第六章 植物钾营养分子生理植物钾营养分子生理Zichao Mao mzcleemaogmail.com高级植物生理学植物钾营养分子生理课件Why potassium is important Potassium (K) play key roles in physiological and biochemical processes, which greatly influence the growth and development of plants. Particular physiological processes affected substantially by inadequate supply of K (1) partitioning of carbohydrates between roots and shoots; (2) photosynthetic carbon metabolism; (3) formation of reactive O2 species and related photooxidation; (4) regulation of stomatal activity and water regime; (5) tolerance against biotic and abiotic stress factors, such as salt stress and drought stress.高级植物生理学植物钾营养分子生理课件1钾离子是植物细胞中含量最丰富的阳离子之一。它的功能：K+能促进细胞内酶的活性。细胞内有50多种酶或完全依赖于K+ ，或受K+的激活，如丙酮酸激酶、谷胱合成酶、6-磷酸果糖激酶等能被K+激活。作用方式为：同其他一价阳离子都是通过诱导酶构象的改变，使酶得到活化，从而提高催化反应的速率。在某些情况下K+能增加酶对底物的亲和力。K+对膜结合ATP酶也有激活作用。高级植物生理学植物钾营养分子生理课件2.K+与蛋白质的合成有关。小麦胚芽中分离出的核糖体，合成蛋白质达到最佳速率时，其所需K+浓度为130mM。3 K+可能参与tRNA与核糖体结合过程中的几个步骤。高级植物生理学植物钾营养分子生理课件Mineral nutrition of plants-P-P-K-K-N-N-S-S-Ca-Ca-Fe-Fe-Mg-Mg高级植物生理学植物钾营养分子生理课件Plants need elements other than C to grow and developMust integrate carbon with other inorganic minerals taken up by roots from environmentTogether, these elements are the building blocks of complex molecules (proteins, nucleic acids, etc.)Mineral (inorganic) nutrition dependent on C metabolism and vice-versaNeed for understanding how plants gain nutrition from environmentPeople no longer grew their own food!Need to optimize growth conditions to feed more peoplecentral role of NPK fertilizer to boost yield高级植物生理学植物钾营养分子生理课件Hydroponic growth facilitated the discovery of essential mineral nutrientsFurther definition of “essential”: Sachs (mid-19th century) used hydroponic culturenow used for vegetable production roots are cultured in solution, not in soilMore modern growth mediaHoaglands solution now slightly MODIFIEDMurashige and Skoog (M + S)Solutions have high nutrient levels relative to soil Required because the supply is often not replenished frequentlyHydroponic culture can be as simple as a plant supported in an aerated potIf roots waterlogged, what happens to yield?CaNKSMgPFeBMnZnCuMo高级植物生理学植物钾营养分子生理课件Main disadvantage of simple solution culture as plant grows, it selectively depletes certain mineralsWhen one becomes limiting, growth will slow significantlyCan grow in vermiculite/perlite (inert, non-nutritive) and refertilize dailyCommercially, it is often cheaper and easier to continuously bathe roots in a nutrient solution (nutrient film technique)AeratesStandard nutrient level maintainedContinuous process monitoring To define “essential”, researchers need inert materials contributing low levels of nutrients (NO METAL PARTS!)Fig. 12.1Fig. 12.2Hydroponic culture techniques come in different flavors高级植物生理学植物钾营养分子生理课件There are 17 essential elements required for plant growthWhat defines an “essential” element?1.In its absence the plant cannot complete a normal life cycle2.The element is part of an essential molecule (macromolecule, metabolite) inside the plantMost elements fall into both categories above (e.g., structural vs. enzyme cofactor)These 17 elements are classified as9 macronutrients (present at 10 mmol / kg dry wt.)8 micronutrients ( 10 mmol / kg dry wt.)Environmental (silicon dust) and/or cultural (from equipment, water, impure salts) contamination make assigning “essentiality” difficultEssentiality of micronutrients (0.11 ug/L!) especially difficult to establishDifficult to detect low concentrations push detection limit of common analytical techniques (e.g., flame spectrometry)高级植物生理学植物钾营养分子生理课件The availability of some minerals to the plant for growth is dependent on environmental conditionsThere may be high levels of nutrient present in soil but it is not in a metabolically useful forme.g., FeNeed to supply a lotDependent on pH (precipitates out of solution)Fe2+ more bioavailable (soluble)Many plant “diseases” are actually mineral deficiencies (common: Mn, B, Cl)Some inessential elements are still beneficial to plant health required at sub-micronutrient concentrationsNa (in C4 plants involved in transporting C between bundle sheath and mesophyll cells)Si (in cell walls; prevents lodging)Co (by N-fixing bacteria) 高级植物生理学植物钾营养分子生理课件The absence of essential elements causes deficiency symptomsEssential because of their metabolic functionsCharacteristic deficiency symptoms shown because of these rolesTypical deficiency responses areChlorosis: yellowing; precursor toNecrosis: tissue deathExpressed when a supply of an essential metabolite becomes limiting in the environmentElement concentrations are limiting for growth when they are below the critical concentraionThis is the concentration of nutrient in the tissue just below the level giving maximum growth高级植物生理学植物钾营养分子生理课件Concept of critical concentration illustratedAbove critical concentration, there is no net benefit (e.g., yield increase) if more nutrient is suppliedBelow critical concentration, nutrient level limits growth!Not shown on diagram: all elements eventually become toxic at very high concentrations This is more common for micronutrients in polluted environments“HEAVY METAL” contaminationFig. 12.3高级植物生理学植物钾营养分子生理课件Limiting nutrient levels negatively affect growthPlant responses to limiting nutrients usually very visible: affects yield/growth!Again, chlorosis and necrosis of leaves is typicalSometimes straightforward relationshipe.g., in chlorosis,N: chlorophyll componentMg: cofactor in chlorophyll synthesis Fig. 12.4Sometimes NOTSymptoms dependent on species and nutrient mobilityCtrlCtrl- P- P- Ca- Ca- N- N- Fe- Fe高级植物生理学植物钾营养分子生理课件Lets briefly discuss cellular roles and deficiency symptoms for the big 3 essential elementsN:Abundant in atmosphere but metabolically unavailable to non-legumesUsually absorbed as nitrate (NO3-) and reduced to ammonia (NH4+) in the plantAgronomically, N is always limiting There is a direct relationship between N supplied and yield!Component of proteins, NAs (bases), PGRs, chlorophyllSymptoms of deficiency: slow growth, leaf chlorosisMobilized from older leaves to sinks as soluble amines NH3 and amidesTherefore, older leaves show first signsAlso accumulate anthocyanin pigments because C skeletons cant make chlorophyll, amino acids, etc. (no N!)This is a typical nutrient stress response!OCNCH3CH3Rost et al. “Plant biology”, 2nd edn高级植物生理学植物钾营养分子生理课件Phosphorus is the most limiting element in natural environmentsP:Present in soil as phosphoric acid ( H3PO4 )pH 6.8: H2PO4- orthophosphate most bioavailable formDeprotonated at higher pH less availablePO4 tends to precipitate and form unavailable complexes withMetalsOrganic moleculesPresent at Rb+NH4Na+Li+Cs+。动力学分析的Km为8mmol/L。高级植物生理学植物钾营养分子生理课件5 植物外向整流K通道（ K out）的特征（1）位置： K out通道存在于植物的各类细胞的质膜中。（2）开启与关闭机制：在细胞膜去极化（depolarization）的条件下，它被激活打开，此时的跨膜电势比较高，导致K由胞内排出到胞外。当膜电位去极化-40mV时， K out通道被激活，产生K外流。Schroeder 等（1987）推算每个保卫细胞原生质膜有近103个K外流通道。分离菜豆叶片下表皮保卫细胞，进行电压钳位试验，测得细胞内K浓度为105mmol/L，细胞外K浓度为12mmol/L时，细胞的静息电压为-60mV，在钳位电压升到-40mV以上时，产生大量的外向电流，而在超极化电位条件下，诱发内流电流产生。高级植物生理学植物钾营养分子生理课件（3）外向整流K通道的种类：A. 在动物细胞的质膜上已鉴定出一系列外向整流K通道，称为Shaker超家族（Shaker superfamily）。该类型K通道是由4个亚基组成，每个亚基分子质量约为65100kDa之间，4个亚基上的P-区域（P-domain）排列形成通道孔（Hille 1992；Jan and Jan 1992），每一个亚基具有6个跨膜区域S1，S2，S3，S4，S5，S6。S4区域包含有几个带正电荷的氨基酸，对膜电压较敏感，称为电压敏感区。P区域形成通道孔的一部分， 对于通道的选择性具有非常重要的作用。动物细胞上的K通道也存在亚基，亚基为改变K通道的特性提供了新的机制，它能通过调节通道蛋白的失活来调节通道的特性；高级植物生理学植物钾营养分子生理课件B. 植物细胞中K通道结构与动物的K通道Shaker超家族结构类似，也是由亚基组成，也存在着亲水性的类似于动物的亚基，对通道的活性进行调节。如拟南芥中有一个KAB序列相当于动物K通道上的亚基，其分子质量33kDa，与拟南芥K通道KAT的亚基紧密结合，调节通道活性。高级植物生理学植物钾营养分子生理课件6.2 植物植物K通道的功能通道的功能一、 K通道对膜电势的调节通道对膜电势的调节不同方式的物质跨膜运动，其结果是产生维持了膜两侧不同的物质浓度梯度。对离子来说，就形成了膜两侧的电位差。玻璃微电极插入细胞可测出细胞质膜两侧的各种带电物质形成的电位差的总和，即膜电位。这类测定首次是在巨型藻类细胞中进行的，检出的细胞膜负电势高达-100-200mV。细胞膜电位种类：一种称为静息电位（resting potential），在该电位条件下，没有离子的转运；另一种是激活电位（active potential），即在刺激作用下产生并行使通讯功能的快速变化的膜电位。高级植物生理学植物钾营养分子生理课件二、二、Na K泵对静息电位相对恒定也有重要的泵对静息电位相对恒定也有重要的作用作用因为Na K泵能维持细胞内高K低Na的内部环境，使细胞具有相对稳定的膜电位。Na K泵的组成：它由和两个亚基组成，亚基的分子量为120kDa,是一个跨膜多次的整合膜蛋白，具有ATP酶活性。亚基分子质量为50kDa,是一种具有组织特异性的糖蛋白。高级植物生理学植物钾营养分子生理课件Na K泵的工作模式：在细胞内侧亚基与Na相结合促进ATP水解，亚基上一个天门冬氨酸残基磷酸化引起亚基构象发生变化，将Na运出细胞，同时细胞外的K与亚基的另一个位点结合，使其去磷酸化，亚基构象再度发生变化将K输入细胞，完成了整个循环。每个循环消耗一个ATP分子，转运3个Na和2个K 。高级植物生理学植物钾营养分子生理课件综上所述，膜电位与质膜对K和Na的不同透性有关，而且质膜上的Na、 K通道蛋白及Na -K泵等膜蛋白随膜电位变化有规律地关启。高级植物生理学植物钾营养分子生理课件6.3 6.3 K通道与植物通道与植物K营养吸收转运营养吸收转运一、植物根系对一、植物根系对K 的吸收转运有两种机制的吸收转运有两种机制高亲和K吸收（high affinity K uptake）与低亲和K吸收（low affinity K uptake）(Maathuis and Sanders 1996)。高亲和K吸收主要依靠转运体来完成，是一种主动吸收过程。低亲和K吸收主要通道K内流通道完成。 K通道蛋白对K吸收的Km为316mmol/L，细胞外界K浓度300mol/L。高级植物生理学植物钾营养分子生理课件Findlay和Gassmann于1994年分别在小麦根毛和表皮细胞中观察到典型的K in通道电流，其Km为8.8mmol/L。这与低亲和K吸收动力学特性相一致。研究发现小麦根毛中的K in通道能被Al3所抑制（Gassmann 1994）。铝对植物毒害的主要生理机制是抑制根的生长，影响根系对阳离子的吸收。铝抑制K in通道，从另一方面也证明了K in通道是低亲和K吸收的主要途径。高级植物生理学植物钾营养分子生理课件二、二、 K in in通道对离子吸收具有两种功能通道对离子吸收具有两种功能 K in通道为低亲和K吸收提供了一条途径，其吸收过程受H-泵建立的跨膜电势的驱动； K in通道通过感受胞外与胞内之间的K浓度梯度，调整膜电导而控制溶质的跨膜运输，影响其他运输系统对营养物质的吸收。高级植物生理学植物钾营养分子生理课件6.4 6.4 K通道与木质部的运输通道与木质部的运输植物根系吸收的养分到达地上之前需要被转运到木质部。木质部导管周围的木薄壁细胞中的质子泵、水通道和离子通道对离子或溶质在木质部的载入和卸出起着重要作用。大麦的木薄壁细胞质膜中有三类阳离子通道。外向整流传导的K通道（KORCK+：outward-rectifying conductance，等于K out通道）、非选择性外向整流传导K通道（NORC：nonselective outward-rectifying conductance）及内向整流传导K通道（KIRC： K inward-rectifying conductance，等于K in通道）。高级植物生理学植物钾营养分子生理课件KORC及NORC通道负责离子载入木质部，分别在跨膜电势高于-50和+30mV时被激活。NORC通道对阳离子无选择性，与胚乳细胞中描述的外向整流通道类似（Stoeckel and Takeda 1989）。KORC和NORC通道能共同存在于同一个细胞中，它们的激活都依赖于胞内Ca2水平。根系中，当质子泵的活力减少和（或）阴离子通道激活引起阴离子释放到木质部时，导致膜的去极化，激活Kout通道，Kout通道将K释放出到木质部。高级植物生理学植物钾营养分子生理课件在以上描述K 通道作用时，我们都没有考虑植物细胞中的液泡对生理过程的影响。液泡作为植物细胞的一个重要组成，它积累它积累了胞内了胞内9595的的K K ，是细胞膨胀和萎蔫的结构基础。在大多数情况下，液泡对K 的吸收是主动运输，而液泡内K的释放被认为是由K K通道调整的。已经证明液泡膜中存在有三种K通道：高级植物生理学植物钾营养分子生理课件（1）SV（slow-activated vacuolar）通道 它对阳离子无选择性，允许K K进入液泡；（2）是VK(vacuolar K K )通道 它对K K具有高度的选择性，并且是电势依赖型的通道。VK通道能引起K K由液泡内向胞质中释放；（3）FV（fast-activated vacuolar）通道 与SV通道类似，对阳离子无选择性，主要引起阳离子从液泡向胞质中释放，并提高胞质部分的渗透压。这些通道使得胞内部分成为一个整体，直接对外部刺激反应。高级植物生理学植物钾营养分子生理课件综上所述， K K通道在高等植物中参与大量的生理反应过程。其中， K K in通道的功能可概括为：1）在保卫细胞及不同类型植物细胞的膨胀、运动和生长过程中介导的K K的吸收。2）通过在根细胞上形成一种低亲和性的吸收途径进行K K的营养吸收和运输。3）将阳离子从木质部释放到共质体中。4）进行跨膜电势的调整，如阻止膜的过度超极化。高级植物生理学植物钾营养分子生理课件K Kout通道的功能可概括为：1）进行跨膜电势的调整，如阻止膜的过度去极化。2）释放溶质行使生理功能，如造成气孔的关闭、组织运动和渗透压的调整等。3）阳离子载入木质部。高级植物生理学植物钾营养分子生理课件6.3 6.3 植物植物K K营养的高亲和吸收特性营养的高亲和吸收特性一、 K KH H的协同完成的协同完成K K的运输的运输植物细胞通常处于低K K的环境条件下（在mol/L范围内），在此条件下植物细胞质膜依靠高亲和K K转运系统吸收外界环境中的K K。高亲和K K转运系统主要由高亲和K K转运蛋白组成。高级植物生理学植物钾营养分子生理课件二、二、K KNaNa共转体作用影响共转体作用影响K K的吸收的吸收Rubio（1995）研究HKT1对K吸收的分子机制指出，K的吸收也是在KNa共转体作用下进行的，HKT1有两个离子结合位点，一个是K K结合位点，一个是Na结合位点。HKT1对K K是高亲和吸收（Km为3mol/L），对于Na是低亲和吸收（Km为175mol/L），当Na浓度过高时会抑制K K的吸收，即Na与K K竞争与通道蛋白K K结合位点。这表明HTK1是一个对碱性阳离子非选择性吸收的双向转运蛋白。因此，在高盐浓度下，植物会受到钠盐的毒害。高级植物生理学植物钾营养分子生理课件6.4模式真核生物酵母的K转运的研究高级植物生理学植物钾营养分子生理课件一、 酵母酵母K K吸收转运功能缺失突变体的分离鉴定吸收转运功能缺失突变体的分离鉴定1K吸收转运机制：低亲和K吸收转运（Km为2mmol/L）。细胞在2mmol/L K浓度范围内生长K吸收转运体进行，最大吸收速率为7nmol/(mg.min)。高亲和K吸收转运（Km为24mol/L）,在 K缺乏条件下K吸收依赖高亲和转运，最大吸收速率为34nmol/(mg.min)（Rodriguez et al.1984；Anderson et al.1995）。高级植物生理学植物钾营养分子生理课件2 功能突变体的分离及鉴定：Ramos等（1985）用EMS（ethyl methanesulfonate）处理酵母细胞株系XT3000.3A（MAT, ade2-1）, 筛选高亲和K吸收转运体基因缺失突变体（能在100mmol/LK介质中生长，不能在1mmol/LK中生长的细胞）。由此筛选到的一个突变体记为PC-1。高级植物生理学植物钾营养分子生理课件在精氨酸磷酸盐培养介质中，两者生长达最大速度一半时，需K浓度相差两个数量级，野生型及突变体的需K量分别为2mol/L及3mmol/L。当野生型及突变体保持相同的生长率时，尽管需要的生长介质中K的浓度不同，但细胞内K的含量相似。随着胞外K的浓度降低，细胞的生长速率降低，细胞内K的含量也降低。 高级植物生理学植物钾营养分子生理课件二、酵母高亲和二、酵母高亲和K K吸收转运基因吸收转运基因trkitrki的的分离鉴定分离鉴定酵母细胞内外K K浓度差异可达1000倍，如酵母细胞在5mol/L K的介质中生长，细胞内K的水平可达到近150 nmol/L（Bost 1981）。这种现象说明酵母细胞质膜上存在着产生和维持K浓度梯度的蛋白。已发现在酵母细胞质膜上存在质子泵 (Serrno 1984)，至少一类K通道和负责K吸收的转运系统。他们之间的关系需要进一步鉴定，但有证据表明它们在功能上是相互独立的。在K胁迫下，通过体外得到驱动质子跨膜和ATP-ADP交换的质子泵H+-ATPase；鉴定到酵母K高亲和转运体基因trkl. 高级植物生理学植物钾营养分子生理课件酵母K吸收转运功能缺失的突变体不能在低K的介质中（1 mmol/L）生长。野生型细胞达最大生长率需介质K浓度小于1 mmol/L，突变体trk1-1达最大生长速率需介质K浓度为510mmol/L。 用野生型酵母基因组克隆（构建于穿梭质粒YCp50）转化突变体，凡能使突变体恢复在低K介质中生长的克隆，便是包含有高亲和K吸收转运体基因trk1的克隆-（功能互补）。高级植物生理学植物钾营养分子生理课件含trk1基因的4.2kb碱基序列分析表明，trk1基因阅读框有3705bp。编码1235个氨基酸的多肽，分子质时141kDa。该蛋白共包含有12个由2022个疏水氨基酸组成的跨膜结构区，N末端的40个氨基酸也组成一个疏水性结构， 但似乎不组成跨膜结构。TRK1蛋白序列10441058的氨基酸序列：NNNNNNNRKKKKKKK和第15001545的氨基酸序列：DMDDDDDDDDNDGD形成了trk1表达蛋白的两个高度带电荷区域，可能形成对电压敏感区。没有发现TRK1蛋白氨基酸序列与任何其他蛋白有大范围的同源序列，但是与一些小而有重要意义的蛋白氨基酸序列同源。高级植物生理学植物钾营养分子生理课件TRK1与加利福尼亚鱼雷（torpedo californica）的乙酰胆碱受体亚基的氨基酸序列，大肠肝菌kdpC基因编码的K转运ATPase酶的氨基酸序列有部分同源性。在乙酰胆碱受体亚基的20个氨基酸序列中有7个氨基酸组分与TRK1同源，这7个同源氨基酸包括不常见的色氨酸和两个相邻的组氨酸残基。大肠杆菌K转运ATPase的22个氨基酸序列中也有7个氨基酸与TRK1同源。这两种蛋白都涉及到阳离子的转运阳离子的转运。高级植物生理学植物钾营养分子生理课件TRK1与它们有同源性具有非常重要的意义。TRK1与其他许多原核或真核生物的核苷酸结合蛋白具有同源性，如TRK1的第735739氨基酸GSGKT与其他核苷酸结合蛋白具有45个相同氨基酸残基。这一结构中的Gly是非常保守的，在所有比较的序列中，序列GXXGXGKT除UvrD（大肠杆菌的一种蛋白）和EfG（大肠杆菌的一种蛋白）外，各蛋白间高度保守。高级植物生理学植物钾营养分子生理课件氨基酸亲和性作图分析（hydropathy plot）表明TRK1有12个疏水片段，可形成12个跨膜结构。位于S3和S4之间有一段650个氨基酸长度的亲水区。虽然此部分含有80的TRK1蛋白甲基化位点，到目前为止还没有实验方法证明该亲水区是胞内的还是胞外的。其他蛋白，如细菌ATPase和乙酰胆碱受体的650个氨基酸长度的亲水区通常认为是胞内的。根据TRK1的氨基酸序列及其亲水性作图分析，推测TRK1的蛋白结构模型。高级植物生理学植物钾营养分子生理课件TRK2是基因组分析出的确TRK1同源基因，突出物可能是起源于同一祖先或是由于基因重复造成的。TRK1与TRK2两者在结构上存在以下差异：高级植物生理学植物钾营养分子生理课件1)TRK11)TRK1的的S3S3与与S4S4之间有之间有650650个亲水氨基酸，而个亲水氨基酸，而TRK2TRK2减少为减少为334334个氨基酸，而且在这一区域个氨基酸，而且在这一区域两者的氨基酸序列几乎不相关。两者的氨基酸序列几乎不相关。2)TRK12)TRK1从从10401040氨基酸位开始有氨基酸位开始有2727个亲水氨基个亲水氨基酸，而酸，而TRK2TRK2却减少为却减少为7 7个。个。3)TRK23)TRK2比比TRK1TRK1的羧基端少的羧基端少1313个氨基酸。个氨基酸。高级植物生理学植物钾营养分子生理课件4)TRK14)TRK1中位于中位于S3S3和和S4S4之间的一个假设的核苷之间的一个假设的核苷酸结合区酸结合区GSGKTGSGKT，TRK2TRK2缺失与缺失与TRK1TRK1完全不同。完全不同。5)TRK15)TRK1的的1414个糖基化位点在个糖基化位点在TRK2TRK2中只有两个中只有两个（606606801801）。）。6)TRK16)TRK1的的1010个半胱氨酸，在个半胱氨酸，在TRK2TRK2仅有仅有4 4个（分个（分别位于第别位于第463463，584584，760760，762762个氨基酸位个氨基酸位置）。这表明置）。这表明TRK1TRK1与与TRK2TRK2虽是非常相似的虽是非常相似的K K转运蛋白，但结构上的细微差异，决定转运蛋白，但结构上的细微差异，决定了其功能上的不同。了其功能上的不同。高级植物生理学植物钾营养分子生理课件通过K吸收缺陷型酵母细胞的功能互补法（functional complemention），从拟南芥中克隆出两类不同的K通道cDNA，分别被命名为akt1和kat1(Anderson et al.1992；Sentenac et al.1992)。根据这两个基因编码的蛋白氨基酸序列及蛋白结构上的一些特征，人们推测AKT1和KAT1是“Shaker”超家族（“Shaker” superfamily）的成员。高级植物生理学植物钾营养分子生理课件对AKT1和KAT1的测序结果表明，它们有6或7个跨膜结构域。在第5和第6个跨结构域处有一个P-区域，它被用来组成离子通道的通道孔，其上还带有离子通透所需的结合位点。S跨膜区上有一些碱性的氨基酸残基，它们以每隔两个氨基酸残基位置的规律进行排布，由于这些氨基酸残基上所带的正电荷形成电压传感器（voltage sensor），它们是通道对跨膜电势的变化进行反应所必需的结构。KAT1及AKT1与动物细胞上的去极化激活的K out通道结构类似，但通过KAT1和AKT1在爪蟾卵母细胞（Schachtman et al.1992）和酵母细胞中的（Bertl et al.1994）表达研究，及细胞电压钳位试验研究，发现这两个通道蛋白均为K in通道。高级植物生理学植物钾营养分子生理课件9.39.3高等植物高等植物K K吸收转运基因及表达吸收转运基因及表达高等植物K吸收转运也有高亲和与低亲和两种系统。目前已从拟南芥中克隆Kin通道（Cao et al.1995,Muller et al.1995）与Kout通道基因(Czempinski et al.1997)；从马铃薯中克隆了Kin通道基因(Ketchum and Slayman 1996)。高级植物生理学植物钾营养分子生理课件拟南芥的Kout通道KCO1已在昆虫细胞中得到表达(Czempinski et al.1997) ，这种通道对细胞中游离Ca浓度具有很大的依赖性，属于一类新的通道，被称为“两孔”通道(“two-pore ”channel)的成员(Ketchum et al.1995,Kochian 1993)。从小麦根尖已分离到K高亲和吸收转运体基因hkt1。高级植物生理学植物钾营养分子生理课件一、一、 拟南芥拟南芥K Kinin通道基因通道基因KAT1KAT1用拟南芥cDNA文库转化酵母双缺失突变体 (trk1trk2) ，发现了使突变体恢复在有限的K介质中生长的克隆KAT1（Anderson et al.1992）。KAT1阅读框有2031个核苷酸，编码677个氨基酸，分子质量78kDa。水合性作图分析的（hydropathy plot）推测该蛋白可能有7个跨膜结构，其中有6个结构成串排列在多肽的N端，这一结构是所有电压敏感Shaker家族K通道的结构特征。高级植物生理学植物钾营养分子生理课件比较KAT1与Shaker族的K通道的氨基酸序列，发现其同源性低于20，但6个跨膜区同源性较高。特别是在高度保守区具有相同的氨基酸。如电压敏感区（S4）及形成通道孔的区域（H5）。S4区位于第三（S3）和第五（S5）跨膜区之间。其序列中每隔34个氨基酸存在一个疏水性的赖氨酸或精氨酸等碱性氨基酸。高级植物生理学植物钾营养分子生理课件KAT1KAT1的的162162180180位的氨基酸序列组成位的氨基酸序列组成S4S4区，区，与与ShakerShaker族的族的K K通道的相应区段氨基酸序通道的相应区段氨基酸序列相比，变化主要在第列相比，变化主要在第168168和和176176位氨基酸位氨基酸分别为丝氨酸。位于分别为丝氨酸。位于S5S5和和S6S6区之间的区之间的H5H5区，区，与其他动物与其他动物K K通道同源性很高，尤其是第通道同源性很高，尤其是第259259和和260260个氨基酸为苏氨酸。苏氨酸被认个氨基酸为苏氨酸。苏氨酸被认为在离子选择吸收方面起重要作用为在离子选择吸收方面起重要作用（Yellen et al.1991;Yool et al Yellen et al.1991;Yool et al .1991.1991）。）。高级植物生理学植物钾营养分子生理课件KAT1通道对一价阳离子的传导率离子K+78Rb+Na+Cs+Li+NH4+K+传导率的%100281378911633012测定的卵母细胞数目25544311高级植物生理学植物钾营养分子生理课件KAT1转化到酵母细胞的表达特性出表明，KAT1是一种内流通道蛋白。对酵母野生型株系Y588、双缺失突变体trk1trk2 CY152CY162、pRS316载体转化的双缺失突变体CY162/pRS316及KAT1转化的双缺失突变体CY162p KAT1四类细胞进行全细胞模式电压钳位试验，发现双缺失株系突变体在任何电压条件下没有内流电流发生，野生型细胞有较小内流电流发生（在-200mV时仅为-50pA），而转化细胞发现有一个大的缓慢激活的内流电流产生，pRS316载体转化的双缺失突变体CY162pRS31没有内流电流发生。将KAT1转化体及载体转化体的电压钳位试验结果绘制电流电压曲线，同时将细胞外150 mmol/LKCl取代成10 mmol/LKCl及200 mmol/L山梨醇，发现有kat1的细胞内流电流的大小依赖于细胞外的K浓度。高级植物生理学植物钾营养分子生理课件用NH4或Na取代细胞外的K,研究KAT1转化的酵母细胞中KAT1通道的阳离子选择性吸收发现，150 mmol/L NH4或Na取代介质中150 mmol/LKCl后，内流电流分别下降15和5，KNH4， KNa渗透率分别为8和20左右。高级植物生理学植物钾营养分子生理课件3将KAT15启动子与GUS基因融合（KAT1：GUS）转移到拟南芥中。在所有11个转基因植株中，GUS基因表达活性最高的是下胚轴、子叶及712天幼苗的保卫细胞中，在只转入载体的植物中，没有发现GUS表达活性（Nakamura et al.1995）。高级植物生理学植物钾营养分子生理课件在11个转基因植物系中有2个系。发现GUS在根的维管组织有表达，但在根中的表达比在气孔部位的表达弱，这可能是气孔过多的GUS表达物转运到根，并在根中积累，或者GUS在根中有弱表达。KAT1主要在植物的保卫细胞中表达可能与KAT1通道与气孔的运动有关。高级植物生理学植物钾营养分子生理课件三、拟南芥三、拟南芥K通道基因通道基因AKT2AKT2的结构及表达的结构及表达将AKT1 cDNA克隆AccI酶切的1.6kb片段,及其KAT1的PCR片段(这些片段包括了6个跨膜片段)进行32P dATP标记，在低强度条件下，筛选拟南芥的cDNA文库，从5104噬菌体克隆中，筛选到3个阳性克隆。序列分析发现由两个分别为KAT1和AKT1，另外有一个新克隆，命名为AKT2。AKT2基因的发现，证明了植物K+通道像动物K通道一样，也是以基因家族存在的,是植物产生不同K+通道的机制，也反映了植物的多种适应性。高级植物生理学植物钾营养分子生理课件Cao等人(1995)研究拟南芥AKT2的cDNA序列及其氨基酸序列发现，AKT2基因编码由802个氨基酸残基组成的蛋白质，分子质量为91.3kDa，亲水性分析推测AKT2多肽序列有6个可能的跨膜结构，分别为S1，S2，S3，S4，S5，S6和一个H5区，包含有6个糖基化位点和15个磷酸化位点。氨基酸的糖基化位点和磷酸化位点是跨膜蛋白的特有特征。AKT2蛋白的第415至498个氨基酸其他许多蛋白的环核苷酸结合区域同源，如与蝗虫EAG通道，环核苷酸门控通道及大肠杆菌降解物基因激活通道具有同源性。高级植物生理学植物钾营养分子生理课件在AKT2蛋白的环腺苷酸结合区域的下游有5个3233个氨基酸的重复序列，每一重复都有锚蛋白重复的特点，因为在锚蛋白及包含有锚蛋白重复的蛋白中，都有一个以33个氨基酸为一个单元的结构多次重复出现。锚蛋白重复结构可能通过与细胞骨架因素结合或与其他蛋白结合来决定通道蛋白的位置或通道蛋白的功能。在动物的外流K+通道中存在的电压敏感区S4及K+选择性吸收的通道孔形成区H5，在AKT2中都存在。高级植物生理学植物钾营养分子生理课件五、五、 AKT2AKT2在酵母和卵母细胞中的表达研究在酵母和卵母细胞中的表达研究将AKT2 cDNA克隆到酵母表达载体中，酵母表达载体含有Gal-诱导启动子，将该克隆转化到trk1:akt2双缺失的酵母突变体中，没有转化的突变细胞只能在高钾介质中（100mmol/L）生长，但不能在低介质中（mmol/L）生长，转化体最初在高K+介质中（100mmol/L）选择，然后转到含al的低K+介质中（mmol/L），然而AKT2转化体即使在AKT2翻译条件下也不能完成K+的吸收。表明AKT2不能在酵母中适当表达，不能恢复K+的吸收。将AKT2 cDNA克隆到pBluescript KS的爪蟾卵母细胞表达载体，体外翻译AKT2 mRNA注射入爪蟾卵母细胞，并不能诱导任何依赖膜脱极化及超极化的电流产生。高级植物生理学植物钾营养分子生理课件五、五、 马铃薯保卫细胞内向整流马铃薯保卫细胞内向整流K+通道基因通道基因kst1kst1的结构与表达的结构与表达提取马铃薯叶片表皮细胞RNA，构建其cDNA文库，以KAT1的cDNA片段为探针，筛选该cDNA文库，从文库中分离到几个阳性克隆。其中一个克隆中插入的DNA片段长2381bp，可编码689个氨基酸的多肽，结构与haker家族的K+通道类似，称为kst1。kst1与AKT1，AKT2及KAT1类似，编码的蛋白也有S1，S2，S3，S4，S5，H5和S6区。KST蛋白KAT1之间的相似性达81%，相同氨基酸达63%。与KAT1的相似性程度较低。高级植物生理学植物钾营养分子生理课件另外与老鼠SHABI，果蝇的Shaker及大肠杆菌KCH的同源性分别为44%，43%和51%，所有这些蛋白都有个跨膜结构域（S1S6）和一个疏水片段H5，形成通道孔。由此推测Kst1是马铃薯细胞膜上的一种K+通道。 高级植物生理学植物钾营养分子生理课件以Kst1为探针，与马铃薯的绿花蕾，展开的花、死叶、光合叶、表皮、茎节、块茎和根的各部位RNA进行Northern杂交分析，发现KST1主要在花和叶部位表达，而在茎节、块茎、根中无表达。通过原位杂交试验发现Kst1大量存在于保卫细胞部位。证明Kst1主要存在于气孔的保卫细胞，参与气孔的运动。高级植物生理学植物钾营养分子生理课件 人们最初对K+通道的研究认为，K+通道是一个同源四聚体的结构，由个亚基组成。但后来的研究发现，动物K+通道家族中某些成员的结构中存在着亚基。现在认为，几乎所有的或许多动物的电压门控K+通道的结构是异源多聚体组成，包括个亚基和个亚基。每一个多肽亚基与亚基结合，延伸到细胞膜内。这种多肽可能是作为全酶的调节亚基。研究认为，包含有亚基及亚基的K+通道在爪蟾卵母细胞中表达时，比只有亚基的K+通道产生的电流大。五、五、 植物植物K K+通道通道亚基亚基高级植物生理学植物钾营养分子生理课件植物通道基因akt1，akt2，kat1，kst1与动物Shaker家族K+通道的亚基结构相似。编码蛋白分子质量大约80kDa，有个跨膜结构区域，形成一个电压敏感的、对离子有选择性的通道。因此认为，植物K+通道可能是四个同源的亚基装配在细胞膜内组成一个通道孔，这个通道孔正好处于与细胞膜垂直的轴心位置。最近的研究表明，植物细胞K+通道也存在亚基结构。高级植物生理学植物钾营养分子生理课件八、水稻八、水稻K+K+通道通道亚基亚基Kab1Kab1的基因克隆的基因克隆及表达鉴定及表达鉴定利用与拟南芥利用与拟南芥K K+ +通道通道亚基亚基Kab1Kab1的克隆同样的策略，的克隆同样的策略，克隆到水稻克隆到水稻K+K+通道通道亚基亚基kob1kob1基因。基因全长基因。基因全长1293bp1293bp，阅读框架，阅读框架981bp981bp，推测产生，推测产生326326个氨基酸个氨基酸组成的组成的36.3kDa36.3kDa的多肽，与的多肽，与K Kabab1 1具有具有72%72%的同源性，的同源性，与与bovKv2bovKv2及及ratKv1ratKv1同源性达同源性达45%45%。在。在kob1kob1氨基氨基酸序列的酸序列的79-11579-115，与其他多肽没有同源性，而在，与其他多肽没有同源性，而在序列的其他区域具有高度的同源性。序列的其他区域具有高度的同源性。k kabab1 1有两个有两个糖基化位点及糖基化位点及7 7个可能的磷酸化位点。个可能的磷酸化位点。高级植物生理学植物钾营养分子生理课件由于水稻K+通道的亚基还没有发现，所以目前还不能研究水稻K+通道亚基与亚基间的关系。但借助拟南芥KAT1的研究，证实kabab1是植物K+通道的亚基。高级植物生理学植物钾营养分子生理课件八、小麦高亲和八、小麦高亲和K+K+吸收转运体基因吸收转运体基因hktshkts结构结构与表达与表达在缺K+条件下，分离小麦根尖cDNA文库，以文库克隆转化K+吸收功能缺失的酵母突变体，筛选到一个cDNA克隆hkt1，能与K+吸收功能缺失的酵母突变体互补。对hkt1转化的酵母突变体细胞的Rb+（K+的同系物）吸收能力分析发现，没有hkt1转化的酵母细胞，只能检测到微弱的Rb+吸收，而hkt1互补的细胞吸收能力较高。高级植物生理学植物钾营养分子生理课件研究证明Hkt1对K+与Na+有高度选择性。K+高亲和转运体Hkt1是Na+- K+共转运体。在Na+毒害水平（mmol/L），Hkt1介导低亲和Na+吸收，并阻止K+吸收，从而导致Na+中毒。高级植物生理学植物钾营养分子生理课件hkt1与小麦根系部位进行原位杂交发现，hkt1hkt1主要在根毛部位及叶的导管周围表达主要在根毛部位及叶的导管周围表达，因为根毛从土壤中吸收K+的过程中具有重要的作用。根毛吸收K+转运到导管运至地上部，通过导管周围组织将K+转到叶片细胞，由此hkt1在K+从根转运到叶片中起着重要作用。高级植物生理学植物钾营养分子生理课件