环境应答和适应机制。2、基因表达：复制、转录、翻译。3、调控：主要是转录水平上，翻译水平上较少。4、诱导与阻遏：基因控制机理如诱导和阻遏，都是由mRNA 的转录调节和随后的酶的合成调节完成。阻遏：最终产物过量引起反馈抑制；诱导：启动转录基因的过程，引起基因开始转录的物质称为诱导物。5、乳糖操纵子O （操纵基因） ；lacZ ，Y，A；lacI已成为基因工程的重要工具。（1）lac 启动子突变或lacI突变，控制表达。（2）蓝- 白筛选， IPTGXgal( - 半乳糖苷酶水解产蓝色) 操纵子正调控、 负调控。定义：操纵子的调控，在没有调节蛋白的存在下，对加入的调节蛋白的应答反应来确定。 加入调节蛋白， 基因表达被关闭-负调控；阻遏蛋白； 加入调节蛋白，基因由关闭变表达- 正调控；无辅基诱导蛋白。6、操纵子学说：发现调节基因不变，这种突变型的表型却是组成型，提出乳糖操纵子。定义：基因表达单位，包括结构基因和控制结构基因表达元件。操纵子- 转录单位；顺反子- 多顺反子。*第五节微生物遗传育种技术1、定义： 通常须改变其遗传信息，以弱化或消除不好的性状，加强好的特征或引入全新的特性。2、诱变育种：自发突变，劳动密集型。3、基因重组：遗传物质交换，“杂交”，效率较高，仍属于传统育种。4、重组 DNA ：基因工程手段，快，OMG ，代谢工程。工业微生物菌种的选育，不仅可提高目的物的产量，使目的物产量上百上千倍的提高，大大降低生产成本，提高经济效益，而且通过微生物菌种选育，可简化工艺，减少副产品，提高产品质量，改变有效成分组成，甚至获得活性更高的新成分。一、诱变育种1、诱变育种是指用物理、化学因素诱导遗传特性发生变异，再从变异群体中选择符合要求的株，进而培育成新的品种或种质的育种方法。2、物理因素主要指某些射线，如射线、射线、射线、X射线和中子流等。3、化学因素主要指某些亚硝酸盐、烷化剂，碱基类似物，抗生素等化学药物。优点：方法简单、经济、成熟；复合诱变具有较好的效果。缺点：缺乏定向性，必须与高通量筛选方法结合；诱变后正变株较少，工作量太大，周期长精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 2 页，共 14 页二、重组育种不同种群、不同基因型个体间进行杂交，并在其杂种后代中通过选择而育成纯合品种的方法。优点：基因重组可以将双亲控制不同性状的优良基因结合于一体，或将双亲中控制同一性状的不同基因积累，产生性状上超过亲本的类型。正确选择亲本并予以合理组配是重组育种成败的关键。1、有性杂交： 指不同遗传型的两性细胞间发生的接合和随之进行的染色体重组，进而产生新遗传型后代的一种育种技术。2、准性杂交： 在无性细胞中所有的非减数分裂导致DNA重组的过程， 微生物杂交仅转移部分基因，然后形成部分重组子，最终实现染色体交换和基因重组。3、原生质体融合： 把两个不同亲本菌株的细胞壁，分别经酶解作用去除，而得到球状的原生质体，然后将两种不同的原生质体置于高渗溶液中，由聚乙二醇助融，促使两者高度密集发生细胞融合，进而导致基因重组，就可由此再生细胞中获得杂交重组菌株。优点：不仅可克服因长期诱变造成的菌株活力下降，代谢缓慢等缺陷，也可以提高对诱变剂的敏感性，降低对诱变剂的“疲劳”效应；效率较高。缺点：仍是非定向，只能利用进化上相近的进行杂交；周期仍较长，工作量相对较大。四、重组DNA技术1、定义：利用基因工程，同源重组导致一段DNA链交换，增加新的DNA链。2、技术：定点突变、原生质体、DNA重组技术。 3、目的：（1）利用微生物生产本来不会合成的蛋白质。（2）将现有工业菌株加以改良，提高现有菌株效率；4、典型案例：抗生素和生物碱；5、优点：定向，能够进行超远缘杂交；效率最高，工作量最小；理论上结果最好；6、缺点：对微生物的遗传背景信息要清晰，往往并不如预想的那么好；7、代谢工程相结合第二章突变及其机制定义 1：突变是指生物表型突然发生的可遗传的变化。定义2：突变是指生物生长过程中，由于内因或外因的作用导致染色体DNA结构或数量发生的改变。突变遗传物质核酸（DNA或病毒中的RNA ）中的核苷酸序列突然发生了稳定的可遗传的变化。突变是一种遗传的状态，是基因由于结构发生改变从而由原来的存在状态变为另一种存在状态，即它的等位基因。突变体：带有突变基因的细胞或个体。突变型：突变体的基因型或表型称为突变型，和其相对的原存在状态称为野生型。第一节突变类型和基因符号一、基因符号1、基因符号： 每一基因座位用三个小写英文字母表示，它们来自说明这一基因特性的一个、两个或三个英文单词的前三个字母。产生同一突变型表型的不同基因，用三个字母后面所加的一个大写字母表示。同一基因的不同突变位点用基因符号后面所加的阿拉伯数字表示。如果位点所属的基因还不确定，那么大写字母用一短线表示。例： trp ；trpA 、 trpB ；trpA23|his、rim 、rps|rpsL与 str 。：缺失； +/- ：野生型 / 缺陷型； r/s ：抗性 / 敏感。2、突变型符号（1）在不引起误会时，也用基因座位符号，如hisA 。 （2）在容易引起误会时，在基因座位符号上加“+”或“ - ”或其它符号。如：hisA+,hisA-,strr,strs。3、带突变基因的菌株。二、突变类型：突变、诱变。( 一) 染色体畸变 ：染色体数目的变化或染色体结构发生较大片段的异常改变。1、染色体数目的变化（1) 整倍体 (euploidy)：含有完整的染色体组。（2) 非整倍体：含有不完整状态的染色体组，一般是指二倍体中成对染色体成员的增加或减少。单体（二倍减一，):2n-1；缺体（二倍减二，):2n-2；三体（二倍加一):2n+1 ；四体（二倍加二，):2n+2 ；双二倍加一:2n+1+1 ；部分二倍体：细菌等原核生物中由一整条染色体和外来的一个染色体片段所构成的不完整二倍体。2、染色体结构的变化（1）缺失：染色体较大范围的部分的丢失。细胞学效应：缺失环；遗传学效应：致死、基因定位。（2）重复：染色体较大范围的部分的两次出现。细胞学效应：重复环；遗传学效应：位置效应、剂量效应。（3）倒位：染色体片段180的顺序颠倒。细胞学效应：倒位环；遗传学效应：基因间遗传关系变化、部分不育。（4） 易位：一个染色体的一段与另一个非同源染色体连接在一起。相互易位：两个非同源染色体间相互交换一部分。相互易位的细胞学效应：十字型图象。相互易位的遗传学效应：改变连锁关系、染色体数变异。( 二) 基因突变 -染色体局部座位内的变化点突变：只涉及DNA分子中一对或少数几对碱基的改变。突变发生在一个基因范围内。多位点突变：突变超出一个基因范围。1、碱基置换 ：DNA链上的某一碱基对为另一碱基对所取代。(1) 转换： DNA链中一个嘌呤（嘧啶）被另一个嘌呤（嘧啶）所置换。(2) 颠换： DNA链中一个嘌呤（嘧啶）被一个嘧啶（嘌呤）所置换。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 3 页，共 14 页错义突变：突变后的密码子代表另一种氨基酸。个别碱基的改变导致多肽链上某个氨基酸为另一种氨基酸所取代。同义突变：碱基序列发生改变而氨基酸序列未发生改变的隐蔽突变沉默突变的发生是由于遗传密码的简并性。例：ATT突变为 ATC ， 两者都编码异亮氨酸。无义突变： 突变后的密码子代表终止密码。例： TGC （亮氨酸）突变为TGA （终止密码子）。错义突变具体表现： （1）致死突变：如果错义突变的基因是必需基因，则该基因的突变将严重影响蛋白质活性甚至完全无活性，引起了生物死亡的表现型。（2）渗漏突变： 有不少错义突变的产物仍然有活性，使表现型介于完全的突变型和野生型之间的某种中间类型。（3）中性突变：有些错义突变不影响或基本上不影响蛋白质的活性，不表现出明显的性状变化。这也是一种无声突变。2、移码突变 ：由于一对或少数几对（不是三的倍数）核苷酸的插入或缺失而造成此后一系列遗传密码子的阅读框发生移位错误的突变。三、按表型效应分突变类型野生型：表现该物种正常表型的生物。突变型：由于突变导致其正常的表型发生了改变的生物。1、形态突变型： 引起细胞个体形态和菌落形态发生改变的突变型。 2、生化突变型： 引起特定生化功能丧失而无形态学效应的突变型。包括营养缺陷型、抗性突变型、糖代谢突变型等。（1）营养缺陷型：由于代谢过程的缺陷而不能合成某种与合成初级代谢物有关的基因产物的缺陷型。（ 2）抗性突变型 :抗药物突变型：对原本敏感的药物具有一定的耐性。抗噬菌体突变型：对原本敏感的噬菌体产生抗性。致死突变型: 由于基因突变造成个体死亡或生命力下降的突变型。条件致死突变型在某一条件下具有致死效应，而在另一条件下没有致死效应的突变型。如：温度敏感突变型; 调节突变型 : 丧失对某一基因或操纵子表达能力调节的突变型。突变株的表型成因检出方法营养缺陷型因突变而丧失合成一种或几种生长因子的能力，不能在基本培养基上生长的突变株补充培养基抗性突变型因突变而产生了对某种化学药物或致死物理因子的抗性药物培养基条件致死突变型突变后在某种条件下可正常生长繁殖并实现其表型，而在另一条件下却无法生长繁殖的突变型培养条件改变形态突变型因突变而产生的个体或菌落形态的非选择性变异形态，常用颜色变化抗原突变型因突变而引起的抗原结构发生改变借助于抗原抗体反应产量突变型因突变而获得的，在代谢产量上高于原始菌株的突变株测定产量或其它其它突变型毒力、糖发酵能力、代谢产物等四、从突变的效应背离或返回到野生型：分为正向突变和回复突变1、正向突变：是指改变了野生型性状的突变；2、回复突变： 突变体所失去的野生型性状可以通过第二次突变得到恢复，这种第二次突变就叫回复突变。3、原点突变和第二点突变；（1）原位回复突变（原点突变）：真正的原位回复突变正好发生在原来位点，使突变基因回复到与野生型完全相同的DNA序列，少数； （ 2）第二点突变：原突变位点依然存在，它的表型效应被其他第二点突变所抑制 ( 抑制突变 ) ，使得野生型得以恢复或部分恢复，多数。五、按突变发生原因分类自发突变：未经任何人为的处理而自然地发生的突变，称为自发突变。诱发突变：由人们有意识地利用物理或化学手段引起的突变称为诱发突变。*第二节基因突变的规律1、自发性： 突变可自发产生，突变的微生物与所处的环境因素没有对应关系。2、随机性、不对应性：（ 1）波动实验，说明：E.coli对噬菌体的抗性是在接触噬菌体之前的细胞分裂过程中自发产生的。（2）涂布实验。（3）影印培养实验。3、稀有性： 抗药性突变以一定的突变率发生在个别细胞中。突变率：每个细胞每一世代中发生突变的概率。微生物抗药性的来源：基因突变；抗药性质粒的获得；生理适应。1、生理适应： 是由于细菌长期接触某种抗性因子而具有的暂时的抗药性，但基因没有改变。 2、交叉抗性： 细菌对于两种抗生素等药物同时由敏感状态转变为抗性状态。 3、对于各种药物的抗性突变的发生彼此独立无关；突变的发生对于基因来讲也是随机的；交叉抗性；抗药性是数量性状。4、抗药性突变基因是一个相对稳定的结构。5、抗药性突变基因可发生回复突变。6、抗药性突变的突变率可以通过某些理化因素的处理而提高。7、抗药性突变是DNA分子的某一特定位置的结构发生改变的结果。4、独立性：（1）在微生物群体中，一个细胞的突变与其他个体之间互不相干。 （2） 两个不同基因同时发生突变的频率是两个基因各自的突变率的乘积。（3）交叉抗性：微生物对两种抗生素同时由敏感变为抗性。（4）不矛盾，是单一基因导致的多种抗性。5、可逆性：（1）正向突变； （2）野生型突变为突变型；（3）回复突变。概念：突变型回复到野生型表型的过程。特点：稀有性，随机性，可逆性。抑制突变：真正回复突变，极少，通常为表型抑制。6、可诱发性。7、可遗传性。*第三节自发突变的机制精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 4 页，共 14 页自发突变 - 是指在自然状态下未经诱变剂处理而出现的突变。（1）环境因素的影响：包括自然界的背景辐射、短波辐射、热等作用；（ 2）微生物自身产生的代谢物的影响：如代谢产生的过氧化物、亚硝酸盐、咖啡碱，硫氰化物，二硫化二丙烯，重氮丝氨酸等都是已知的化学诱变剂；（3）DNA分子所携带的转座子所造成的插入突变；（4）DNA复制过程中偶尔发生错误，而分子运动造成的分子结构的互变异构是造成这种错误的主要原因。是真正意义上的自变。1、转座因子的作用（ 1）转座由基因组中存在的转座因子导介的序列重排现象，转座过程中， 转座子留在原位，但新位点上多了一段拷贝，说明发生了DNA复制。 （2）转座子是存在于各类生物的染色体或染色体外质粒中，可自主复制并转座的基本单元，它们通常是细菌染色体或质粒的正常组成部分。转座子可能起到的遗传学效应： （1）转座引起插入性突变转座子插入到其他基因的内部可能造成表达失活，如果蝇的杂种不育是由P转座子造成； IS 因子甚至造成极性变异。 （2）转座带来新的基因位点转座子上带有的基因拷贝给了靶序列，靶位上有了新的基因。转座引起染色体畸变转座子的新旧序列之间可能发生同源性重组，正向重组造成染色体DNA缺失，反向重组造成染色体DNA倒位。 （3）转座引起生物进化转座导介图距甚远的基因靠近，或组成新的操纵子单元，或产生新的可编码序列，产生出新蛋白质，引起跳跃式进化。2.DNA分子的运动碱基的互变异构：酮式烯醇式(e) ；氨基亚氨基（i ） ，便会发生错配；TeG、Ge T、Ci=A、Ai=C，这种碱基化学结构的改变过程称为互变异构移位。环出效应：在DNA复制过程中 , 如果其中某一单链上偶而产生一个小环, 则会因其上的基因越过复制而发生遗传缺失, 从而造成自发突变。 下图就是环出效应的设想机制。3.DNA分子自发的化学变化自发的化学变化: （1）脱氨基作用；（2）氧化作用损伤碱基。脱氨基：在正常的生理条件下，腺嘌呤、鸟嘌呤、尤其是胞嘧啶可以自发地发生脱氨作用，脱去嘌呤环或嘧啶环上的氨基。胞嘧啶脱氨产生尿嘧啶，因此复制时在新生链对应的位点上插入的是腺嘌呤而不是鸟嘌呤。腺嘌呤自发脱氨转变成次黄嘌呤，次黄嘌呤优先与胞嘧啶配对，而不是与胸腺嘧啶配对。因此，腺嘌呤和胞嘧啶的脱氨作用可以造成突变。鸟嘌呤脱氨后变成了黄嘌呤，由于黄嘌呤仍与胞嘧啶配对，只是它们之间只形成两个氢键，因此鸟嘌呤的脱氨作用并不能引起突变。4、氧化损伤： （1）过氧化物原子团（O2-） ； （2） （H2O2） 、 （-OH）等需氧代谢的副产物都是有活性的氧化剂；（3）它们可导致DNA的氧化损伤；（4）T氧化后产生T乙二醇； （5） G氧化后产生8- 氧 -7,8 二氢脱氧鸟嘌呤、 8- 氧鸟嘌呤或 “ GO ” ；（ 6）GO可和 A错配，导致GT。5. 复制差错1、 DNA复制的精确性实际上取决于复制过程中的保真性和错误修复系统。2、前面所讲的都是复制差错产生的原因，但是决定产生差错的确是错误修复系统。第四节诱变剂及其作用机制诱变剂：能提高突变频率的物理或化学因子。( 一) 物理诱变剂1、辐射： UV ，X 射线和射线等；效应：点突变或染色体畸变。间接作用：辐射作用于染色体外物质，产生具有诱变作用的物质。直接作用：辐射直接作用于染色体紫外线UV ，作用机理：与DNA吸收光谱一致；效应：移码突变，碱基置换。电离辐射：X 射线，射线、中子、射线，直接作用：打断化学键；间接作用：通过自由基打断化学键。效应染色体畸变，碱基置换，移码突变。突变率与辐射剂量：突变率与辐射总剂量成正比；突变率与剂量率( 辐射强度的影响) 无关。2、热：机理复杂。作用机理：脱嘌呤。效应：碱基置换，移码突变。3、离子束 : 能量传递、 动量交换， 离子沉积与电荷积累过程; 物理诱变的非特异性。一般为离子注入，即通过将能量100kV 量级一般为离子注入，即通过将能量 100keV 量级的离子束射入到材料中，引起材料表面成分、 结构和性能发生变化。典型例子： ARA菌株。( 二) 化学诱变剂1、碱基类似物： 是指其分子结构同DNA分子中的碱基非常类似，因此能取代碱基参入到DNA分子中的一类化合物。主要诱变剂：5- 溴尿嘧啶和2- 氨基嘌呤；可诱发 AT GC的转换。2、移码诱变剂：嵌入DNA分子相邻碱基对之间，从而有利于核苷酸的环出，因此可提高移码突变的突变率。主要诱变剂：吖啶类化合物；溴化乙锭，ICR 系列化合物等。3、化学修饰碱基的诱变剂：(1 ）羟胺（ HA ） ：和 C 发生反应，导致GC AT；(2）亚硝酸：氧化脱氨基作用，导致 AT GC ；(3 ）烷化剂：使DNA分子的碱基发生烷化反应，从而更容易发生错配，是最常用的一类诱变剂。常用的有：硫酸二乙酯(DES), 甲基磺酸乙酯(EMS)，亚硝基乙基尿(NEU), 亚硝基胍 (NTG), 乙烯亚胺 (EI) 等。 NTG （亚硝基胍）诱变作用特强，作用于复制叉，可诱发多基因并发突变，被称为超诱变剂。*第五节突变生成的过程1、DNA的防护机制（1）抑制基因间抑制：控制翻译机制的抑制者基因，通常是tRNA基因发生突变，而使原来的突变恢复成野生型。基因内抑制指突变基因另一座位上的突变掩盖了原来座位的突变( 但未恢复原来的密码顺序) ， 使突变型恢复成野生型。 （2）致死和选择：如果防护机制未起作用，一个突变可能是致死的。（3）二倍体和多精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 5 页，共 14 页倍体高等生物的多倍体具有几套染色体组，每个基因都有几份，故能比二倍体和低等生物表现强烈的保护作用。诱变剂在 DNA 上的初级效应遗传反应碱基类似物掺入作用AT ? GC 转换羟胺同胞嘧啶起羟化反应GC AT 转换亚硝酸A、C 的脱氧基作用DNA 交联AT ? GC 转换缺失烷化剂烷化碱基（主要是G）而导致：脱嘌呤作用；烷化碱基的互变异构作用；DNA链的交联作用；糖 -磷酸骨架的断裂碱基臵换 （AT? GC 转换、AT TA 颠换、GC CG颠换）及染色体畸变吖啶类个别碱基的插入或缺失移码突变紫外线照射形成嘧啶二聚体； 形成嘧啶的水合物； DNA 交联； DNA 断裂AT GC转换、AT GC颠换及移码突变电离辐射脱氧核糖 -碱基之间化学键及脱氧核糖-磷酸之间化学键的断裂；通过自由基对DNA 的作用AT ? GC转换、移码突变及染色体畸变二、 DNA损伤之前1、诱变剂接触DNA分子之前：（1）细胞的透性影响诱变剂的诱变效应（2）前诱变剂在细胞质的作用下会转化成诱变剂。2、前突变：诱变剂作造成的DNA分子某一位置。 （1）不同的诱变剂所造成的损伤不同。（2）有的诱变剂对复制叉的作用强，如NTG 。 （3）有的诱变剂对转录状态的DNA作用强，如DES 、EMS 。三、 DNA损伤1、一系列物理或化学因素可以对DNA造成化学损伤。 这些因素包括化学诱变剂、辐射以及DNA分子自发的化学反应等。2、有些类型的DNA损伤， 如胸腺嘧啶二聚体或DNA骨架的断裂， 使得 DNA不能再作为复制和转录的模板。3、 错配损伤，在下一轮复制之后导致DNA序列的永久改变。C：G被 T：A转换。四、 DNA的修复（一）复制修复1、DNA聚合酶校读功能：第一次校读，对复制的保真性具有重要作用。PolI和PolIII，但是很多时候被认知为复制范畴，因为错误碱基存在时瞬时的。2、 N-糖基化酶参与的碱基切除修复。作用： 非标准碱基和碱基衍生物的专一识别，参与切除修复； N-糖基化酶： 将脱氨的碱基从DNA中切除掉的核酸酶；尿嘧啶 -N-糖基化酶；啶二聚体糖基化酶：产生AP位点。3、 错配修复系统。 DNA聚合酶的3 5 外切酶活性可将错误掺入的核苷酸去除。聚合酶的校读功能并非绝对安全，有些错误插入的核苷酸会逃脱检测，并在新合成的链与模板链之间形成错误配对。由于复制中出现的错配碱基存在于子链中，因此该系统必须在复制叉通过之后有一种能够识别亲本链与子链的方法，以保证只从子链中纠正错配的碱基。（二） DNA损伤的修复1、光复活作用：把经紫外线照射后的微生物立即暴露在可见光下时，可明显降低其死亡率的现象。2、切除修复 （暗复活）复制前修复，此系统是在几种酶的协同作用下，先在损伤的任一端打开磷酸二酯键，然后外切掉一段寡核苷酸；留下的缺口由修复性合成来填补，再由连接酶将其连接起来。不同的DNA损伤需要不同的特殊核酸内切酶来识别和切割。3、重组修复： 复制后修复，不切除T=T；控制基因： recA,recB,recC；重组酶系： DNA多聚酶、连接酶。胸腺嘧啶二聚体对DNA复制的影响。缺口可用DNA重组方式填补：受损DNA复制时，一条子代DNA分子在损伤的对应部位出现缺口。另一条子代DNA分子完整的母链与有缺口的子链DNA进行重组交换，母链DNA上相应的片段被用于填补子链上的缺口，而母链DNA出现又出现一个新的缺口。母链上的缺口再以另一条子链DNA为模板，经DNA聚合酶催化合成一新DNA片段进行填补，最后由DNA连接酶连接，完成修补；重组修复并不能去除损伤， 损伤仍然保留在原来的位置。但是重组修复能使细胞完成DNA复制，并且新合成的子链是完整的。经多次复制后，损伤就被“冲淡”了，在子代细胞中只有一个细胞是带有损伤DNA的。重组修复机制对于细胞处理不易被修复或者不能被修复的损伤有着特殊的意义。4、SOS修复系统： 依赖于某些蛋白质的诱导合成当DNA受到严重损伤时，染色体的 DNA复制被抑制， 进而诱导细胞产生SOS反应： 大约 20 个参与 DNA损伤修复和 DNA复制功能恢复的基因的表达水平升高，细胞的DNA修复能力得到加强，甚至出现 DNA的跨损伤合成。涉及几个基因：recA 、lexA 、uvrA 、uvrB、uvrC 的共同作用五、突变基因的形成前突变的不同命运：1、正常细胞；2、DNA损伤； 3、突变细胞。环境因素影响：主要是指对修复系统的影响，比如说培养基组成对于系统内的酶的影响，助变剂等。六、从突变到突变型1、表型迟延： 表型的改变落后于基因突变的现象。分离性迟延： 突变基因由杂合状态到纯合状态所造成的表型迟延。生理性迟延：由于基因产物的“稀释”过程所造成的表型迟延。2、表型迟延的消除：诱变后的后培养精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 6 页，共 14 页第三章基因突变的应用* 第一节诱变育种诱变育种：利用物理或化学诱变剂处理均匀而分散的微生物细胞群，促进其突变率显著提高，然后采用简便、快速和高效的筛选方法，从中挑选少数符合育种目的的突变株，以供生产实践或科学研究之用。诱变育种具有极其重要的实践意义。当前发酵工业和其他微生物生产部门所使用的高产菌株，几乎毫无例外地都是通过诱变育种而明显提高其生产性能的。背景和作用： 自然选育的低效率，X射线诱变育种发现；多步积累诱变育种；对照菌株；高通量筛选。作用：（1）提高目标产物的产量。（2）改善菌种特性。（3）开发新产品。 （4）给代谢调控育种提供技术手段。一、诱变育种方案的设计制定明确的目标： （1）充分认识诱变自身特点。（2）充分估计实验能力和方法。 （3）充分了解微生物的特性和初始性状。建立可行的筛选方法：(1）经典方法和简便方法的选择。(2 ）新技术的应用。确定诱变的筛选流程：根据菌种特点和目标确定方法。诱变育种中的几个原则指利用物理或化学诱变剂处理微生物群体细胞，促进其突变率显著提高，然后设法从中选取少数符合育种目的的突变株。2 个主要环节：诱变（随机）：选用合适的诱变剂和诱变剂量处理大量均匀、分散的微生物细胞，以引起绝大多数细胞致死的同时，使存活个体中的突变频率大大提高。筛选 （定向）：设计有效的筛选方法，将少量正变株中的优良菌株挑选出来。二、诱变育种的一般流程出发菌株纯化、活化、同步培养培养液离心收集细胞、洗涤，制备均一的菌悬液（玻璃珠打散、过滤）单细胞或单孢子悬液活菌计数，诱变预备试验诱变处理活细胞计数，致死率计算中间培养 ( 后培养 ) 平板分离变异率计算初筛复筛保藏及扩大试验第二节营养缺陷型突变株的筛选营养缺陷型：是指丧失了合成一种或多种必需生长因子能力的菌株，它们只能在补充了相应的生长因子的培养基上才能正常生长。野生型：从自然界分离到的任何微生物在其发生营养缺陷突变前的原始菌株，均称该微生物的野生型。原养型：营养缺陷型突变株经回复突变或重组后产生的、其营养要求在表型上与野生型相同的菌株。完全培养基 （CM ） ：含有满足某微生物的所有营养缺陷型和野生型菌株生长所需营养物质的天然或半合成培养基。基本培养基 （MM ） ：不含生长因子仅能满足某微生物的野生型菌株生长需要的最低成分合成培养基长需要的最低成分合成培养基。补充培养基 (SM)：补充了一种或数种生长因子，以满足某微生物的特定的营养缺陷型生长的培养基，其中的生长因子多是通过直接添加AA 、碱基或维生素而提供。营养缺陷型突变株的应用：阻断代谢途径，积累中间代谢产物；阻断分支代谢，改变代谢流向，积累另一终端代谢产物；解除反馈抑制，积累代谢产物；利用渗漏缺陷型进行代谢调控育种。筛选方法：（1）诱变处理。 （2）后培养：在CM中进行，消除突变细胞的表型延迟 （生理性延迟和分离延迟）。 （ 3）淘汰野生型：降低野生型细胞的数量和比例，使营养缺陷型细胞得以相对浓缩使营养缺陷型细胞得以相对浓缩。（4）检出缺陷型： 浓缩后的仍然是混合物，因此需要将缺陷型分离检出。（5）鉴定缺陷型：检出后，仍需进一步鉴定是何种缺陷型。第三节抗反馈调节突变型的筛选及应用一、抗代谢类似物突变型的筛选抗反馈调节突变株：是指一种对反馈抑制不敏感或对阻遏有抗性的组成型突变株，或兼而有之的突变株。代谢类似物：结构与代谢物类似，因此可起到代谢物所具有的调节作用的一类化合物。真正代谢物功能：合成大分子；调节功能（反馈）。代谢类似物：只有调节功能，不能合成有活性的生物大分子。加入代谢类似物，将关闭相关代谢物的合成，从而影响微生物的生长。（一）抗反馈抑制突变发生基因突变的细胞：酶结构基因发生突变导致调节酶的调节部位发生改变，不再与结构类似物（或产物）结合，从而解除了产物的反馈抑制作用，使产物得以合成。（二）抗阻遏突变型1、阻遏的原理： （1）产物是辅阻遏物。 （2）通过与调节基因的产物阻遏蛋白的结合而激活阻遏蛋白。（3）被激活的阻遏蛋白通过与操纵基因结合而终止结构基因的转录。 2、抗阻遏突变：由于调节基因发生突变，使产生的阻遏蛋白不再精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 7 页，共 14 页能和辅阻遏物结合，或由于操纵基因发生突变，被激活的阻遏蛋白不能作用于已突变的操纵基因，从而解除产物的阻遏作用，使产物得以过量积累。（三）结构类似物和抗结构类似物突变抗结构类似物突变株：能在含有结构类似物的基本培养基中生长的菌株。原因：解除了反馈调节，有可能是抗反馈抑制突变株，也有可能是解除了终产物对代谢途径酶的反馈阻遏作用。终产物结构类似物过量积累产物精氨酸D- 精氨酸精氨酸苯丙氨酸对氟苯丙氨酸 ,噻吩丙氨酸苯丙氨酸赖氨酸AEC 赖氨酸酪氨酸对氟苯丙氨酸,D- 酪氨酸酪氨酸色氨酸5- 碱基色氨酸 ,6- 甲基色氨酸色氨酸脯氨酸3,4- 二氢脯氨酸 ,磺胺胍脯氨酸腺苷酸2- 氟腺嘌呤腺苷酸葡萄糖2- 脱氧葡萄糖b-葡萄糖苷酶蔗糖 ,麦芽糖2- 脱氧棉子糖蔗糖酶纤维二糖 ,葡萄糖甘油纤维素酶（四）筛选方法： （1）将经过诱变的细胞直接涂布在含有一定浓度结构类似物的基本培养基平板上，长出的菌落即为抗结构类似物突变株；（ 2）将经过诱变的细胞涂布在基本培养基平板上，在平板的中央加少量结构类似物，在抑菌圈内长出的个别菌落即为抗结构类似物突变株。三、菌种的退化、复壮和保藏（一）菌种退化及其防治1、菌种退化的表现：生产性状劣化，遗传标记丢失，原有的典型性状变得不典型。具体表现：菌落及细胞形态的改变；生长速度缓慢，产孢子越来越小；代谢产物生产能力下降；抗不良环境条件（抗噬菌体，抗低温）能力减弱。2、退化原因：基因自发突变；诱变后菌株本身不纯，多核细胞中单核突变，单核细胞中单链改变等；其他原因。总之，退化是发生在群体细胞中的一个从量变到质变逐步演变的过程，由于个别突变细胞表现生长优势导致在群体中最后数量占优势。3、 退化的防治： （1） 从菌种选育方法上考虑：进行充分的后培养及分离纯化；增加突变位点，减少基因回复突变的几率。（2）从菌种保藏方式上考虑：尽量减少传代次数；选择适宜的保藏培养基。（3）从菌种培养适宜条件上考虑：结构类似物抗性菌株在保藏培养基中应添加相应药物，及时淘汰回复突变细胞；基因工程菌添加抗生素于培养基中防止质粒的丢失。（4） 从菌种管理的措施上考虑: 复壮。定期对保藏菌种分离纯化，淘汰已退化细胞；定期对发酵液进行分离筛选，选取自发性突变的细胞生产育种。（二）菌种的保藏目的：不死，不衰，不被污染，便于研究交换使用。原理： 挑选优良纯种， 最好是休眠体;创造最有利于休眠的环境条件，创造使微生物代谢不活泼，生长受抑制（休眠）的环境条件，如：干燥，低温，缺氧，缺乏营养，添加保护剂及酸度中和剂等。方法：定期移植保藏法：斜面冰箱保藏法；半固体穿刺冰箱保藏法；液体石蜡法 （石蜡油封藏法） ； 砂土管保藏法； 冻结真空干燥保藏法；液氮超低温保藏法。（三）菌种复壮广义复壮：在菌种的生产性能尚未退化之前经常进行纯种分离和生产性能测定，从生产中筛选自发正突变的细胞。狭义复壮：在菌种已经发生退化的情况下，通过纯种分离和生产性能测定等方法从退化的群体中找出少数尚未退化的个体，以达到恢复该菌原有典型性状的措施。第四章基因重组育种1、遗传重组的一般概念。遗传重组： 遗传重组是指遗传物质从一个细胞向另一个细胞传递并导致DNA交换和重排的过程。遗传改造的手段包括基因突变和基因重组。微生物中遗传物质的传递方式：真核微生物：有性生殖和准性生殖；原核微生物：接合、转化、转导。2、重组。 （1）广义： 指由于独立分配或交换在后代中出现新的基因组合的过程。 （2）狭义：仅指基因交换或重排而产生的重组。（3）重组的主要类型：同源重组；位点特异性重组；转座重组。3、细菌遗传物质的传递方式。（1）转化：受体细胞直接吸收裸露的外源DNA并与其自身遗传物质发生重组的过程。（2）接合：通过供体菌和受体菌完整细胞间的直接接触而传递大段DNA的过程（3）转导： 通过噬菌体作媒介把供体的遗传物质传递给受体细胞的过程。*第一节细菌的转化定义：受体细胞直接吸收裸露的外源DNA并与其自身遗传物质发生重组，从而使受体细胞获得共体细胞部分遗传性状的现象。一、转化 DNA 精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 8 页，共 14 页转化因子的化学本质离体的DNA片段。1、转化 DNA的种类：（ 1）同源 DNA片段 - 整合重组：经典意义上的转化;（2）异源 DNA片段 - 与载体相连：不整合，独立复制，基因工程转化；（3）同源 DNA片段 -与载体相连：整合或不整合。 转化（经典意义转化） ：受体菌直接从周围介质中吸收来自供体菌的DNA片段，并将其整合到自己的染色体基因组中，从而获得后者部分遗传性状的现象；转化子：经转化所得的重组子。2、转化 DNA需具备的条件：（ 1）与受体 DNA有一定的同源性； （2）有合适的长度： 106道尔顿， 过小，受体细胞不吸收； （3） dsDNA比 ssDNA转化活性高，即DNA完整的双链结构对转化活性很重要，甚至是必需的；（4）要有一定的浓度：在一定条件下，转化子数目与转化DNA浓度成正比， 当达到一定浓度后，转化子数目不再增加，这时的 DNA浓度称为转化的饱和DNA浓度。二、受体细胞的特点1、感受态： 即受体细菌能吸收外源DNA并进行转化作用时所处的生理状态。（1）感受态与转化DNA的吸收有关，和DNA是否整合无关。 （2）决定感受态的因素：遗传特性和环境条件。2、感受态通常取决于生长条件：（ 1）生长阶段：肺炎链球菌、枯草杆菌对数后期；（2）出现频率：枯草杆菌：10-20%，肺炎链球菌：几乎100% ； （3）持续时间：枯草杆菌：数小时，肺炎链球菌：约40 分钟。3、感受态可诱导产生： （1）从营养丰富的培养液中转移到营养贫乏的培养液中；（2）抑制核酸合成但不抑制蛋白质合成的处理；（3）CaCl2处理；（ 4）加入感受态因子，感受态因子：伴随感受态而出现的位于细胞表面的蛋白质分子。4、感受态细胞的特点：（1）细胞表面的正电荷增加；（2）细胞壁的通透性增加；（ 3）细胞表面的DNA分解能力增加。感受态的本质，存在两种假说：1、局部原生质体化假说：细胞壁阻碍DNA进入菌体，在某些条件下，菌体局部失去细胞壁，转化DNA便能通过细胞膜进入菌体。证据：（ 1）发芽中的芽孢比营养体容易转化；（2） 转化 DNA进入受体的位点多在细胞分裂新合成的细胞壁处，因为此处细胞壁不完整；（3）适量的溶菌酶处理可提高转化率。2、感受态因子假说： 细胞表面出现一种能结合DNA并使它进入细胞的蛋白质（感受态因子）。证据：（1）已从一些细菌的感受态细胞中分离出这种蛋白质性质的感受态因子它们可使非感受态细胞进入感受态；（2）感受态的出现和细菌代谢有关，能被蛋白质合成抑制。三、转化的过程分为三个阶段：DNA的吸收、前整合复合物的形成和整合重组。1、DNA的吸收 ：是指处于感受态的受体细胞从环境中摄取DNA并将其转移至细胞内从而免受DNase降解的一系列过程。包括吸附和进入两个阶段。（1）吸附： DNA结合在细胞表面，这时它们不被洗脱，但仍对DNase敏感，这一过程称为吸附。（2）进入： DNA随后被运送至细胞内并变成DNase抗性，这一过程称为进入。DNA吸收的条件：（1）受体细胞处于感受态；（2）对 DNA具有专一性，不吸收 RNA; （3） 细胞对 dsDNA具较高亲和性 , 吸收 ssDNA的能力只有前者1/100 。（4）DNA要有一定大小； （5）G-还要求外源DNA要有较严格的同源性。G+和 G-不同。 （1）吸附： G-菌的 DNA上有与细胞结合的位点，它可被细胞上的受体识别，而G+菌的 DNA上没有与细胞结合的位点，吸附需要细胞表面的一种结合因子。（2）进入： G+菌吸收的最终结果是一条链进入受体细胞，而G-菌则是双链进入细胞壁。转化因子的吸收(G+菌) ： （1）核酸内切酶将吸附的DNA切成约107d 的片段；（2）核酸酶切除一个单链；（ 3）剩余的一个单链进入细胞。2. 前整合复合物的形成ssDNA 不被降解，是因为它们和一种蛋白质形成前整合复合物。这种蛋白质是在感受态发育期诱导合成的。前整合复合物的作用：（1）保护供体DNA免受降解； （2）促进 DNA的吸收；（3）增强 ssDNA刚性，从而促进ssDNA整合。3、整合；转化因子的单链DNA和受体染色体的某一部分形成供体- 受体复合物；供体DNA和受体 DNA形成共价键，同时被替代的一小段DNA为酶所分解；作用酶：核酸酶、 DNA多聚酶、 DNA连接酶。4、影响转化效率的因素（1）受体细胞的感受态。 （2）受体细胞的限制酶系统和其它核酸酶。（3）受体和供体染色体的同源性。5、大肠杆菌的转化：（1）CaCl2处理可人工诱发感受态的产生。（2）质粒 DNA可直接进入细胞，并且不与染色体DNA整合，保持游离状态。四、转化育种例： B.subtilis供体： SB19(trp+) 受体： 168(trp-)1、供体菌DNA的制备。 2、感受态受体菌的培养。3、转化。 DNA的提取方法简化。 （1） 将处于对数生长期的菌液，在 0下 3000rpm. 离心 30 分钟，用 NaCl-EDTA溶液洗涤菌体两次，收集和称量菌体。（2）菌体中加入溶菌酶和NaCl-EDTA 液（pH8.0）在 37保温 10-20 分钟，菌液变稀后，立即放入干冰或液氨中冷冻，然后加入 Tris-SDS 缓冲液（ pH9.0）60保温，待菌体溶解。 （3）加入等体积的90% 重蒸苯酚，于0冰箱振荡20 分钟， 4500rpm. 离心 30 分钟，吸取上清液，用重蒸苯酚再抽提一次，吸取上清液。（ 4）放入烧杯中，沿烧杯边缘慢慢加入二倍精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 9 页，共 14 页体积预冷却的95% 乙醇，轻轻摇动，DNA 呈絮状，沉淀析出收集沉淀， 溶于 0.15MNaCl和 0.015 柠檬酸钠溶液（pH7.0） ，存于 4冰箱中。 4、转化子分离：涂布MM 培养基平板， 37培养 48h。五、转化的特殊类型1、真核微生物的转化：原生质体转化、酿酒酵母可通过Li+处理，人工诱发感受态。 2、RNA转化。 3、转染：用除去蛋白质外壳的病毒DNA或 RNA通过转化过程进入受体细胞或原生质体，使后者得以感染。转化的技术： （1）原生质体转化，PEG介导转化；（2）电转化（电穿孔法） ，用高压脉冲电流击破细胞膜或将细胞膜上击出小孔使DNA片段进入细胞； （3）基因枪转化：将包裹有DNA的钨颗粒像子弹一样用高压射进细胞，并使DNA留在细胞内。* 第二节细菌的接合供体细胞和受体细胞直接接触后，质粒从供体细胞向受体细胞转移的过程。一、细菌接合作用的发现和证实1、发现： 1946，J.Lederberg和 E.T.Tatum ；实验： E.coliK12可能：（ 1）细菌接合以后发生基因重组；（2）发生了转化；（3）通过交换了养料而互养；（4）回复突变；接合后形成异核体或杂合二倍体。2、证实：(1) 转化作用的排除： 1950，Davis 的 U型管试验； (2) 互养的排除：A+B-T1rA-B+T1s；(3) 回复突变的排除；(4) 异核体和杂合二倍体的排除。二、细菌的接合型与F 因子1、性因子的发现1952，W.Hayes 在 MM 上： AstrsBstrr, 获重组菌落， AstrrBstrs, 获重组菌落。在 MM+str 上： Astrs Bstrr, 获重组菌落，AstrrBstrs, 无重组菌落。说明：遗传物质AB F+: 雄性 , 供体 , 提供 DNA ；F-：雌性，受体，接受DNA 。2、F因子（致育因子） ：cccDNA ，95kb，12 个/cell。3、F 因子的特性： F 因子可以转移； F 因子可自发失去；F 因子可经吖啶橙等处理而失去；F因子一旦消失不能再现，除非与另外的F+细胞接触而获得； F因子可自体复制。4、 F 因子在细胞内的存在状态：自主态：含有自主态F因子的细胞叫F+细胞；整合态：含有整合态F 因子的细胞叫Hfr 细胞。5、F-、F+、Hfr 菌株： F+菌株：细胞表面具有性纤毛；Hfr 菌株； F-菌株。三、细菌接合作用1、F+F-结果： F-转变为 F+。2、Hfr F-：HfrDNA 的转移。3、F+F+，Hfr Hfr ：由于存在于细胞表面的由tra基因编码的蛋白质赋予细胞的表面排异作用，使F+F+、Hfr Hfr 不能杂交。4、 F+与 Hfr 菌株的异同点。四、细菌接合的遗传分析中断杂交及转移时间定位：（1）利用一些机械方法或DNA合成抑制剂在不同时间中断杂交。 （2）在特定条件下DNA转移速率是稳定的，因此供体DNA上某一基因在受体中出现的时间应能反映该基因离开起点的距离。（3）离起点越近，性状表现越早， 反之则晚。并且两个性状出现的时间差值应能表现二者的相对距离。五、 F因子转导1、 F因子：带有细菌基因的F 因子。例F-lac ，F-gal ，F-pro 2、 F因子的形成：Hfr 菌株中 F 因子的异常切除。3、 F菌株：含有F因子的菌株。有初生F菌株与次生F菌株之分。4、 F因子转导（性因子转导、性导）通过F因子的转移而使受体细菌改变其遗传性状的现象转导子为部分二倍体，如lac-/F-lac+。相同点含有 F 因子，都具有性纤毛，都具有接合作用不同点Hfr 细菌F+对于吖啶橙处理稳定F 因子易失去传递供体染色体基因高频 (10-3-10-4) 低频 (10-6-10-7) F 因子本身转移基本不能频率 70% 以上F 因子复制随细菌染色体复制独立复制*第三节转导通过噬菌体作为媒介，而把一个细菌的基因导入另一个细菌的过程叫转导。转导的组分：供体细菌，受体细菌，转导噬菌体。一、局限性转导只能传递供体染色体上原噬菌体整合位点附近的少数固定基因的转导。1、噬菌体：温和性噬菌体，如等。2、转导噬菌体的形成：Campbell模型（不正确切离） 、形成频率：10-6。转导噬菌体：缺陷噬菌体dgal 或 dbio 。3、稳定转导子的获得：dgalDNAgal 基因与受体gal- 基因之间双交换，得到稳定的 gal+转导子。稳定转导子约占转导子的1/3 。4、不稳定转导子的获得：dgalDNA 通过 BP 与受体BB位点之间的单交换，形成一个带缺陷原噬菌体的gal+/gal部分合子（不稳定转导子）。 （1）整合的 dgalDNA偶然会从受体染色体上逸出，从而产生gal- 分离子。（ 2）不稳定转导子约占转导子的2/3 。二、普遍性转导能传递供体的任何基因的转导。1 、 噬 菌 体 ： 烈 性 噬 菌 体 或 经 过 改 造 的 温 和 性 噬 菌 体 ， 如SalmonellatyphimuriumP22,E.coliP1。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 10 页，共 14 页2、转导噬菌体的形成： （1）选择性包裹模型； （ 2）形成频率： 10-6。3、完全转导与完全转导子：通过双交换而实现约占1/10 。4、流产转导与流产转导子：进入受体的供体DNA片段既不复制，也不整合，但能正常表达。约占9/10 。5、共转导：（1）由一个转导噬菌体同时传递两个供体基因的转导。（2） P1同时传递thr+leu+基因至受体thr-leu-，产生原养型转导子的频率占转导子数的1% ； （3）共转导的频率，F=（1-d/L ）3。普遍性转导局限性转导能转导的基因供体的任何基因特定基因 , l:gal,bio 噬菌体在供体菌中的位臵无特定的位臵有特定位臵， gal-l-bio 转导噬菌体的获得自发裂解或诱导裂解诱导裂解转导子非溶源性1/10稳定的完全转导子9/10不稳定流产转导子缺陷溶源性1/3稳定转导子2/3不稳定转导子第四节有性生殖与无性生殖有性生殖准性生殖导致有性孢子的产生，其形态、生理均与营养体细胞不同，往往产生在特殊的囊器中。导致重组体细胞产生，其和一般营养体细胞相同，不产生在特殊的囊器中。减数分裂导致基因重组，减数分裂中染色体交换和减半是有规律的协调过程，是必然的。有丝分裂导致基因重组，有丝分裂中染色体交换和减少是不规则且不协调的过程，是偶然的。* 第五节原生质体融合技术（一）原生质体融合技术简介原生质体： 微生物或植物去除细胞壁后的结构。细胞壁被酶解剥离, 由细胞质膜包围的结构。原生质体的特性：没有细胞壁；失去细胞刚性，呈球形；对渗透压敏感；代谢活性弱。原生质体基本保持原细胞结构、活性和功能。原生质体融合：通过人为方法，使遗传性状不同的两细胞的原生质体发生融合，并产生重组子的过程。原生质体融合育种的优势：基因重组频率提高；重组的亲本范围扩大；融合子集中两亲本优良性状的机会增大。（二）原生质体融合技术的一般步骤（ 1）融合亲本的选择与标记；（ 2）原生质体的制备； （3）原生质体的融合；（4）原生质体的再生； （5）融合子的选择与鉴定；（ 6）目标菌株的筛选。第六节总结基因重组涉及范围供体受体间关系整个基因组部分染色体个别或少数基因细胞融合或连接性细胞真菌的有性生殖体细胞真菌的准性生殖放线菌接合细胞暂时沟通细菌接合F 因子转导细胞不接触转导转化第五章基因工程育种重组 DNA技术：基因工程是将不同生物的基因在体外人工剪切组合并和载体（质粒、噬菌体、病毒）DNA连接，然后转入微生物或细胞内，进行扩增，并使转入的基因在细胞内表达，产生所需要的蛋白质。奠定基因工程的三项关键技术：DNA的特异切割； DNA的分子克隆； DNA的快速测序。基因工程操作的主要步骤：1、分离或合成基因；2、通过体外重组将基因插入载体； 3、将重组 DNA导入细胞； 4、扩增克隆的基因；5、筛选重组体克隆；6、对克隆的基因进行鉴定或测序；7、控制外源基因的表达；8、得到基因产物或转基因动物、转基因植物。*第一节基因克隆的酶学基础核酸酶：通过切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸二酯键，从而导致核酸分子多核苷酸链发生水解断裂的酶。一、限制性核酸内切酶简称限制性酶，是指能识别双链DNA分子的特定序列，并在识别位点或其附近切割 DNA的一类内切酶。1、寄主控制的限制与修饰作用：（1）寄主控制的限制作用。作用：破坏外源DNA ，使之迅速降解。机制：限制性核酸内切酶，识别特定的碱基序列，并进行切割。 （2）寄主控制的修饰作用：作用：保护自身的DNA ，使之不受限制。机制：甲基化酶，催化S-腺苷甲硫氨酸的甲基转移到限制酶识别序列的特定碱基（A或C)，使之甲基化。2、限制性核酸内切酶的命名：用产生菌的属名一个字母( 大写 ) 种名两个字母( 小写 ) 菌株名一个字母 编号（罗马数字）酶切产物：有些限制性内切酶剪切后产物末端带有单链尾，被称为粘性末端，粘性末端易于连接，但单链尾必须能配对。其它限制性内切酶剪切后，产物末端无单链尾， 被称为平端。 同裂酶： 来源不同但识别和切割相同序列的酶。同尾酶：有些来源不同的限制酶，识别及切割序列各不相同，但能产生出相同粘性末端。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 11 页，共 14 页特性型型型功能限制、修饰限制限制、修饰蛋白质结构3 种不同亚基单一成分2 种不同亚基所需辅助因子ATP, Mg2+, SAM Mg2+ATP, Mg2+, SAM 识别序列EcoB:TGA(N)8TGCT 4-8bp, 旋转对称EcoP1:AGACC 切割位点距识别位点至少1000bp处随机切割在识别序列内或附近距识别位点3- 端24-26bp处二、 DNA连接酶基本功能：修复双链DNA上的裂口。即催化两个双链DNA片段相邻的5-P与 3-OH之间形成磷酸二酯键。体外 DNA连接： （1）连接具有互补粘性末端的DNA片段。 （2）连接具有平末端的 DNA片段。 （3）先在 DNA片段末端加上人工接头使其形成粘性末端，再行连接。平末端连接：平末端一般要避免出现，其连接效率低，且易错配。提高连接效率的方法：(1) 加大连接酶用量（10 倍大于粘性末端的连接）。(2) 加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会。(3) 加入 10%PEG8000 ，促进大分子之间的有效作用。 (4) 加入单价阳离子（NaCl） ，最终浓度150-200mM 。三、反转录酶催化以 mRNA 为模板的cDNA 的合成。四、 DNA 聚合酶催化以 DNA或 RNA为模板合成DNA的一类酶的总称。真核有四种聚合酶，原核有三种聚合酶；DNA聚合酶 I 和 III常用， 其中 III是主要的复制酶。基因工程中常用的的有DNA聚合酶 I （原核）， Klenow 片段， T4 聚合酶， T7聚合酶，反转录酶和Taq 聚合酶。* 第二节克隆载体克隆载体：以繁殖DNA片段为目的的载体。载体由质粒、病毒或染色体衍生的遗传因子，能在宿主细胞中自主复制，可以携带外源DNA 。类型：质粒、噬菌体、粘性质粒、酵母人工染色体。克隆载体的基本要求： （1） 在宿主细胞细胞中具有自主复制和表达能力；（ 2）能与外来DNA结合而不影响本身的复制能力；（3）分子量小、拷贝数高，容易进入宿主细胞；（4）具有多种限制性内切核酸酶的单一切点（多克隆位点）； （5）必须有至少两种选择性遗传标记；还应具有较好的安全性、易制备、易于表达等。一、质粒载体质粒载体：在天然质粒基础上，人工构建而成。带有一个或几个选择性标记基因；带有一个多克隆位点序列；去掉大部分非必要序列；还可带有多用途的辅助序列。多克隆位点： 载体中用于插入外源基因的区域，往往是一段人工合成的序列，这一序列中含有多种限制性内切酶的单一切点。环状双链质粒DNA的构型： 共价闭合环状DNA(cccDNA):两条链均保持完整的环状构型，通常呈现超螺旋的SC构型。开环DNA(ocDNA) ：一条链保持完整的环状结构，另一条链出现有一至数个缺口，即OC构型。线形DNA(lDNA)：质粒 DNA经过适当的限制性核酸内切酶的切割后，发生双链断裂，称L 构型。质粒载体的选择标记：常用抗生素抗性标记：四环素抗性tetr；氨苄青霉素抗性 ampr；氯霉素抗性catr；卡那霉素抗性kmr。质粒的复制：质粒的复制起始和拷贝数是由质粒DNA序列控制的。质粒分子中为质粒复制所必需的最小区段称为基本复制子，它由两部分组成，一是复制原点(ori)，二是调节复制起始的基因（编码蛋白质或RNA)。质粒的不相容性： 在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞中稳定共存的现象。同一不亲和群：不能共存于同一细胞中。不同的不亲和群：能共存于同一细胞中。二、噬菌体克隆载体1、优点： 遗传学背景十分清楚。载体容量大， -23kb 。具有较高的感染效率。2、构建：删除基因组中非必须区。除去多余的限制位点。3、类型：插入型载体: 其限制酶位点可用于外源DNA的插入。取代型载体：具有成对限制酶位点，外源DNA可取代两个限制位点上的DNA区段。三、柯斯质粒载体由噬菌体的粘性末端和质粒构建而成。含有来自质粒的一个复制起点、抗药性标记、一个或多个限制酶单一位点，来自噬菌体粘性末端的DNA片段 (cos位点 )。优点：具有噬菌体的高效感染力，进入宿主后仅以质粒形式存在。具有质粒DNA的复制方式。具有克隆大片段外源DNA的能力 (45kb) 。柯斯重组DNA的体外包装：由大片段插入柯斯质粒后重组成的大分子不能侵染噬菌体。一般是由两种包装型变异株解决包装，分别使其一成为头部蛋白合成缺失，另一种成为尾部蛋白缺失。两种包装用噬菌体蛋白与重组大分子相混合，以 cos 为末端的单元段就会被包装。质粒载体的稳定性问题：（1）结构不稳定性经常观察到自发的序列缺失现象，可能发生过自发重组，或转座子引起的插入作用。（2）子代拷贝分配不均造成不稳定性不均等分配的几率虽然很低，但是空载的细胞具有更轻的负担。 （3）个别细胞质粒拷贝数差度造成不稳定性。（4）某些质粒的随机分配机制造成不稳定。 （5）实载后新陈代谢负荷造成不稳定性实载加重寄主新陈代谢的负担，甚至使得其世代时间延长15% 左右，生长速度的减慢经过世代积累后，造成实载细胞的数量不断减少，最终以空载的细胞占上风。（6）寄主致死功能造成的不稳定性质粒赋予寄主某种特殊功能，一旦被改变则可能造成寄主的致死。（7）寄主精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 12 页，共 14 页的重组体系对质粒载体的破坏。防止质粒丢失的办法： （ 1）取用强的复制原点。 （2）取用强的启动子序列。（3）采用毒素或抗生素抗性基因，其表达产物可杀死不带质粒的其他细胞。（4）特殊情况下， 使用温度变化杀灭空载细胞。 （5） 尽量减轻质粒编码蛋白质的负担。表达体系产物产生部位培养方式提纯产物活性潜在危性大肠杆菌多肽蛋白质， 融合蛋白质菌体内容易，部分高产一般对原核好，对真核差不大酵母多肽蛋白质， 糖基化蛋白菌体内外分泌容易，可高产菌体内稍复杂真核的接近天然产物不大哺乳动物完整糖基化蛋白外分泌较难，成本高，可高产简单可达天然产物需注意致癌* 第三节重组子的筛选与表达一、遗传学检测法往往根据供体和载体的遗传表现型选择：如，蓝白反应、透明圈反应、沉淀圈反应、抑菌圈反应、噬菌斑反应、营养缺陷型反应、抗性标记、插入失活反应等。植物当中还有使用报告基因进行筛选（LUC ） 。多数情况下，采用的载体带有已知标记，但供体片段不一定能表现出直接的选择标记，必要时应辅以其他的筛选技术。 - 互补：所谓基因内互补作用，在 LacZ 体系中 , 是指二个彼此互补的突变基因（突变体1 只含 LacI 和 LacZ 的 N端 145 个氨基酸的肽；突变体2 缺乏 LacZ的 N端肽），它们编码产生的无活性的多肽产物，但由于二个突变体之间通过肽互补作用可呈现有功能的- 半乳糖苷酶活性,进而可分解底物X-gal 而产生半乳糖和深蓝色的底物5- 溴-4- 氯- 青定蓝 , 使菌落呈现出蓝色反应。然而当外源基因 DNA片段插入载体中LacZ肽区段的多克隆位点后, 就会阻断序列的读码结构, 使其编码的肽失去活性, 使重组子所在的细菌不能完成- 互补因此带有外源基因重组子的细菌形成白色菌落。二、物理检测法（ 1） 用于检测从初选的克隆细胞中分离出的重组DNA 。（2） 凝胶电泳检测法，比较是否获得比载体更大的重组DNA 。（3） R 环- 检测法，以原始的mRNA 为探针，与初筛的重组DNA分子加热退火杂交， 双链以外的单链环突部分在电镜下观察到，可以检测出是否已获得重组DNA分子。（4）限制性酶切图谱法，是应用最广泛的一种。三、分子杂交法定义：通过一定同源性的两条核酸（DNA 、RNA ）单链在适宜的温度和离子强度下，按碱基互补配对原则高度特异性的复性形成双链。根据核酸种类及结合到固相支持物的方法可分为：Southern 、Northern 、原位、斑点杂交等方法。分子杂交中，放射自显影最为灵敏，但是其它方式也各有用途。原位杂交：先以带标记的三磷酸核苷酸作为dsDNA补链底物，用Dnase I 和Klenow Fragment 处理，补链后标记渗入DNA链中，可作为探针用。含有重组DNA菌落的平板影印，制成副版，将所有的菌落原位复印到硝酸纤维膜上，固定后，碱处理，暴露出 DNA,并以真空烘焙固定于膜上。随后，以探针与膜上的DNA杂交，探针留在与其同源的菌落位点处，指示出杂交阳性的菌落所在之处。该法是从基因组文库中筛选目的基因的首选方法。斑点杂交： （1) 重组体 DNA或 RNA抽提出来 , 点膜，然后杂交。 （2) 提取纯化后 ,杂质少 , 所以能得到更为确切的结果, 既可用于定性也可通过内参照进行相对定量。核酸探针：上述各种杂交的方法，能够快速的筛选重组子，但是前提是必须有探针。常见的探针： （1）同源或部分同源探针；（2）总 cDNA探针（ 3）特异性cDNA探针； （4）人工合成的寡核苷酸探针。探针应符合以下要求：（ 1）标记物不影响探针理化性质； （ 2）检测灵敏，重现性好；（3）操作简便；（4）化学稳定性高； （5）安全。探针有放射性和非放射性- 生物素；荧光物质等。菌落 PCR ：是直接以转化菌的单个克隆为模板, 通过特异性引物或通用引物对插入载体中的目的基因快速扩增，用于鉴定和筛选阳性转化菌的技术。与传统的鉴定方法相比,由于其具有快速、经济、 简便的特点而被广泛用于转化菌、特别是大量转化子的鉴定和筛选。四类核酸分子杂交法的技术路线比较菌落原位杂交斑点杂交Southern印迹Northern印迹菌落或噬菌斑转印到膜上抽提 DNA/RNA 提取 DNA 提取 RNA 裂解细菌或噬菌斑变性核酸样品琼脂糖凝胶电泳变性 DNA 将核酸点加到膜上将凝胶上核酸条带转移到膜上同时变性将核酸固定在膜上预杂交（消除非特异吸附位点）加入核素标记探针进行杂交漂洗膜（洗去非特异结合探针）放射自显影或显色反应示踪四、免疫筛选法技术思路与探针杂交法类似，但使用特定的抗体或抗体三明治鉴别目的克隆子。分为免疫沉淀检测法和放射性第二抗体法，后者利用第二抗体- 第一抗体 - 抗原复合体的形成，带放射性的位点指示出目的菌落所在之处。五、转译筛选法杂交抑制的转译如果目的基因能够转录出丰富的mRNA ，可以以mRNA 其与重组体系的DNA分子杂交，杂交分子在无细胞转译体系( 大肠杆菌体系、麦胚体精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 13 页，共 14 页系、兔网织红细胞体系）中不能得到转译，那么从杂交分子中释放下的DNA就是目的基因DNA 。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 14 页，共 14 页