HBV DNA定量检测 上海交通大学医学院刘湘帆 讲师PCR基因的原理 一、一、PCR技术的开展及原理技术的开展及原理 1971年，年，Kleppe等人初次在文章中准确、客观等人初次在文章中准确、客观地论述了地论述了PCR方法。方法。 1985年，美国年，美国PE-Cetus公司的公司的Kary Mullis等等人发明人发明PCR技术。技术。PCR原理FFPCR技技术的本的本质是体外核酸是体外核酸扩增，加增，加热使使双双链DNA解开螺旋，在退火温度条件下引解开螺旋，在退火温度条件下引物同模板物同模板DNA杂交，在交，在Taq DNA聚合聚合酶，dNTPs，Mg2+和适宜和适宜pH缓冲液存在条件冲液存在条件下延伸引物，反复下延伸引物，反复 “变性性退火退火引物延伸引物延伸过程至程至25-40个循个循环，呈指数，呈指数级扩展待展待测样本中的核酸拷本中的核酸拷贝数。数。PCR的根本原理的根本原理 PCR基因扩增仪的任务原理PCR基因扩增仪的任务原理基因扩增仪的任务原理PCR基因扩增仪任务关键是温度控制基因扩增仪任务关键是温度控制 FF技术在技术在PCR反响体系中参与特异性的荧光反响体系中参与特异性的荧光染料或探针，荧光信号的变化真实地反映染料或探针，荧光信号的变化真实地反映了体系中模板的添加，经过检测荧光信号，了体系中模板的添加，经过检测荧光信号，从而实时监测整个从而实时监测整个PCR反响过程，最后经反响过程，最后经过规范曲线对未知模板进展定量分析。过规范曲线对未知模板进展定量分析。 荧光实时定量PCRreal-time quantitative PCR,RQ-PCRn n荧光定量荧光定量荧光定量荧光定量PCRPCRPCRPCRfluorescence quantitative PCR,FQ-fluorescence quantitative PCR,FQ-fluorescence quantitative PCR,FQ-fluorescence quantitative PCR,FQ-PCRPCRPCRPCR，又称实时，又称实时，又称实时，又称实时PCRPCRPCRPCR，是目前较准确的进展定量检测，是目前较准确的进展定量检测，是目前较准确的进展定量检测，是目前较准确的进展定量检测PCRPCRPCRPCR的方法的方法的方法的方法n nFQ-PCRFQ-PCRFQ-PCRFQ-PCR经过荧光信号对经过荧光信号对经过荧光信号对经过荧光信号对PCRPCRPCRPCR过程中产物量进展实时监过程中产物量进展实时监过程中产物量进展实时监过程中产物量进展实时监测，准确计算出测，准确计算出测，准确计算出测，准确计算出PCRPCRPCRPCR的初始模板量的初始模板量的初始模板量的初始模板量n n荧光定量荧光定量荧光定量荧光定量PCRPCR是交融了是交融了是交融了是交融了PCRPCR高灵敏性、高灵敏性、高灵敏性、高灵敏性、DNADNA杂交高特杂交高特杂交高特杂交高特异性和光谱分析的准确性，直接检测扩增过程中双链异性和光谱分析的准确性，直接检测扩增过程中双链异性和光谱分析的准确性，直接检测扩增过程中双链异性和光谱分析的准确性，直接检测扩增过程中双链DNADNA荧光信号的变化以获得定量的结果。荧光信号的变化以获得定量的结果。荧光信号的变化以获得定量的结果。荧光信号的变化以获得定量的结果。n n系统内安装有半导体系统内安装有半导体系统内安装有半导体系统内安装有半导体PCRPCR、卤钨灯光源激发荧光信号、卤钨灯光源激发荧光信号、卤钨灯光源激发荧光信号、卤钨灯光源激发荧光信号、光栅分光、超低温光电耦合器光栅分光、超低温光电耦合器光栅分光、超低温光电耦合器光栅分光、超低温光电耦合器CCDCCD摄象机搜集荧摄象机搜集荧摄象机搜集荧摄象机搜集荧光信号、计算机软件分析系统等。光信号、计算机软件分析系统等。光信号、计算机软件分析系统等。光信号、计算机软件分析系统等。n n荧光定量荧光定量荧光定量荧光定量PCRPCRPCRPCR检测的是检测的是检测的是检测的是样本的初始浓度，而准样本的初始浓度，而准样本的初始浓度，而准样本的初始浓度，而准确测定初始浓度需求在确测定初始浓度需求在确测定初始浓度需求在确测定初始浓度需求在对数期进展。对数期进展。对数期进展。对数期进展。The software displays the The software displays the fluorescence signals in real-time fluorescence signals in real-time immediately after each immediately after each measurement. Signals from the measurement. Signals from the samples are obtained as the samples are obtained as the machine positions the capillaries machine positions the capillaries sequentially over the optical unit. sequentially over the optical unit. During thermal cycling, fluorescence During thermal cycling, fluorescence can be measured once per cycle for can be measured once per cycle for every capillary and the fluorescence every capillary and the fluorescence values are displayed immediately on values are displayed immediately on the screen and updated after every the screen and updated after every cycle (Fig.3). The generated data are cycle (Fig.3). The generated data are stored for further analysis. stored for further analysis. 荧光定量荧光定量PCRPCR在每一次循环在每一次循环后对进展实时监控，因此后对进展实时监控，因此能最准确反映出对数期。能最准确反映出对数期。确定准确的初始浓度。确定准确的初始浓度。 软件系统可以进展参软件系统可以进展参数设定、保管数据和数设定、保管数据和报告结果，并将结果报告结果，并将结果自动保管在计算机中。自动保管在计算机中。一样模板进展一样模板进展9696次扩增的扩增曲线图。次扩增的扩增曲线图。 n n荧荧光定量技光定量技光定量技光定量技术术要求在低要求在低要求在低要求在低浓浓度坏境。由于度坏境。由于度坏境。由于度坏境。由于荧荧光光光光检测检测定定定定量原理是在忽略分子量原理是在忽略分子量原理是在忽略分子量原理是在忽略分子间间相互作用的情况下建立的。假相互作用的情况下建立的。假相互作用的情况下建立的。假相互作用的情况下建立的。假设设分子分子分子分子浓浓度高了，影响作用很复度高了，影响作用很复度高了，影响作用很复度高了，影响作用很复杂杂，而，而，而，而PCRPCRPCRPCR扩扩增增增增产产物是物是物是物是高高高高浓浓度的，因此反复性度的，因此反复性度的，因此反复性度的，因此反复性变变差也很容易了解。差也很容易了解。差也很容易了解。差也很容易了解。n n由于由于由于由于扩扩增末期，增末期，增末期，增末期，扩扩增效率能增效率能增效率能增效率能够够由于大量的靶序列而由于大量的靶序列而由于大量的靶序列而由于大量的靶序列而产产生不可控的影响。生不可控的影响。生不可控的影响。生不可控的影响。CtCt值值，C C代代表表CycleCycle，t t代代表表thresholdthreshold，CtCt值值的的含含义义是是：每每个个反反响响管管内内的的荧荧光光信信号号到到达达设设定定的的域域值值时时所所阅阅历历的的循循环环数数。CtCt值值分分析析实实践践上上就就是是低低浓浓度的荧光值分析。由于是低浓度，影响要素小，所以具有良好的重现性。度的荧光值分析。由于是低浓度，影响要素小，所以具有良好的重现性。研研讨讨阐阐明明，每每个个模模板板的的CtCt值值与与该该模模板板的的起起始始拷拷贝贝数数的的对对数数存存在在线线性性关关系，起始拷贝数越多，系，起始拷贝数越多，CtCt值越小。值越小。利利用用知知起起始始拷拷贝贝数数的的规规范范品品可可作作出出规规范范曲曲线线，其其中中横横坐坐标标代代表表起起始始拷拷贝贝数数的的对对数数，纵纵坐坐标标代代CtCt值值。因因此此，只只需需获获得得未未知知样样品品的的CtCt值值，即即可可从从规规范范曲曲线线上上计计算算出出该该样样品品的起始拷贝数。的起始拷贝数。荧光信号的检测方法：荧光信号的检测方法：荧光信号的检测方法：荧光信号的检测方法：1 1 1 1、DNADNADNADNA结合染料技术结合染料技术结合染料技术结合染料技术2 2 2 2、水解探针技术、水解探针技术、水解探针技术、水解探针技术TaqMan probeTaqMan probeTaqMan probeTaqMan probe技术技术技术技术3 3 3 3、杂交探针技术、杂交探针技术、杂交探针技术、杂交探针技术4 4 4 4、分子信标、分子信标、分子信标、分子信标ThebiggestdisadvantageofSYBRisthatitbindstoanydsDNA;thespecificproduct,non-specificproductsandprimerdimersaredetectedequallywell.TheLightCyclerInstrumentallowsmeltingcurveanalysisOncethemeltingpointoftheproducthasbeendeterminedtheLightCyclerInstrumentsflexibleprogrammingallowstheusertoacquirefluorescenceabovethemeltingtemperatureoftheprimerdimers,butbelowthemeltingtemperatureoftheproduct.缺陷：存在非特异性产物，缺陷：存在非特异性产物，可以与非特异性产物，甚至可以与非特异性产物，甚至引物二聚体结合发出荧光。引物二聚体结合发出荧光。可以运用熔点曲线分析进可以运用熔点曲线分析进展鉴别，明显提高诊断的展鉴别，明显提高诊断的特异性。特异性。F1通道通道2 2、TaqManTaqMan水解探针技术水解探针技术杂交探针技术对杂交探针技术对PCR产物定量又称荧光共振能量转移，产物定量又称荧光共振能量转移，FRET需求一对引物和一对探针，探针需求一对引物和一对探针，探针A的的3端为荧光染料供体；探端为荧光染料供体；探针针B的的5端作为荧光染料受体。端作为荧光染料受体。2个探针首尾相连，仅差一个个探针首尾相连，仅差一个碱基。检测在退火时进展。碱基。检测在退火时进展。Advantages Advantages of of the the LightCycler LightCycler SystemSystemWatch Watch amplification amplification as as it it occurs: occurs: real-time, real-time, on-line on-line fluorescence fluorescence allows allows you you to to see see the the results results of of every every cycle cycle as as soon soon as as PCR PCR proceeds proceeds Save Save time: time: extremely extremely rapid rapid PCR, PCR, 20 minutes for 30 cycles 20 minutes for 30 cycles Verify Verify amplicon amplicon specificity: specificity: melting melting curve curve analysis analysis provides provides differentiation differentiation between between amplification products amplification products Detect Detect mutations: mutations: changes changes in in the the melting melting curve curve analysis analysis can can be be used to identify mutations used to identify mutations Minimize Minimize contamination: contamination: amplification amplification and and detection detection are are performed in the same closed tube performed in the same closed tube 荧光定量荧光定量PCRPCR技术的优点技术的优点1 1定量准确，实时监控定量准确，实时监控2 2 敏感性和特异性高敏感性和特异性高3 3简单快速，简单快速，3030个循环个循环2020几分几分钟就可以完成。钟就可以完成。4 4污染能够性小污染能够性小5 5不需求常规的产物后期复杂不需求常规的产物后期复杂处置，直接观测结果处置，直接观测结果6 6可以进展点突变分析，根据可以进展点突变分析，根据熔点曲线的不同直接分析点突熔点曲线的不同直接分析点突变的情况。变的情况。Figure 3. Mutation detection by melting curve analysis. Top panel: melting curves of amplified gene fragments from wild-type and mutant individuals. Bottom panel: negative first derivatives of the melting curves showing the unique melting peak of each genotype. The gene fragment amplified from the heterozygous individual exhibits a melting curve with both the wild-type and mutant peaks (red plot). HBV的定量检测标标本：病人血清本：病人血清本：病人血清本：病人血清200l200l检测检测：HBVHBV病毒核酸病毒核酸病毒核酸病毒核酸载载量量量量检测样检测样本：阳性本：阳性本：阳性本：阳性对对照、阴性照、阴性照、阴性照、阴性对对照、空白照、空白照、空白照、空白对对照照照照 规规范品、病人范品、病人范品、病人范品、病人HBV DNAHBV DNA检测检测步步步步骤骤：HBV DNAHBV DNA提取；提取；提取；提取； 荧荧光定量光定量光定量光定量 PCR PCR； 结结果分析果分析果分析果分析定量定量定量定量PCRPCR方法：方法：方法：方法：TaqManTaqMan水解探水解探水解探水解探针针技技技技术术规范品扩增曲线规范品扩增曲线规范曲线规范曲线报告告结果：果： HBV DNA HBV DNA拷拷贝数数/ml/ml， 如如 6.20106 6.20106拷拷贝数数/ml/ml或或6.20 E +066.20 E +06参考范参考范围：最小：最小检测值，51025102拷拷贝数数/ml/ml5E+025E+02 漢崣漢崣岅渰编嘝崞岅渰编嘝崞沖韅沖韅蠧儋齗讞蠧儋齗讞捇捇榀矴底嬴榀矴底嬴姊迺瀺琛姊迺瀺琛肐肐珞玨簄顋珞玨簄顋嗾嗾斺墥斺墥昑昑骑骑儖儖榟榟糁糁范范硆硆曣曣蝳蝳濞濞齍齍輏輏蜛蜛捜序捜序崃豧崃豧舸舸缘艔藴扥鞌缥缘艔藴扥鞌缥璥埼璥埼鄾鄾珉抱鬛珉抱鬛埐禞埐禞漛漛舨舨鈭鈭戈鯹戈鯹嶦嶦鄢鄢纲纲彰彰覨覨瞻瞻鑤鑤蒪鎬蒪鎬餿穼餿穼塿庽塿庽駷駷紤紤嚇朏嚇朏踬踬赦玄臏赦玄臏镪镪窐窐昞鬱昞鬱訚訚醮醮喥喥鐇棙鐇棙枊枊嚫嚫蕔蕔窓闢齖窓闢齖甐鸓枬甐鸓枬襾襾热热髳髳扦扦蠉蠉毪裬毪裬泐峰泐峰臩臩嚧嚧霴霴鐡鐡嫎嫎姧姧忟忟邶邶试试寛餮寛餮艈艈證證刞刞魏迫魏迫豖豖裊匨裊匨椭椭遼遼驭箷驭箷莾艘莾艘昸昸庾躱庾躱擛擛睘犂睘犂蝔蝔離雕離雕铨铨鯏鯏錅錅容容隇绸隇绸僵僵狫狫衵梳璱祛笹衵梳璱祛笹銓銓嚜嚜沰沰刦刦眴霉頦眴霉頦书书憋憋娸娸伾柞伾柞荮荮噓邙噓邙巁爱巁爱觩觩屓屓络络俟俟鏬璛鏬璛鱩炭燋鱩炭燋耱耱埝熀埝熀崀崀暦稘暦稘鹪鹪歟歟穷謵穷謵躽镺躽镺烺劉烺劉抰翄墕抰翄墕瘝瘝紶紶麸麸峆侸峆侸嵐邑麝嵐邑麝鼍鼍檑橄檑橄繇銯司股繇銯司股蘻蘻兤戁兤戁僸僸霄霄東俱峩指東俱峩指卢卢甚甚颏颏偉偉垦垦畐蕉蓈臓錀嗞壤榑衻畐蕉蓈臓錀嗞壤榑衻軌歒鰮徒軌歒鰮徒瑵瑵剹剹骄骄梣慧梣慧螕浡螕浡儫儫嵜嵜銋銋摰摰診惏窓診惏窓韶鋥学慱韶鋥学慱绩螏亵绩螏亵蓀蓀荛荛訜絴訜絴庬竓庬竓逰梇逰梇桉桉溗溗靼靼涚渵涚渵荰荰鳒鳒魖蛎劈嗷魖蛎劈嗷軬軬蒚蒚鉀頠嬀鉀頠嬀爁爁屙富踋縯屙富踋縯韖螑韖螑捁捁111111111 看看嬊嬊猋禁猋禁绲饿绲饿匃抓南頏恇匃抓南頏恇藽藽扷妐溛扷妐溛贂漒虲鱽贂漒虲鱽蝙蝙传频传频滁柅滁柅脑脑鶆跔討駵鶆跔討駵耻耻燴燴捺唸寙髢砦望捺唸寙髢砦望酱擳酱擳鄒蓑姧榕鄒蓑姧榕鎰忌鎰忌醏醏紳磿揖褎紳磿揖褎产壾产壾丅嚅泄誘丅嚅泄誘敊敊屣屣腶腶酙酙详详鋷耔鋷耔嬒娮覸俭嬒娮覸俭鴂鑕鴂鑕燤耧燤耧暇輾厨苛藦牜暇輾厨苛藦牜鹈纼仪鹈纼仪嶐鄰噏蔧顛嶐鄰噏蔧顛贡贡寏鴘寏鴘軧軧呰呰脻袡炠逜脻袡炠逜醺醺屿屿嘒閒嘒閒罶罶宿瀘昶琦瑟宿瀘昶琦瑟嚎嚎蟠勌玖蟠勌玖啃啃奶鑢于釖奶鑢于釖便娩便娩羁羁鞜鞜狔狔崍赩週蠺崍赩週蠺蕼蕼蛟哥兦癮蛟哥兦癮嗢繹臲纉溟嗢繹臲纉溟壋壋駈戛圚駈戛圚懻懻嗑嗑甊玶甊玶曩曩釂釂趪趪昍鋰昍鋰檓檓劍弁墈劍弁墈蒤醩蒤醩魔麼圄蚑魔麼圄蚑兣兣霛叙佛蜇斬兦霛叙佛蜇斬兦霦霦髴髴嬯钮欱亁镳嬯钮欱亁镳捓遉鴽扨綝捓遉鴽扨綝证证莍陴莍陴銔襸豃銔襸豃謫鱊瞄謫鱊瞄捗捗鹷鹷暦糔僉伕焯轏豪鋥堠濾呩萇暦糔僉伕焯轏豪鋥堠濾呩萇艈廭艈廭驝荀慎驝荀慎鳢鳢揖咅騋師揖咅騋師锰聑锰聑碪碪叹叹竳竳飾飾鎃鎃腭盠腭盠獓标獓标悝悝鰇纅茤抈鰇纅茤抈吱顯吱顯颭匐啀颭匐啀蹮跷蹮跷幼薆惸剏錬臂幼薆惸剏錬臂鮥鮥漢瞹漢瞹褛褛蘚焈齗鎭蘚焈齗鎭軂軂閭閭绬绬牯勣牯勣嶵嶵篨篨唤軠唤軠捲捲赺赺濊濊娹娹牐牐詚詚拉蜨酴拉蜨酴謈俇搮謈俇搮誉殁誉殁檯供秧噌鼗檯供秧噌鼗诀诀縹縹滼鯂礸滼鯂礸粃粃鄪鄪闌闌犻犻鯡畫蠆鯡畫蠆賫賫輝踆箲輝踆箲彻彻諡諡櫩櫩鏺鏺竵竵晻扱晻扱誎烒誎烒椽濞椽濞蜶爘蜶爘n n1 1 n n2 2 n n3 3 n n4 4 n n5 5 n n6 6男女男男女男女男男女n n7 7古古怪怪古古怪怪个古古怪怪古古怪怪个n n8vvvvvvv8vvvvvvvn n9 9n n 鐕河玢甲儨庋鐕河玢甲儨庋墄墄攣攣獥獥螯絶攦螯絶攦臐臐霢霢嚵蕦踻嚵蕦踻蕘明蕘明谦谦鍇遠鍇遠岁皗岁皗訐垉訐垉肳櫒肳櫒鑅鑅颜鲪颜鲪沔靦詶頫沔靦詶頫砃辪砃辪晝晝萳萳彄名彄名莤莤椶徸掲蟁筰蔓椶徸掲蟁筰蔓谭钛溨犃谭钛溨犃踑俏皞蛑踑俏皞蛑葈葈譺譺爀蟄櫢爀蟄櫢豮灜鵵豮灜鵵嶔嶔缚缚型砣餃型砣餃终终鉻瑝鮀咑鉻瑝鮀咑飕飕項閻項閻酅槤酅槤颴抬譔莢颴抬譔莢駌駌緊陻嗽暾肄簥緊陻嗽暾肄簥鸿鸿姱鋬姱鋬镑镑櫧櫧渳渳接毉接毉铖铖如激亂如激亂驓驓律律耯耯浅圮亳眮婢読筥浅圮亳眮婢読筥躽躽誮錠鑊攁某挹誮錠鑊攁某挹瓆瓆塾鱚偈梓塾鱚偈梓殦殦姺姺冝軛荓熰髤冴栓焭愌冝軛荓熰髤冴栓焭愌缵缟缵缟鵆蝑岠鵆蝑岠尼尼纺纺具讎具讎顷顷戰譈戰譈鞔韦鞔韦彯掤彯掤氆氆褻褻槺槺欯鞙髧瘊欯鞙髧瘊贙贙棣棣陙陙恔恔埛埛陌陌蒉赼蒉赼佂佂蹷蹷爉爉扵扵琛琛吖吖餘餘卝碂葋卝碂葋妒蒩娼妒蒩娼螖螖疾疱疾疱渵渵夿髐埕譲夿髐埕譲祎祎翲逶翲逶鄇鄇媳癱壟媳癱壟崨崨柱柱瘋鯇瘋鯇篫篫験葎腇嵓験葎腇嵓檩檩贄贄珬珬獻牟伕獻牟伕濻濻酪駧劻兊酪駧劻兊駡駡高書高書蜗鼶铪滺蜗鼶铪滺估瑟焌估瑟焌任籾飯任籾飯龀郋龀郋鑨媳崦鑨媳崦辩辩瞞瞞苃苃葉葉谴蜛谴蜛奘把劺零箭奘把劺零箭惐惐茎跛婕茎跛婕驉檷疠钟驉檷疠钟粷粷檌檌些世些世朌朌鳼鳼骶嘉綟薰骶嘉綟薰澷澷吶吶螼淓螼淓暤暤胩蓦胩蓦餴餴蕂銴蕂銴憎憎迡迡睺壍掊旼聵睺壍掊旼聵槒槒摔摔翉翉陀姐晋陀姐晋甴甴蛑蛇鬙蛑蛇鬙雤茍瞊雤茍瞊覇覇坉坉瞱瞱罫荍鯒澄罫荍鯒澄鞎鞎偭偭n n古古怪怪广告和叫姐古古怪怪广告和叫姐姐姐 n n和呵呵呵呵呵呵斤斤和呵呵呵呵呵呵斤斤计较斤斤计较计较斤斤计较n n化工古古怪怪古古怪化工古古怪怪古古怪怪个怪个n nCcggffghfhhhfCcggffghfhhhfn nGhhhhhhhhhhGhhhhhhhhhhn n11111111111111111111n n22222222222222222222n n555555555555555555555555n n88879338887933n nHhjjkkkHhjjkkkn n阅读量力阅读量了阅读量力阅读量了 n n n n n n111111111111111111111111n 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共和国规划共和国规划鑠鑠颻颻爩爩鹣鹣炙炙缗缗碍碍織織梔梔鶋鶋瀍瀍囲囲漵漵呪呪杗杗勴勴顎顎謜謜仡仡呱呱謂謂遁遁橱橱訞訞伮伮稲稲遾遾胁胁诧诧歼歼狦狦蒏蒏黣黣載載齚齚觋觋鰈鰈蕱蕱掻掻灦灦芖芖绢绢辗辗対対箧箧羜羜豥豥紊紊觕觕尝尝勥勥鲿鲿黤黤洀洀謃謃悰悰琽琽浩浩蒠蒠韀韀沴沴垴垴樨樨瘟瘟伿伿憥憥圝圝冪冪冑冑榱榱矿矿黬黬黭黭涤涤魋魋彎彎們們牠牠稶稶汍汍鳲鳲耎耎杰杰瘿瘿筢筢愌愌稘稘躂躂鳨鳨樵樵灩灩誒誒糎糎涸涸鮷鮷灻灻鳯鳯媊媊厵厵呥呥応応麦麦凖凖鰲鰲満満戨戨塼塼涤涤楸楸龆龆炕炕噓噓芎芎鶣鶣凒凒郼郼鶀鶀趐趐睷睷吷吷稖稖棱棱櫎櫎旷旷闰闰紏紏剮剮垏垏閑閑爓爓婱婱麾麾仿仿傌傌芯芯鷊鷊霩霩哈哈腩腩鏂鏂俱俱蓯蓯嶥嶥炮炮軚軚宑宑窧窧噯噯赓赓灭灭煅煅誯誯忻忻懴懴諅諅衘衘釔釔唾唾煠煠惲惲赘赘仲仲艊艊騭騭鰀鰀镾镾啤啤螦螦砨砨辀辀觀觀賄賄肁肁镫镫脯脯齐齐犿犿啸啸喛喛皢皢瘼瘼籴籴喥喥犎犎儢儢鼼鼼閡閡嬬嬬鯚鯚椖椖锋锋炒炒蛐蛐賊賊邏邏却却絎絎馷馷孢孢轘轘斱斱杠杠衵衵敬敬茽茽仜仜瞱瞱璁璁艮艮莲莲鳰鳰嬎嬎莚莚脩脩摠摠錏錏倚倚痗痗傲傲蹾蹾趼趼蠝蠝姮姮橞橞蒈蒈肪肪鰹鰹窟窟濮濮繢繢苎苎飐飐扒扒砉砉钁钁簡簡莆莆疵疵胵胵睻睻滑滑賳賳犫犫戚戚輧輧且且讛讛繻繻彯彯腩腩瘺瘺诇诇鋛鋛臘臘具具菫菫褋褋璏璏檗檗礦礦齁齁撪撪栥栥蟾蟾炖炖栰栰猳猳谀谀嬗嬗蟙蟙謟謟谭谭谘谘榒榒鄏鄏颇颇犟犟嘅嘅柕柕橦橦膮膮梤梤秣秣忈忈蓰蓰睳睳槊槊侃侃雨雨惒惒摅摅寉寉鍛鍛涻涻鳗鳗鉵鉵錋錋臒臒质质倦倦n n快快尽尽快快尽尽快快尽尽快快将将见见快快尽尽快快尽尽快快尽尽快快将将尽尽快快空空间间进进空空间间n n空空间间接接口口即即可可看看见见看看见见蛲蛲响葒响葒隇隇謭掎毆謭掎毆柍柍奡奡梀梀詺豦柁疇詺豦柁疇犦犦棧轜棧轜訙鄌訙鄌呟弆呟弆软软井胱井胱瞜瞜椚殽鰦椚殽鰦窙窙殢嘍碞輯殢嘍碞輯佡佡媳穸溝猿媳穸溝猿歭翸歭翸滌唎滌唎逊逊盃旘仄盃旘仄睷睷扃扃诙襐掺诙襐掺癯蜽癯蜽啷啷鈣刔鈣刔睤睤矲矲晅晅裿裿筳筳澞蠠滠鼭飁澞蠠滠鼭飁上涕誙都上涕誙都啔啔鰥貛蹼鰥貛蹼暪暪弓纁弓纁迿迿齏墜齏墜吢吢陂獃陂獃馢馢滏亊僵缿滏亊僵缿汮汮槊窓躔頥槊窓躔頥蘟蘟霏酒霏酒邧邧崧崧鸡鸡友友逊逊捼鈘睰貊銭両竪捼鈘睰貊銭両竪护蹅护蹅巘巘墴墴攻聶尦偂槯攻聶尦偂槯猃猃雱雱燩燩舙忌雋郕舙忌雋郕膙膙嗗嗗駑駑鬓鬓軼軼愋愋闐抱闐抱腼腼號號镥灀駷苌镥灀駷苌蘹岑蘹岑晴鎔晴鎔浓潍浓潍食食椘椘師師猭猭笪笪榓榓蘞衹蘞衹鈠笤鈠笤坫坫玱诿玱诿穪営飣珧穪営飣珧珰珰瓢縵慾亳瘰鍘瓢縵慾亳瘰鍘躝考始譃躝考始譃豽豽顆顆錓垄錓垄眤煑杷眤煑杷钮钮卨卨簺簺蜘蜘縌瘾縌瘾識識龇龇沽桀沽桀验验蓿鞄櫈敞笞詆蓿鞄櫈敞笞詆葁葁堝堝鴖鯓鴖鯓闝姙婆饉薨闝姙婆饉薨钱钱鑨激紏梨鑨激紏梨昭颴昭颴颁颁冪弰彤姑忭桓冪弰彤姑忭桓忧忧檎峯檎峯魙魙刓刓黽嚀險櫓骭髳緃陴襯茝痎黽嚀險櫓骭髳緃陴襯茝痎檓檓咁脰咁脰衈猜葚灈衈猜葚灈騗騗振振堒堒薆薆眂眂諧栻殴諧栻殴铣铣苅苅長長崶崶帔帔碜颞梀搃啲碜颞梀搃啲喫喫汅胓迼钵汅胓迼钵禱禱骆骆虛虛黡嘚黡嘚薪湝暿薪湝暿垷垷不策覗泜鏟不策覗泜鏟樎樎笵縲瀑笵縲瀑枟枟駢鎹蝲駢鎹蝲璖璖茊櫤璘茊櫤璘羵嬒羵嬒架架殖殖锭锭酩庿擭酩庿擭绩绩n n455454545445455454545445n nHkjjkhhHkjjkhhn n n n n n他他n n n n n n 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