光镜下观察组织标本需克服的几个问题光镜下观察组织标本需克服的几个问题q 如何保持组织标本取材前的形态？如何保持组织标本取材前的形态？q 如何制备薄组织片，允许光的通过而便于如何制备薄组织片，允许光的通过而便于 观察？观察？q 如何使不同组织结构具有不同的光折射如何使不同组织结构具有不同的光折射 率，便于对标本进行结构的仔细辨别？率，便于对标本进行结构的仔细辨别？常规石蜡制片HE染色技术课件光镜标本的基本制作技术光镜标本的基本制作技术第二章第二章常规石蜡制片HE染色技术课件 光镜样本的基本制作技术（组织制片光镜样本的基本制作技术（组织制片技术）是医学研究和生物学研究中，观察技术）是医学研究和生物学研究中，观察细胞、组织的正常或病理形态变化的一种细胞、组织的正常或病理形态变化的一种必不可少的手段，借此可以弥补活体观察必不可少的手段，借此可以弥补活体观察的不足的不足 同时光镜样本的基本制作技术也是其同时光镜样本的基本制作技术也是其它光镜标本技术的基础它光镜标本技术的基础常规石蜡制片HE染色技术课件 取材取材 固定固定 漂洗漂洗 脱水脱水 透明透明 浸蜡浸蜡 包埋包埋 切片切片 脱蜡脱蜡 染色染色 脱水脱水 透明透明 封片封片光镜样本的制作的基本过程光镜样本的制作的基本过程常规石蜡制片HE染色技术课件第一节第一节 取材及固定取材及固定医学研究的组织样本来源医学研究的组织样本来源 人体（最好）人体（最好） 临床的活检组织临床的活检组织 尸检组织尸检组织 （取材方法及注意事项按病理学要求进行）（取材方法及注意事项按病理学要求进行） 正常组织正常组织 用正常动物的组织材料替代用正常动物的组织材料替代常规石蜡制片HE染色技术课件一、动物致死法一、动物致死法 动物的福利，动物的福利，3R3R原则原则 动物致死法选择动物致死法选择 致死动作应迅速致死动作应迅速常规石蜡制片HE染色技术课件常规石蜡制片HE染色技术课件1断头法断头法 2击头法击头法 3麻醉法麻醉法4股动脉放血法股动脉放血法 5空气栓塞法空气栓塞法动物致死方法动物致死方法常规石蜡制片HE染色技术课件细胞标本制备细胞标本制备 1. 印片法印片法 2. 穿刺法穿刺法 3. 沉淀法沉淀法 4. 培养细胞标本制备培养细胞标本制备常规石蜡制片HE染色技术课件二、取材及注意事项二、取材及注意事项1材料保持新鲜材料保持新鲜2组织块免受挤压组织块免受挤压3组织块力求小而薄组织块力求小而薄 4尽量保持组织的原有形态尽量保持组织的原有形态5选取好组织块的切面选取好组织块的切面 6动物品种的选择和熟悉取材的解剖位置动物品种的选择和熟悉取材的解剖位置7切除不需要的部分切除不需要的部分8保持材料的清洁保持材料的清洁常规石蜡制片HE染色技术课件三、组织固定法三、组织固定法 固定固定是使要观察的组织构造尽量是使要观察的组织构造尽量接近它取材前的状态接近它取材前的状态常规石蜡制片HE染色技术课件（一）固定目的（一）固定目的 1标本不发生离开身体后或死后变化标本不发生离开身体后或死后变化 2随后处理中，标本不易损坏随后处理中，标本不易损坏 3. 组织块硬化组织块硬化 4使组织内各种结构产生不同的折光使组织内各种结构产生不同的折光 率，或对染料具有不同的亲和力率，或对染料具有不同的亲和力常规石蜡制片HE染色技术课件 （二）固定方法（二）固定方法 1蒸气固定法（较细小而薄的标本）蒸气固定法（较细小而薄的标本） 2小块组织固定法（直接投入固定液中）小块组织固定法（直接投入固定液中） 3注射、灌注固定法（体积过大或固定注射、灌注固定法（体积过大或固定 液极难渗入内部的组织标本）液极难渗入内部的组织标本） （1）局部灌注固定（肺、肝、肾、脑等）局部灌注固定（肺、肝、肾、脑等） （2）全身灌注固定）全身灌注固定 （小鼠、大鼠、兔、（小鼠、大鼠、兔、 狗、猴、人）狗、猴、人） 4. 微波固定法微波固定法 常规石蜡制片HE染色技术课件常规石蜡制片HE染色技术课件 灌注过程灌注过程 充分暴露心脏充分暴露心脏 针尖插入左心室或升主动脉中针尖插入左心室或升主动脉中 快速灌注生理盐水快速灌注生理盐水 剪开右心耳（或右心房）放血剪开右心耳（或右心房）放血 换灌固定液，先快后慢输入换灌固定液，先快后慢输入常规石蜡制片HE染色技术课件 用量用量 1. 生理盐水生理盐水 大鼠需用大鼠需用80-100ml、兔、兔150-200ml、 猫猫200-250ml、猴、猴300-500ml、 狗狗800-1000ml 2. 固定液固定液 动物血液量的动物血液量的2倍倍 动物体重（动物体重（g）7%20（ml）常规石蜡制片HE染色技术课件 无论是局部灌注固定，还是全身灌无论是局部灌注固定，还是全身灌注固定，在灌注完毕后，必须立即将组注固定，在灌注完毕后，必须立即将组织块、器官或整个动物再放入同样的固织块、器官或整个动物再放入同样的固定液中进行后固定定液中进行后固定常规石蜡制片HE染色技术课件 1组织块不宜过大组织块不宜过大 2软组织或较大块组织可先经软组织或较大块组织可先经23小时固定后，小时固定后，再修整成小块重投入新配制的固定液内继续固定再修整成小块重投入新配制的固定液内继续固定 3固定液的量是组织块大小的固定液的量是组织块大小的5-20倍为宜，在倍为宜，在固定组织的瓶底垫上脱脂棉、数层纱布或滤纸固定组织的瓶底垫上脱脂棉、数层纱布或滤纸 4固定时间的长短视固定剂的种类、温度、组固定时间的长短视固定剂的种类、温度、组织块的大小而定织块的大小而定（三）固定注意事项及影响因素（三）固定注意事项及影响因素常规石蜡制片HE染色技术课件 1甲醛（福尔马林）：商品甲醛的浓度是甲醛（福尔马林）：商品甲醛的浓度是37% 40%的甲醛水溶液。常用甲醛的固定液浓的甲醛水溶液。常用甲醛的固定液浓度是度是10%，而实际甲醛浓度只有，而实际甲醛浓度只有4% 固定小块组织固定小块组织(15152mm)10小时左右小时左右 经它长期固定的组织，需经经它长期固定的组织，需经2448小时的自小时的自来水流水冲洗来水流水冲洗四、固定液四、固定液 （一）单纯固定液（一）单纯固定液常规石蜡制片HE染色技术课件 甲醛单纯固定液的常用配方甲醛单纯固定液的常用配方 10%甲醛水溶液甲醛水溶液 37%-40%甲醛液甲醛液 10ml 自来水或蒸馏水自来水或蒸馏水 90ml 10%甲醛生理盐水溶液甲醛生理盐水溶液 37%-40%甲醛液甲醛液 10ml 氯化钠氯化钠 0. 85g 自来水或蒸馏水自来水或蒸馏水 90ml常规石蜡制片HE染色技术课件 2多聚甲醛：一种渗透速度极快的多聚甲醛：一种渗透速度极快的甲醛聚合物，在热水中可解聚成甲醛单体甲醛聚合物，在热水中可解聚成甲醛单体而溶解，在接近水的沸点时溶解极快；也而溶解，在接近水的沸点时溶解极快；也可溶解于弱碱中。多聚甲醛溶液实际上是可溶解于弱碱中。多聚甲醛溶液实际上是新配制的甲醛液，宜临用前配制新配制的甲醛液，宜临用前配制常规石蜡制片HE染色技术课件 4%多聚甲醛单纯固定液的常用配方多聚甲醛单纯固定液的常用配方 多聚甲醛多聚甲醛 4g 蒸馏水（或蒸馏水（或0.2 mol/L PB） 50ml 在通风橱内加热使之完全溶解，然后冷却在通风橱内加热使之完全溶解，然后冷却 0.2 mol/L PB（或蒸馏水）（或蒸馏水） 100ml 常规石蜡制片HE染色技术课件 3戊二醛：一种常用的醛类固定戊二醛：一种常用的醛类固定剂，能较好的保存组织结构，但其穿透剂，能较好的保存组织结构，但其穿透力弱，作为单纯固定液多用于电镜技术力弱，作为单纯固定液多用于电镜技术中。市售的戊二醛是中。市售的戊二醛是25%的溶液，使用的溶液，使用时需配制成时需配制成1%6%的不同浓度的不同浓度常规石蜡制片HE染色技术课件 4酒精：单纯固定液为酒精：单纯固定液为80%95%的浓的浓度，不必水洗而直接脱水。多用于组织化学度，不必水洗而直接脱水。多用于组织化学中的糖原固定中的糖原固定 酒精固定的组织易变硬和发脆、组织收酒精固定的组织易变硬和发脆、组织收缩较大，所以不易长时间停留其中（缩较大，所以不易长时间停留其中（70%酒酒精除外）精除外） 可作为配制混合固定液的基本成分可作为配制混合固定液的基本成分常规石蜡制片HE染色技术课件5 其它固定液其它固定液 丙酮丙酮 苦味酸苦味酸 醋酸醋酸 重铬酸钾重铬酸钾 三氯醋酸三氯醋酸 铬酸铬酸 氯化汞氯化汞 锇酸锇酸常规石蜡制片HE染色技术课件 用多种具有固定作用的试剂混合配用多种具有固定作用的试剂混合配制的固定液，达到各试剂在固定作用中制的固定液，达到各试剂在固定作用中具有的优缺点平衡目的具有的优缺点平衡目的（二）混合固定液（二）混合固定液常规石蜡制片HE染色技术课件常用混合固定液常用混合固定液1酒精酒精-甲醛液（甲醛液（A-F 液）液） 95%或无水酒精（或无水酒精（A） 90ml 37%40%甲醛液（甲醛液（F） 10ml 2Carnoy液液 冰醋酸冰醋酸 10ml 氯仿氯仿 30ml 无水酒精无水酒精 60ml3Bouin 液液 饱和苦味酸水溶液饱和苦味酸水溶液 75ml 甲醛液（甲醛液（37%40%） 25ml 冰醋酸冰醋酸 5ml常规石蜡制片HE染色技术课件 4Helly 液液 重铬酸钾重铬酸钾 2.5g 升汞升汞 5g 蒸馏水蒸馏水 100ml （以上是（以上是Helly储存液）储存液） 甲醛液甲醛液(37%40%) (临用时加入临用时加入) 5ml 51%多聚甲醛多聚甲醛-1.25%戊二醛固定液戊二醛固定液 多聚甲醛多聚甲醛 1g 蒸馏水蒸馏水 50ml 在通风橱内加热使之完全溶解，然后冷却在通风橱内加热使之完全溶解，然后冷却 25%戊二醛戊二醛 5ml 0.2 mol/L PB（pH 7.4） 100ml常规石蜡制片HE染色技术课件第二节第二节 固定后处理及切片固定后处理及切片一、组织修整一、组织修整 固定结束后，将受挤压或不需要的固定结束后，将受挤压或不需要的部分组织修切或整形，同时选择好包埋部分组织修切或整形，同时选择好包埋面，称面，称组织修整组织修整。修整可在冲洗前、也。修整可在冲洗前、也可放在冲洗后可放在冲洗后常规石蜡制片HE染色技术课件二、组织洗涤二、组织洗涤 洗去渗入组织内的固定液，再进行下一洗去渗入组织内的固定液，再进行下一步骤的操作；否则会妨碍染色效果，或引起步骤的操作；否则会妨碍染色效果，或引起沉淀、结晶而影响观察，也可能会继续发生沉淀、结晶而影响观察，也可能会继续发生化学反应造成后道操作困难化学反应造成后道操作困难 1水洗涤法：凡用水配制、或含铬、锇水洗涤法：凡用水配制、或含铬、锇等的固定液所固定的组织块，需用水洗涤等的固定液所固定的组织块，需用水洗涤 2酒精洗涤法：凡用酒精、或酒精混合酒精洗涤法：凡用酒精、或酒精混合液、或含有苦味酸等固定液固定的组织块，液、或含有苦味酸等固定液固定的组织块，多采用酒精洗涤多采用酒精洗涤常规石蜡制片HE染色技术课件三、组织脱水三、组织脱水（一）脱水意义与脱水剂（一）脱水意义与脱水剂 因水和石蜡不能相溶，而组织经固定及因水和石蜡不能相溶，而组织经固定及水洗后含有水分，所以不能直接用石蜡进行水洗后含有水分，所以不能直接用石蜡进行包埋。需用某些溶剂逐步置换组织块中的水包埋。需用某些溶剂逐步置换组织块中的水分，称分，称脱水脱水 脱水剂必须具有下列特性：脱水剂必须具有下列特性：1）脱水剂）脱水剂能与水按任意比例混合；能与水按任意比例混合；2）脱水剂高浓度）脱水剂高浓度时不含水分；时不含水分；3）脱水剂也能与透明剂按任）脱水剂也能与透明剂按任意比例互相混合意比例互相混合常规石蜡制片HE染色技术课件 脱水剂中最常用的是酒精。脱水剂中最常用的是酒精。 一般从一般从70%酒精开始脱水，逐步酒精开始脱水，逐步升高酒精浓度；脱水时间根据组织块升高酒精浓度；脱水时间根据组织块的种类、大小、及使用的固定液种类的种类、大小、及使用的固定液种类等因素而定等因素而定常规石蜡制片HE染色技术课件 70%酒精酒精 25小时小时(可长期保存组织可长期保存组织) 80%酒精酒精 25小时小时 90%酒精酒精 25小时小时 95%酒精（酒精（） 25小时小时 95%酒精（酒精（） 25小时小时 无水酒精（无水酒精（） 30分钟分钟 无水酒精（无水酒精（） 30分钟分钟 无水酒精（无水酒精（） 30分钟分钟 （二）脱水步骤和时间（二）脱水步骤和时间 以以18mm18mm，厚约，厚约23mm的组织块的组织块 为例，其脱水步骤和参考时间如下为例，其脱水步骤和参考时间如下常规石蜡制片HE染色技术课件（三）脱水注意事项（三）脱水注意事项 1组织脱水必须掌握由低浓度逐步组织脱水必须掌握由低浓度逐步 过渡到高浓度的原则过渡到高浓度的原则 2脱水时间要适度脱水时间要适度 3组织脱水要彻底干净组织脱水要彻底干净常规石蜡制片HE染色技术课件四、透明四、透明（一）透明意义及透明剂（一）透明意义及透明剂 组织脱水后，内部仅含脱水剂，但大多数脱组织脱水后，内部仅含脱水剂，但大多数脱水剂不能与石蜡相溶，石蜡仍不能浸入组织内进水剂不能与石蜡相溶，石蜡仍不能浸入组织内进行包埋和切片。为此，需要一种既能溶于脱水剂行包埋和切片。为此，需要一种既能溶于脱水剂又能溶于包埋剂（石蜡）的溶剂，以便逐步将脱又能溶于包埋剂（石蜡）的溶剂，以便逐步将脱水剂置换成包埋剂。这一过程往往使组织呈半透水剂置换成包埋剂。这一过程往往使组织呈半透明状，故称明状，故称透明透明 二甲苯为石蜡包埋法中最常用的透明剂；它二甲苯为石蜡包埋法中最常用的透明剂；它透明能力强，但易使组织收缩、变脆，故组织块透明能力强，但易使组织收缩、变脆，故组织块的透明时间不宜太长，小组织块以的透明时间不宜太长，小组织块以30分钟为宜，分钟为宜，较大组织块适当延长但不超过较大组织块适当延长但不超过2小时小时常规石蜡制片HE染色技术课件（二）透明步骤和时间（二）透明步骤和时间 为为了了减减少少组组织织块块过过度度收收缩缩，往往往往在在无无水水酒酒精精之之后后，先先经经过过酒酒精精和和二二甲甲苯苯的的混混合合液液，然后再浸入纯二甲苯中然后再浸入纯二甲苯中 透明步骤和时间大致如下透明步骤和时间大致如下 1无水酒精无水酒精:二甲苯二甲苯=1:1 2030分钟分钟 2二甲苯（二甲苯（） 2030分钟分钟 3二甲苯（二甲苯（） 2030分钟分钟常规石蜡制片HE染色技术课件（三）透明注意事项（三）透明注意事项 二甲苯必须保持无水二甲苯必须保持无水 组织块脱水过程要彻底组织块脱水过程要彻底常规石蜡制片HE染色技术课件五、浸蜡五、浸蜡（一）浸蜡目的（一）浸蜡目的 浸浸蜡蜡是是将将透透明明过过的的组组织织块块在在熔熔化化的的石石蜡蜡中中浸浸渍渍的的过过程程。目目的的是是用用石石蜡蜡代代替替组组织织块块中中的的二二甲甲苯苯，在在随随后后温温度度下下降降中中，使使较较软软的的组组织织块块变变成成有有一一定定硬硬度度的的组组织织蜡蜡块块，以便切片机切片以便切片机切片常规石蜡制片HE染色技术课件 第第1杯杯熔熔蜡蜡(软软蜡蜡)(熔熔点点54以以下下) 1小小时时 第第2杯杯熔熔蜡蜡(硬硬蜡蜡)(5860) 1小小时时 第第3杯熔蜡杯熔蜡(硬蜡硬蜡)(5860) 30分分钟钟 整个浸蜡时间控制在整个浸蜡时间控制在3小时之内小时之内 浸蜡在恒温箱中进行，且恒温箱温度高浸蜡在恒温箱中进行，且恒温箱温度高 于石蜡熔点于石蜡熔点 23（二）浸蜡的步骤（二）浸蜡的步骤常规石蜡制片HE染色技术课件（三）浸蜡注意事项（三）浸蜡注意事项 1浸蜡最佳温度应是石蜡刚熔化、或蜡杯底部浸蜡最佳温度应是石蜡刚熔化、或蜡杯底部 尚残留小部分未熔完蜡时的温度尚残留小部分未熔完蜡时的温度 2浸蜡中一般采用浸蜡篮浸蜡法，把组织块和浸蜡中一般采用浸蜡篮浸蜡法，把组织块和 标签一齐装入分格篮内浸蜡标签一齐装入分格篮内浸蜡 3石蜡应在加热的条件下过滤除去杂质石蜡应在加热的条件下过滤除去杂质 4浸蜡用的石蜡要定期更换浸蜡用的石蜡要定期更换 5新石蜡应在使用前放在温箱内熔化一次，使新石蜡应在使用前放在温箱内熔化一次，使 其中的挥发性物质蒸发其中的挥发性物质蒸发 6包埋结束后应将熔蜡从温箱内取出，以免包埋结束后应将熔蜡从温箱内取出，以免 石蜡无益地加温熔化石蜡无益地加温熔化常规石蜡制片HE染色技术课件常规石蜡制片HE染色技术课件六、包埋（石蜡包埋法）六、包埋（石蜡包埋法）（一）包埋目的及包埋剂（一）包埋目的及包埋剂 包包埋埋是是将将某某些些特特殊殊的的支支持持物物质质浸浸入入到到组组织织块块内内部部，利利用用支支持持物物质质的的物物理理特特性性，将将整整个个组组织织加加以以包包埋埋，最最后后凝凝固固成成均均匀匀一一致致的的较较硬硬固固态态结构，以便切片机制备极薄切片结构，以便切片机制备极薄切片 石蜡是组织学切片技术中最常用的包埋剂石蜡是组织学切片技术中最常用的包埋剂常规石蜡制片HE染色技术课件（二）包埋过程（二）包埋过程 1取预热包埋框及金属板，搭成包埋模具取预热包埋框及金属板，搭成包埋模具 2. 迅速倾注少量熔蜡于包埋框中迅速倾注少量熔蜡于包埋框中 3. 从蜡杯中夹取组织块，切面向下置于框底从蜡杯中夹取组织块，切面向下置于框底 4. 加熔蜡至包埋框上缘加熔蜡至包埋框上缘 ，将标签纸紧贴旁边，将标签纸紧贴旁边 5. 表面熔蜡凝结至一定厚度时，慢慢浸入冷水表面熔蜡凝结至一定厚度时，慢慢浸入冷水 中（夏天用冰水）急速凝固中（夏天用冰水）急速凝固 6. 凝结蜡块自动漂浮于水面，或凝结蜡块自动漂浮于水面，或30分钟后推开分钟后推开 包埋框，取出蜡块。包埋框，取出蜡块。 7. 修块修块常规石蜡制片HE染色技术课件常规石蜡制片HE染色技术课件（三）包埋注意事项（三）包埋注意事项 1包埋蜡的熔点选择包埋蜡的熔点选择 2石蜡脆性大时，可加蜂蜡提高韧性石蜡脆性大时，可加蜂蜡提高韧性 3包埋用石蜡和最后浸蜡的石蜡熔点要包埋用石蜡和最后浸蜡的石蜡熔点要 相同相同 4包埋中组织块间要有一定距离包埋中组织块间要有一定距离 5石蜡凝固要快速石蜡凝固要快速常规石蜡制片HE染色技术课件常规石蜡制片HE染色技术课件七、切片七、切片（一）石蜡切片机及切片刀（一）石蜡切片机及切片刀 1石蜡切片机石蜡切片机 最最常常用用的的石石蜡蜡切切片片机机是是轮轮转转式式切切片片机机，它它的的切切片片刀刀固固定定不不动动，而而靠靠右右侧侧旋旋转转的的重重轮轮带带动动螺螺纹纹轴轴和和齿齿轮轮，将将组组织织块块夹夹具具按按所所调调节节的的切切片片厚厚度度向向前前推推进进，并并在在上上下下平平面面运运动动，让让组组织织块块经经过过前前下下方方切切片片刀刀而而切切成成一定厚度的切片一定厚度的切片常规石蜡制片HE染色技术课件常规石蜡制片HE染色技术课件 2切片刀与磨刀切片刀与磨刀 石石蜡蜡切切片片常常用用的的切切片片刀刀为为平平楔楔型型切切片刀，也有一次性切片刀片刀，也有一次性切片刀 非一次性使用的切片刀在切片前需非一次性使用的切片刀在切片前需要研磨，以保持其锋利；研磨刀可分为要研磨，以保持其锋利；研磨刀可分为手工研磨刀和机械研磨刀（磨刀机）两手工研磨刀和机械研磨刀（磨刀机）两种种常规石蜡制片HE染色技术课件常规石蜡制片HE染色技术课件常规石蜡制片HE染色技术课件常规石蜡制片HE染色技术课件（二）石蜡切片过程（二）石蜡切片过程 1修块修块 2蜡块和切片刀固定蜡块和切片刀固定 3调调整整蜡蜡块块切切面面和和切切片片刀刀角角度度(10以以内内) 4. 调整刀台与标本台距离调整刀台与标本台距离 5. 修整蜡块切面，暴露完整组织切面修整蜡块切面，暴露完整组织切面 6. 调整切片厚度调节器调整切片厚度调节器(厚度为厚度为68m) 7. 正式切片正式切片 8切片展平切片展平 9贴片和烘片贴片和烘片常规石蜡制片HE染色技术课件常规石蜡制片HE染色技术课件常规石蜡制片HE染色技术课件常规石蜡制片HE染色技术课件 （1）切片碎卷状：脱水、透明或浸蜡时间长、浸蜡温度高）切片碎卷状：脱水、透明或浸蜡时间长、浸蜡温度高 （2）蜡片卷曲：刀口不锋利或脏、刀角倾斜过度、石蜡过硬）蜡片卷曲：刀口不锋利或脏、刀角倾斜过度、石蜡过硬 （3）切片不成蜡带：室温低、石蜡过硬、蜡块上下边过小或）切片不成蜡带：室温低、石蜡过硬、蜡块上下边过小或 不平不平 （4）蜡带弯曲：蜡块的两侧大小不等、刀口不锋利）蜡带弯曲：蜡块的两侧大小不等、刀口不锋利 （5）切片皱褶：石蜡过软、浸蜡不完全、刀的倾斜角度过小）切片皱褶：石蜡过软、浸蜡不完全、刀的倾斜角度过小 （6）切片厚薄不均：刀口不锋利、切片机性能不佳、刀架或）切片厚薄不均：刀口不锋利、切片机性能不佳、刀架或 刀或蜡块未固定牢刀或蜡块未固定牢 （7）切片出现纵纹：刀刃有缺口、石蜡或组织的硬度不一）切片出现纵纹：刀刃有缺口、石蜡或组织的硬度不一 （8）切片出现横纹：蜡块、刀或刀架未固定好）切片出现横纹：蜡块、刀或刀架未固定好 （9）切片粘刀：刀锋沾污、刀的倾斜角度过小、刀口不锋利）切片粘刀：刀锋沾污、刀的倾斜角度过小、刀口不锋利 （10）蜡块底边呈白色：刀的倾斜角度过小）蜡块底边呈白色：刀的倾斜角度过小 （11）切片粘蜡块：刀纯、刀口不洁、室内温度高、太干燥）切片粘蜡块：刀纯、刀口不洁、室内温度高、太干燥（三）切片过程中常遇问题及可能造成原因（三）切片过程中常遇问题及可能造成原因常规石蜡制片HE染色技术课件第三节第三节 苏木素苏木素-伊红染色方法伊红染色方法 染色染色是将组织浸入染料配制的染色液是将组织浸入染料配制的染色液中，使组织中的不同结构染上不同颜色或中，使组织中的不同结构染上不同颜色或不同深浅的颜色，从而产生不同的折射率，不同深浅的颜色，从而产生不同的折射率，便于在光镜下清楚地显示组织内部各种构便于在光镜下清楚地显示组织内部各种构造造 常规石蜡制片HE染色技术课件 染料染料是一类有色的以苯环为基础的有是一类有色的以苯环为基础的有机化合物，它不同于一般颜料，因为它不机化合物，它不同于一般颜料，因为它不但有颜色，更重要的是它对组织的不同成但有颜色，更重要的是它对组织的不同成份具有不同的亲和力。构成染料至少必须份具有不同的亲和力。构成染料至少必须有两种原子团连接于苯环上，即能使染料有两种原子团连接于苯环上，即能使染料显色的原子团显色的原子团-发色色团和能使染料对不同和能使染料对不同组织具有不同亲和力及加深颜色的原子团组织具有不同亲和力及加深颜色的原子团（酸、碱性基团）（酸、碱性基团）-助色团助色团常规石蜡制片HE染色技术课件 分类分类 细细胞胞核核染染料料有有天天然然染染料料苏苏木木素素、胭胭脂脂红红及及人人工工合合成成的的染染料料结结晶晶紫紫、甲甲苯苯胺胺蓝蓝、甲基绿、美蓝、焦油紫等甲基绿、美蓝、焦油紫等 细细胞胞质质染染料料有有人人工工合合成成的的伊伊红红Y、酸酸性复红、苦味酸、水溶性苯胺蓝等性复红、苦味酸、水溶性苯胺蓝等常规石蜡制片HE染色技术课件 媒媒染染剂剂为为有有些些二二价价或或三三价价金金属属物物质质，如如铝铝、铁铁、铜铜、钨钨等等可可作作为为中中介介媒媒体体物物质质，使使原原来来几几乎乎不不与与组组织织结结合合或或结结合合能能力力很很弱弱的的部部分分染染料料（尤尤其其是是天天然然染染料料）着着色色；它它主主要要是是通通过过增增加加染染料料对对组组织织中中某某一一成成份份的的亲亲和和能能力力，自自身身又又与与染染料料或或组织发生结合而发挥作用组织发生结合而发挥作用常规石蜡制片HE染色技术课件 助染剂助染剂（促染剂）与媒染剂不同，它只加强染（促染剂）与媒染剂不同，它只加强染 料的染色能力，而自身不参与染色反应料的染色能力，而自身不参与染色反应 分化剂分化剂（脱色剂、分色剂）用于退行性染色（脱色剂、分色剂）用于退行性染色 法中脱去组织过染的染料，降低着色颜色法中脱去组织过染的染料，降低着色颜色 酸性分化剂酸性分化剂 0.51%的盐酸酒精（的盐酸酒精（95%以以 下）或较稀的冰醋酸水溶液下）或较稀的冰醋酸水溶液 氧化分化剂氧化分化剂 苦味酸、铬酸、重铬酸钾、苦味酸、铬酸、重铬酸钾、 过锰酸钾等过锰酸钾等 媒染分化剂媒染分化剂 既能促使组织和染料结合，既能促使组织和染料结合， 又可使已经结合到组织上的染料脱离又可使已经结合到组织上的染料脱离常规石蜡制片HE染色技术课件一、苏木素一、苏木素-伊红染色的基本原理伊红染色的基本原理 苏木素和伊红染色是组织学中常规制苏木素和伊红染色是组织学中常规制片中最基本，也是应用最广泛的染色方法，片中最基本，也是应用最广泛的染色方法，故称故称常规染色常规染色（简称（简称HE染色染色） 常规石蜡制片HE染色技术课件 苏木素苏木素（或苏木精）是一种天然的染料，易（或苏木精）是一种天然的染料，易溶于酒精而微溶于水，是较好的细胞核碱性染料，溶于酒精而微溶于水，是较好的细胞核碱性染料，并可将细胞中不同的结构分化出各种不同的颜色；并可将细胞中不同的结构分化出各种不同的颜色；苏木素分子须经氧化形成苏木红分子，才具有真苏木素分子须经氧化形成苏木红分子，才具有真正的染色能力；同时须配合适当的媒染剂以增强正的染色能力；同时须配合适当的媒染剂以增强它对组织的亲和力，达到染色目的它对组织的亲和力，达到染色目的 伊红伊红（或曙红）是人工合成的煤焦油类染料，（或曙红）是人工合成的煤焦油类染料，红色粉末状，易溶于水或酒精，为酸性细胞胞质红色粉末状，易溶于水或酒精，为酸性细胞胞质染料；有伊红染料；有伊红Y、B、BN等，常用的是伊红等，常用的是伊红Y。伊红常作为苏木素的对比染色染料，染色中常需伊红常作为苏木素的对比染色染料，染色中常需加助染剂和分化剂，使染色效果更加好加助染剂和分化剂，使染色效果更加好 常规石蜡制片HE染色技术课件二、苏木素二、苏木素-伊红染液的配制伊红染液的配制（一）苏木素染液（一）苏木素染液 一种是将氧化剂（如氧化汞、高锰酸钾、一种是将氧化剂（如氧化汞、高锰酸钾、过氧化氢或碘酸钠等）与媒染剂（硫酸铝铵、过氧化氢或碘酸钠等）与媒染剂（硫酸铝铵、硫酸铝钾或硫酸铝铁等）直接混合于苏木素硫酸铝钾或硫酸铝铁等）直接混合于苏木素中配成溶液中配成溶液 另一种是先用媒染剂媒染组织结构，再另一种是先用媒染剂媒染组织结构，再用氧化的苏木素（自然氧化）染色，最后用用氧化的苏木素（自然氧化）染色，最后用媒染剂分色媒染剂分色 常规石蜡制片HE染色技术课件Harris苏木素染液苏木素染液 苏木素苏木素 1g 无水酒精无水酒精 10ml 硫酸铝钾（或硫酸铝铵）硫酸铝钾（或硫酸铝铵） 20g 蒸馏水蒸馏水 200ml 氧化汞氧化汞 0.5g常规石蜡制片HE染色技术课件Mayer苏木素液苏木素液 苏木素苏木素 1g 蒸馏水蒸馏水 1000ml 碘酸钠碘酸钠 0.2g 硫酸铝钾硫酸铝钾 50g 枸橼酸钠枸橼酸钠 1g 水合氯醛水合氯醛 50g常规石蜡制片HE染色技术课件 醇溶性伊红染液醇溶性伊红染液 伊红伊红Y 0.5g 95%酒精酒精 100ml 水溶性伊红染液水溶性伊红染液 伊红伊红Y 0.5-1g 蒸馏水蒸馏水 75ml 95%酒精酒精 25ml 冰醋酸冰醋酸 12滴滴 （二）伊红染液（二）伊红染液常规石蜡制片HE染色技术课件（三）分化液（三）分化液 去除过度染色或不需要着色的组织成去除过度染色或不需要着色的组织成份上颜色的过程，叫份上颜色的过程，叫分色分色所使用的试剂配制的液体称为所使用的试剂配制的液体称为分化液分化液而苏木素的分化过程中，使酸性条件而苏木素的分化过程中，使酸性条件转变成碱性条件，苏木素染色的结构也由转变成碱性条件，苏木素染色的结构也由红色转变成蓝色，所以这一过程又称红色转变成蓝色，所以这一过程又称蓝化蓝化 常规石蜡制片HE染色技术课件 1氢氧化铵水溶液（氢氧化铵水溶液（pH 7.5-8.0 ） 氢氧化铵（氨水）氢氧化铵（氨水） 3ml 蒸馏水蒸馏水 1000ml 21%盐酸酒精溶液盐酸酒精溶液 盐酸盐酸 1ml 70%酒精酒精 99ml常规石蜡制片HE染色技术课件三、石蜡切片染色中脱蜡、水洗、三、石蜡切片染色中脱蜡、水洗、 脱水和透明等的作用脱水和透明等的作用 石蜡石蜡 去石蜡去石蜡 去二甲苯去二甲苯 水化水化 颜色颜色 二甲苯二甲苯 酒精酒精 水水 染液染液 透明透明 脱水脱水 水分水分 二甲苯二甲苯 酒精酒精常规石蜡制片HE染色技术课件四、染色程序四、染色程序 （一）脱蜡至水（一）脱蜡至水 石蜡切片石蜡切片 冰冻切片冰冻切片 1二甲苯（二甲苯（） 5分钟分钟 2二甲苯（二甲苯（） 5分钟分钟 3无水酒精（无水酒精（） 5分钟分钟 4无水酒精（无水酒精（） 5分钟分钟 595%酒精酒精 5分钟分钟 680%酒精酒精 1分钟分钟 770%酒精酒精 1分钟分钟 8自来水自来水 2分钟分钟 3分钟分钟 9蒸馏水蒸馏水 1分钟分钟 1分钟分钟常规石蜡制片HE染色技术课件（二）染色（二）染色 石蜡切片石蜡切片 冰冻切片冰冻切片 1苏木素液苏木素液 5-15分钟分钟 1-2分钟分钟 2自来水洗自来水洗 1分钟分钟 30秒秒 3酸性分化液（镜下控制）酸性分化液（镜下控制） 30秒秒 20秒秒 4自来水蓝化自来水蓝化 20分钟分钟 20秒秒 5稀氨水稀氨水 30秒秒 6. 蒸馏水蒸馏水 10秒秒 20秒秒 770%酒精酒精 3分钟分钟 3分钟分钟 880%酒精酒精 3分钟分钟 3分钟分钟 9沉淀酸化伊红乙醇液沉淀酸化伊红乙醇液 30秒秒 30秒秒常规石蜡制片HE染色技术课件（三）脱水、透明和封片（三）脱水、透明和封片 石蜡切片石蜡切片 冰冻切片冰冻切片 195%酒精（酒精（） 1分钟分钟 1分钟分钟 295%酒精（酒精（） 1分钟分钟 1分钟分钟 3无水酒精（无水酒精（） 5分钟分钟 3分钟分钟 4无水酒精（无水酒精（） 5分钟分钟 3分钟分钟 5无水酒精（无水酒精（） 5分钟分钟 3分钟分钟 6无水酒精无水酒精+二甲苯（二甲苯（1:1） 5分钟分钟 3分钟分钟 7二甲苯（二甲苯（） 5分钟分钟 3分钟分钟 8二甲苯（二甲苯（） 5分钟分钟 3分钟分钟 9二甲苯（二甲苯（） 5分钟分钟 3分钟分钟 10中性树胶封片中性树胶封片 常规石蜡制片HE染色技术课件五、染色注意事项五、染色注意事项 1染色前需烘烤切片，并立即进行染色染色前需烘烤切片，并立即进行染色 2切切片片脱脱蜡蜡后后，应应保保持持切切片片在在液液体体中中，防防止止干干燥燥。脱脱蜡蜡温温度度应应在在25左左右右环环境境中中进进行行，时时间间可可适适当延长当延长 3获获得得好好的的染染色色效效果果，需需选选择择合合适适的的固固定定液液和和固定时间固定时间 4染染色色时时间间应应根根据据染染液液的的种种类类、新新旧旧、组组织织种种类、固定液种类及环境温度等而定类、固定液种类及环境温度等而定 5苏苏木木精精染染色色后后，分分色色和和蓝蓝化化应应在在显显微微镜镜下下进进行，以细胞核染色清晰，而胞质等基本无色为佳行，以细胞核染色清晰，而胞质等基本无色为佳常规石蜡制片HE染色技术课件 6伊伊红红水水溶溶液液染染色色的的切切片片，易易被被低低浓浓度度酒酒精精脱脱水水时时洗洗掉掉。最最好好在在脱脱水水至至95%酒酒精精时时，进进行行伊伊红红乙乙醇液染色，然后脱水透明醇液染色，然后脱水透明 795%酒酒精精及及无无水水酒酒精精的的脱脱水水一一定定要要彻彻底底，若若切切片片进进入入二二甲甲苯苯时时出出现现混混浊浊或或白白色色不不透透明明，表表明明脱脱水水不不彻彻底底，应应重重新新退退回回到到无无水水酒酒精精中中再再脱脱水水；如如仍仍不透明，则应更换无水酒精不透明，则应更换无水酒精 8透明时间要保证，可用石碳酸透明时间要保证，可用石碳酸-二甲苯进行透二甲苯进行透明明 9封片的盖玻片要大于切片；封片剂滴加量适封片的盖玻片要大于切片；封片剂滴加量适宜；避免气泡。封片后应在恒温箱中烘烤宜；避免气泡。封片后应在恒温箱中烘烤10小时小时 常规石蜡制片HE染色技术课件常规石蜡制片HE染色技术课件常规石蜡制片HE染色技术课件常规石蜡制片HE染色技术课件常规石蜡制片HE染色技术课件常规石蜡制片HE染色技术课件常规石蜡制片HE染色技术课件常规石蜡制片HE染色技术课件常规石蜡制片HE染色技术课件常规石蜡制片HE染色技术课件常规石蜡制片HE染色技术课件常规石蜡制片HE染色技术课件常规石蜡制片HE染色技术课件谢谢大家！谢谢大家！常规石蜡制片HE染色技术课件