专题三专题三- -课题课题2-2-月季的花月季的花药培养药培养知识回顾单倍体育种的过程？单倍体育种的过程？花药离体培养（花药离体培养（N）单倍体植株（单倍体植株（N）秋水仙素处理，秋水仙素处理，使染色体翻倍使染色体翻倍植株（植株（2N）特点：特点：1 明显缩短育种年限明显缩短育种年限2 后代植株都为纯合子。后代植株都为纯合子。正常植株（正常植株（2N）花丝花丝花药：花药：囊状结构，内有很多花粉囊状结构，内有很多花粉雄蕊雄蕊一、被子植物的花粉发育一、被子植物的花粉发育 花粉母花粉母细胞细胞（小孢子母细胞）（小孢子母细胞）4 4个小孢子个小孢子减数分裂减数分裂小孢子四分体小孢子四分体1 1个小个小孢子孢子（单细胞花粉粒）（单细胞花粉粒） 花粉粒花粉粒（双核）（双核）有丝分裂有丝分裂单核单核双核双核 花粉母花粉母细胞细胞（小孢子母细胞）（小孢子母细胞）4 4个小孢子个小孢子减数分裂减数分裂小孢子四分体小孢子四分体1 1个小个小孢子孢子 花粉粒花粉粒（双核）（双核）有丝分裂有丝分裂单核单核双核双核花粉管细胞核花粉管细胞核营养细胞营养细胞生殖细胞核生殖细胞核2个精子个精子花粉是花粉是单倍体单倍体的生殖细胞的生殖细胞小孢子母细胞小孢子母细胞小孢子小孢子花粉囊花粉囊花药花药 花粉粒花粉粒（双核期）（双核期）成熟成熟花粉花粉8个精子个精子小孢子母细胞小孢子母细胞（ ）时期）时期单核（单核（ ）期）期双核期双核期（ ）细胞核）细胞核 （ ）细胞核）细胞核（ ）细胞）细胞（ ）细胞）细胞（ ）个精子）个精子（ ）分裂）分裂（ ）分裂）分裂单核（单核（ ）期）期（ ）分裂）分裂减数减数小孢子四分体小孢子四分体中中边边有丝有丝生殖生殖生殖生殖花粉管花粉管营养营养有丝有丝22NNNNNNNNN1、关于被子植物花粉发育的说法，不正确的是（、关于被子植物花粉发育的说法，不正确的是（ ）A、花粉粒是在花药中的花粉囊里形成的、花粉粒是在花药中的花粉囊里形成的B、被子植物精子的形成是直接减数分裂的结果、被子植物精子的形成是直接减数分裂的结果C、被子植物的花粉的发育要经历四分体时期、单核、被子植物的花粉的发育要经历四分体时期、单核期、双核期等阶段期、双核期等阶段D、花粉粒在发育过程中，核先位于细胞一侧，再移、花粉粒在发育过程中，核先位于细胞一侧，再移到细胞中央到细胞中央BD取决：培养基中的取决：培养基中的激素种类激素种类及及浓度浓度配比配比二、产生花粉植株的两条途径二、产生花粉植株的两条途径胚状体胚状体 在组织培养过程中，某些细胞在形态上转在组织培养过程中，某些细胞在形态上转变为与变为与合子发育成的胚合子发育成的胚非常相似的结构非常相似的结构，发育，发育过过程程亦与合子胚类似；亦与合子胚类似；神奇的人工种子神奇的人工种子: :通过通过胚状体胚状体途径形成小植株途径形成小植株烟草花药培养烟草花药培养胚状体发育途径胚状体发育途径愈伤组织转接种到再生培养基愈伤组织转接种到再生培养基愈伤组织分化形成再生植株愈伤组织分化形成再生植株水稻花药培养水稻花药培养愈伤组织发育途径愈伤组织发育途径部分花药产生愈伤组织部分花药产生愈伤组织接种在平板上的水稻花药接种在平板上的水稻花药不同植物的诱导成功率很不相同，就同一种不同植物的诱导成功率很不相同，就同一种植物来说亲本的生理状况对诱导成功率也有植物来说亲本的生理状况对诱导成功率也有直接影响。直接影响。选择合适的花粉发育时期是提高诱导成功率的选择合适的花粉发育时期是提高诱导成功率的重要因素。重要因素。因为并不是任何时期的花粉都可以经过培养产因为并不是任何时期的花粉都可以经过培养产生愈伤组织或胚状体，花粉发育的过程中，只生愈伤组织或胚状体，花粉发育的过程中，只有某一个时期对离体刺激敏感。有某一个时期对离体刺激敏感。选材是否成功是花药培养成功的关键。选材是否成功是花药培养成功的关键。选材选材三、影响花药培养的因素三、影响花药培养的因素一般来说，在单核期，细胞核由中央移向细胞一般来说，在单核期，细胞核由中央移向细胞一侧的时期，花药培养的成功率最高。即：最一侧的时期，花药培养的成功率最高。即：最适合花药培养的小孢子发育时期为适合花药培养的小孢子发育时期为单核靠边期单核靠边期。选择单核期以前的花药接种，选择单核期以前的花药接种，质地幼嫩，极易质地幼嫩，极易破碎破碎；选择单核期之后的花药接种，花瓣已有些松动，选择单核期之后的花药接种，花瓣已有些松动，又给又给材料的消毒带来困难，且难以挑选到单核材料的消毒带来困难，且难以挑选到单核期的花药期的花药。花药培养时期的选择花药培养时期的选择其它其它时期选择的缺点时期选择的缺点为了挑选到单核期的花药，为了挑选到单核期的花药，通通常选择完全未开放的花蕾。常选择完全未开放的花蕾。盛盛开的或略微开放的花，都不宜开的或略微开放的花，都不宜选作实验材料。选作实验材料。选择完全未开放花蕾的选择完全未开放花蕾的原因原因 完全未开放的花蕾，可挑完全未开放的花蕾，可挑选到单核期的花药，菌少、选到单核期的花药，菌少、易消毒易消毒单核期花药的挑选单核期花药的挑选为什么花瓣松动会给材料的消毒带来困难？为什么花瓣松动会给材料的消毒带来困难？ 花瓣松动后，微生物就可能侵入到花药，花瓣松动后，微生物就可能侵入到花药，给材料的消毒带来困难。给材料的消毒带来困难。 花药培养时间花药培养时间一般月季的花药培养时间选在一般月季的花药培养时间选在5 5月初到月初到5 5月的中月的中旬，即旬，即月季的初花期月季的初花期。初花期的花蕾营养状态。初花期的花蕾营养状态及生理状态会比较好，可提高花粉的诱导成功及生理状态会比较好，可提高花粉的诱导成功率。率。（一）材料选取（一）材料选取 2、通过、通过镜检镜检来确定是否处于适宜的发育期来确定是否处于适宜的发育期。 方法：方法：醋酸洋红法醋酸洋红法(将染色体染成红色将染色体染成红色) 焙花青焙花青-铬矾法铬矾法(花粉细胞核染成蓝黑色花粉细胞核染成蓝黑色)。1、从花药看从花药看：月季的初花期：月季的初花期 从花粉看：从花粉看：单核期单核期 从花蕾看从花蕾看：完全未开放的：完全未开放的 花药（载玻片上）花药（载玻片上）1%的醋酸洋红的醋酸洋红1滴滴用镊柄将花药捣碎，用镊柄将花药捣碎，盖上盖玻片盖上盖玻片镜检（花粉粒的细胞核被染成红色）镜检（花粉粒的细胞核被染成红色） 花药（在卡诺氏固定液中处理花药（在卡诺氏固定液中处理20min）取出，置于载玻片上取出，置于载玻片上焙花青铬矾溶液染色焙花青铬矾溶液染色盖上盖玻片盖上盖玻片镜检（花粉粒的细胞核镜检（花粉粒的细胞核被染成蓝黑色）被染成蓝黑色）四、实验操作四、实验操作（二）材料的消毒（二）材料的消毒5 5、无菌水冲洗、无菌水冲洗3 35 5次次 花药的外面有花萼、花瓣保护，通常处于无菌状态花药的外面有花萼、花瓣保护，通常处于无菌状态1、花蕾用、花蕾用体积分数为体积分数为70%的酒精的酒精浸泡浸泡30秒秒2、无菌水清洗、无菌水清洗3、无菌吸水纸吸干花蕾表面的水分、无菌吸水纸吸干花蕾表面的水分4、放入、放入质量分数为质量分数为0.1%的氯化汞的氯化汞溶液中溶液中24分钟分钟 （质量分数为质量分数为1%的的次氯酸钙溶液次氯酸钙溶液或饱和漂白粉溶液或饱和漂白粉溶液）在无菌条件下除去萼片和花瓣用镊子取出花药在无菌条件下除去萼片和花瓣用镊子取出花药要彻底去除花丝，要彻底去除花丝，因为与花丝相连的花药因为与花丝相连的花药不利于愈伤组织或胚状体的形成。不利于愈伤组织或胚状体的形成。立即将花药接种于培养基上，通常每瓶立即将花药接种于培养基上，通常每瓶接种花接种花药药7-107-10个个。1 1、剥取花药、剥取花药勿损伤花药，否则接种后容易从受伤部位产勿损伤花药，否则接种后容易从受伤部位产生愈伤组织。生愈伤组织。2 2、接种、接种注意：注意：（三）接种和培养（三）接种和培养培养条件：温度控制在培养条件：温度控制在2525左右，不需要左右，不需要光照。光照。幼小植株形成后才需要光照。幼小植株形成后才需要光照。 3 3、培养、培养培养：一般经过培养：一般经过20-3020-30天培养后，会发现花药天培养后，会发现花药开裂，长出愈伤组织或释放出胚状体。开裂，长出愈伤组织或释放出胚状体。长出愈伤组织则将愈伤组织及时转移到分化培养长出愈伤组织则将愈伤组织及时转移到分化培养基上，以便进一步分化出再生植株。基上，以便进一步分化出再生植株。注意：如果花药开裂释放出胚状体，则一个注意：如果花药开裂释放出胚状体，则一个花药内就会产生大量幼小植株，花药内就会产生大量幼小植株，必须在花药开必须在花药开裂后尽快将幼小植株分开，裂后尽快将幼小植株分开，分别移植到新的培分别移植到新的培养基上，否则这些植株将很难分开。养基上，否则这些植株将很难分开。在花药培养中，特别是通过愈伤组在花药培养中，特别是通过愈伤组织形成的花粉植株，常常会出现染织形成的花粉植株，常常会出现染色体倍性的变化（主要原因是色体倍性的变化（主要原因是营养营养细胞核和生殖细胞核融合细胞核和生殖细胞核融合造成的）。造成的）。4 4、鉴定和筛选、鉴定和筛选课题成果评价课题成果评价选材是否恰当选材是否恰当选材是否恰当选材是否恰当 选材是否成功是花药培养成功的关键。应学会选材是否成功是花药培养成功的关键。应学会选材是否成功是花药培养成功的关键。应学会选材是否成功是花药培养成功的关键。应学会 通过显微镜观察处于适宜发育期的花粉。通过显微镜观察处于适宜发育期的花粉。通过显微镜观察处于适宜发育期的花粉。通过显微镜观察处于适宜发育期的花粉。无菌技术是否过关无菌技术是否过关无菌技术是否过关无菌技术是否过关 如果出现了污染现象，说明某些操作步骤，如如果出现了污染现象，说明某些操作步骤，如如果出现了污染现象，说明某些操作步骤，如如果出现了污染现象，说明某些操作步骤，如 培养基灭菌、花蕾消毒或接种等有问题。培养基灭菌、花蕾消毒或接种等有问题。培养基灭菌、花蕾消毒或接种等有问题。培养基灭菌、花蕾消毒或接种等有问题。接种是否成功接种是否成功 如果接种的花药长出愈伤组织或释放出胚状如果接种的花药长出愈伤组织或释放出胚状体，花药培养的第一步就成功了。要适时转换培养体，花药培养的第一步就成功了。要适时转换培养基，以便愈伤组织或胚状体进一步分化成再生植株。基，以便愈伤组织或胚状体进一步分化成再生植株。课题成果评价课题成果评价结束结束