1-1 DNADNA重组技术的重组技术的基本工具基本工具和和基本操作基本操作程序程序专题专题1 基因工程基因工程一一 基因工程的基本内容基因工程的基本内容主要内容主要内容（一）基因工程的概念（一）基因工程的概念（二）基因工程的基本工具（二）基因工程的基本工具（三）基因工程的基本操作程序（三）基因工程的基本操作程序（四）基因工程的应用（四）基因工程的应用基因工程的概念基因工程的概念 基因工程又叫基因工程又叫基因拼接技术基因拼接技术或或DNA重重组技术组技术。该技术是在。该技术是在生物体外生物体外，通过对，通过对DNA分子进行人工分子进行人工“剪切剪切”和和“拼接拼接”，对生物的基因进行对生物的基因进行改造改造和和重新组合重新组合，然后，然后导入受体细胞导入受体细胞内进行无性繁殖，使重组基内进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内因在受体细胞内表达表达，产生出人类所需要，产生出人类所需要的的基因产物基因产物。复习复习基因工程基因工程培育抗虫棉的培育抗虫棉的简要过程简要过程：普通棉花普通棉花( (无抗虫特性无抗虫特性) )苏云金芽孢杆菌苏云金芽孢杆菌提取提取提取提取抗虫基因抗虫基因与与与与运载体运载体运载体运载体DNADNA拼接拼接拼接拼接导入导入导入导入棉花细胞棉花细胞( (含含抗虫基因抗虫基因) )棉花植株棉花植株( (有有抗虫特性抗虫特性) )复习复习基因工程的关键步骤：基因工程的关键步骤：关键步骤一：关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内细胞内提取出来提取出来关键步骤二：关键步骤二：抗虫基因抗虫基因与运载体与运载体DNA连接连接关键步骤三：关键步骤三：抗虫基因抗虫基因导入受体导入受体(棉花棉花)细胞细胞复习复习解决基因工程关键步骤需要的工具解决基因工程关键步骤需要的工具关键步骤一的工具：关键步骤一的工具：关键步骤二的工具：关键步骤二的工具：关键步骤三的工具：关键步骤三的工具：限制性内切酶限制性内切酶DNA连接酶连接酶运载体运载体复习复习基因的剪刀基因的剪刀限制性内切酶（简称限制酶）限制性内切酶（简称限制酶） 限制酶是在生物体限制酶是在生物体( (主要是主要是微生物微生物) )内的一种酶，内的一种酶，能将外来的能将外来的DNA切断切断，由于这种切割作用是在，由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性内切酶。分子内部进行的，故名限制性内切酶。 特点：特异性。特点：特异性。 即即一种一种限制酶限制酶只能识别一种只能识别一种特定的特定的核苷酸序核苷酸序列列，并且能在，并且能在特定的切点特定的切点上切割上切割DNA分子。分子。复习复习识别序列大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成。也有少数限制酶识别序列由4、5、或8个核苷酸组成。迄今为止，有迄今为止，有迄今为止，有迄今为止，有300300多种多种多种多种微生物中分离出微生物中分离出微生物中分离出微生物中分离出40004000种限制酶种限制酶种限制酶种限制酶 大肠杆菌大肠杆菌(E.coli)的一种限制酶的一种限制酶能识别能识别GAATTC序列序列，并在，并在G和和A之间切开。之间切开。限制酶限制酶限制限制限制限制酶酶酶酶 被限制酶切开的被限制酶切开的DNA两条单链的切口，两条单链的切口，带有几个带有几个伸出的核苷酸伸出的核苷酸，他们之间正好，他们之间正好互互补配对补配对，这样的切口叫，这样的切口叫黏性末端黏性末端。平末端平末端要想获得某个特定性状的基因必须要用限制要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？酶切几个切口？可产生几个黏性末端？提问提问要切两个切口，产生四个黏性末端。要切两个切口，产生四个黏性末端。如果把两种来源不同的如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶用同一种限制酶来切割，会怎样呢？来切割，会怎样呢？ 会产生会产生相同的黏性末端相同的黏性末端，然后让两者的，然后让两者的黏性末端黏性末端黏合黏合起来，就似乎可以合成重组的起来，就似乎可以合成重组的DNA分子了。分子了。2、基因的针线、基因的针线DNA连接酶连接酶 DNA连接酶连接酶可把黏性末端可把黏性末端之间的缝之间的缝隙隙“缝合缝合”起来，即把梯子两边扶手的起来，即把梯子两边扶手的断口连接起来，这样一个重组的断口连接起来，这样一个重组的DNA分分子就形成了。子就形成了。E.coliDNA连接酶从大肠杆菌中分离得到的。只能用于粘性末端的连接T4DNA连接酶从T4噬菌体中分离得到的。既能用于粘性末端的连接，又能用于平末端的连接，但是平末端的连接效率低。为什么要用运载体？1、直接将目的基因连接到受体细胞的、直接将目的基因连接到受体细胞的DNA上不能表达。上不能表达。2、只有利用某种能够侵染受体细胞，并且、只有利用某种能够侵染受体细胞，并且在受体细胞中能够复制和表达的载体来用在受体细胞中能够复制和表达的载体来用于表达。于表达。作为运载体必须具备哪些条件作为运载体必须具备哪些条件1）能够在宿主细胞中）能够在宿主细胞中复制复制并稳定地并稳定地保存保存。2）具多个）具多个限制酶切点限制酶切点，以，以便与外源基因连接便与外源基因连接。3）具有某些）具有某些标记基因标记基因，便于进行，便于进行筛选筛选。 如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等。基因等。常用的运载体主要有两类：常用的运载体主要有两类：1）细菌细胞质的）细菌细胞质的质粒质粒2）噬菌体噬菌体或某些或某些动植物病毒动植物病毒质粒：质粒： 质粒是染色体外能够进行质粒是染色体外能够进行自主复制自主复制的的遗传单位，包括真核生物的细胞器和细菌遗传单位，包括真核生物的细胞器和细菌细胞中核区外的细胞中核区外的DNA分子。现在习惯上用分子。现在习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中核核以外的以外的DNA分子分子。 质粒质粒是基因工程是基因工程最常用最常用的的运载体运载体。 绝大多数细菌质粒都是绝大多数细菌质粒都是闭合环状闭合环状DNA分子分子。有的一个细菌中有一个，有的一个。有的一个细菌中有一个，有的一个细菌中有多个。细菌中有多个。大肠杆菌的质粒：大肠杆菌的质粒： 最常用的质粒最常用的质粒是是大大肠杆菌的质粒肠杆菌的质粒，其中常，其中常含有含有抗药基因抗药基因，如四环，如四环素的标记基因。质粒的素的标记基因。质粒的存在与否对宿主细胞生存在与否对宿主细胞生存没有决定性作用存没有决定性作用，但，但复制只能在宿主细胞内复制只能在宿主细胞内成成。原核细胞的基因结构原核细胞的基因结构( (补充内容）补充内容）非非编码区编码区非非编码区编码区编码区编码区编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 与与RNARNA聚合酶结合位点聚合酶结合位点启动子启动子终止子终止子不编码蛋白质。不编码蛋白质。：编码蛋白质：编码蛋白质 , ,连续不间断连续不间断编码区编码区非编码区非编码区原核原核细胞细胞的的 基因基因结构结构调控遗传信息表达调控遗传信息表达, ,上上 游有启动子，下游有终止子游有启动子，下游有终止子真核细胞的基因结构（补充内容）真核细胞的基因结构（补充内容）编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区与与RNARNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点内含子内含子 外显子外显子 启动子启动子终止子终止子编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 真核真核细胞细胞的的 基因基因结构结构编码区编码区非编码区非编码区外显外显子：能编码蛋白质的序列子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列：有调控作用有调控作用, ,上游有启动子，下上游有启动子，下游有终止子游有终止子非非编码序列：编码序列： 包括非编码区和内含子包括非编码区和内含子原核细胞原核细胞真核细胞真核细胞不同点不同点编码区是编码区是_的的编码区是间隔的、编码区是间隔的、_的的相同点相同点都由都由能够编码蛋白质的能够编码蛋白质的_和具和具有调控作用的有调控作用的_区组成的区组成的原核细胞与真核细胞的基因结构比较原核细胞与真核细胞的基因结构比较连续连续不连续不连续编码区编码区非编码非编码四个基本步骤：四个基本步骤：三、基因工程的基本操作程序三、基因工程的基本操作程序1）提取提取目的基因目的基因2）目的基因）目的基因与运载体结合与运载体结合3）将目的基因）将目的基因导入导入受体细胞受体细胞4）目的基因的）目的基因的检测检测和和表达表达目的基因目的基因 目的基因是人们所目的基因是人们所需要转移需要转移或或改造改造的基因。的基因。 如苏云金芽孢杆菌如苏云金芽孢杆菌的的抗虫基因抗虫基因，还有植物，还有植物的的抗病抗病（抗病毒抗病毒、抗细抗细菌菌）基因基因、种子、种子贮藏蛋贮藏蛋白的基因白的基因，以及人的，以及人的胰胰岛素基因岛素基因、干扰素基因干扰素基因等。等。供体生物细胞供体生物细胞取出取出DNADNA用限制酶剪用限制酶剪去多余部分去多余部分目的基因目的基因限制酶限制酶1 1、目的基因的获取、目的基因的获取1 1目的基因主要是指目的基因主要是指_编码蛋白质的结构基因编码蛋白质的结构基因请举出三个以上的例子请举出三个以上的例子2 2获取目的基因的常用方法获取目的基因的常用方法（1 1）从基因文库中获取）从基因文库中获取（2 2）利用）利用PCRPCR技术扩增技术扩增（3 3）人工合成）人工合成概念：基因文库概念：基因文库 （gene library）基因组文库基因组文库部分基因文库部分基因文库（如（如cDNA文库）文库） 将含有某种生物不同基因的许多将含有某种生物不同基因的许多DNA片段片段,导入受体菌的群体中储存导入受体菌的群体中储存,各个受体各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因菌分别含有这种生物的不同的基因,称为基称为基因文库因文库(gene library)基因组文库基因组文库: 基因文库中包含了一种生物所有的基基因文库中包含了一种生物所有的基因因,这种基因文库叫做基因组文库这种基因文库叫做基因组文库.部分基因文库部分基因文库: 基因文库中包含了一种生物的一部分基因文库中包含了一种生物的一部分基因基因,这种基因文库叫做部分基因文库这种基因文库叫做部分基因文库.基因组文基因组文库与部分库与部分基因文库基因文库的关系的关系cDNAcDNA文库的构建文库的构建mRNA反转录cDNA(互补DNA） DNA聚合酶聚合酶双链DNA反转录法：反转录法：基因重组基因重组反转录酶反转录酶mRNAmRNAcDNAcDNA基因组基因组DNADNA文库文库cDNAcDNA文库文库基因组基因组DNADNA文库与文库与cDNAcDNA文库的比较文库的比较如何从基因文库中得到所需要的基因？如何从基因文库中得到所需要的基因？依据：目的基因的有关信息。依据：目的基因的有关信息。如：根据基因的核苷酸序列如：根据基因的核苷酸序列 基因的功能基因在染色体上的位置基因的功能基因在染色体上的位置 基因的转录产物基因的转录产物mRNA 基因翻译产物蛋白质基因翻译产物蛋白质 等特性。等特性。利用利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因PCR聚合酶链式反应聚合酶链式反应 是一项生物是一项生物体外复制体外复制特定特定DNA片片段的核酸合成段的核酸合成技术技术。通过此技术，可。通过此技术，可获取大量的目的基因。获取大量的目的基因。DNA序列自动测序仪：序列自动测序仪：PCR技术技术： 对提取出来的对提取出来的基因进行核苷酸基因进行核苷酸序列分析。序列分析。 使目的基因的片使目的基因的片段在短时间内成百段在短时间内成百万倍地扩增。万倍地扩增。v 人工合成人工合成根据已知的氨基酸序列合成根据已知的氨基酸序列合成DNA DNA 蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列mRNAmRNA的核苷酸序列的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测推测推测目的基因目的基因化学合成化学合成3 3、基因表达载体基因表达载体（重组质粒）（重组质粒）的构建的构建（1 1）用一定的）用一定的_切切割质粒，使其出现一个切口，割质粒，使其出现一个切口，露出露出_。（2 2）用）用_切断目切断目 的基因，使其产生的基因，使其产生_ _ _。（3 3）将切下的目的基因片段插入质粒的）将切下的目的基因片段插入质粒的_处，再加入适量处，再加入适量_，形成了一个重组，形成了一个重组 DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）限制酶限制酶黏性末端黏性末端同一种限制酶同一种限制酶的黏性末端的黏性末端切口切口DNADNA连接酶连接酶相同相同1 1过程过程: :2 2基因表达载体的基因表达载体的组成：组成：它们有什么作用？它们有什么作用？a、目的基因、目的基因b、启动子、启动子c、终止子、终止子d、标记基因、标记基因位于基因的首端位于基因的首端,是是mRNA结合位点结合位点位于基因的末端位于基因的末端,终终止转录止转录检测目的基因是否导入受体细胞检测目的基因是否导入受体细胞条件条件条件条件步骤二步骤二：目的基因与运载体重组目的基因与运载体重组 1）用一定的）用一定的限制酶切割质粒限制酶切割质粒，使其出现，使其出现一个切口一个切口，露出，露出黏性末端黏性末端。 2）用）用同一种同一种限制酶限制酶切断目的基因切断目的基因，使其，使其产生产生相同相同的的黏性末端黏性末端。 3）将切下的目的基因片段）将切下的目的基因片段插入质粒插入质粒的切的切口处，再加入适量口处，再加入适量DNA连接酶连接酶，形成了一，形成了一个个重组重组DNA分子分子（重组质粒）（重组质粒） 目的基因与运载体的结合过程，实际目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的上是不同来源的基因重组的过程基因重组的过程。质粒质粒目的基因目的基因限制酶处理限制酶处理一个切口一个切口两个黏性末端两个黏性末端两个切口两个切口获得目的基因获得目的基因DNADNA连接酶连接酶表表达达载载体体同一种同一种过程过程: :2、基因表达载体的作用、基因表达载体的作用a、使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代、使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代b、同时使目的基因能表达和发挥作用、同时使目的基因能表达和发挥作用思考：思考：作为基因工程表达载体，只需含有作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？目的基因就可以完成任务吗？为什么？目的基因与运载体结合目的基因与运载体结合常用的受体细胞：常用的受体细胞： 有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。酵母菌和动植物细胞等。将目的基因导入受体细胞的原理将目的基因导入受体细胞的原理借鉴借鉴细菌或病毒侵染细胞细菌或病毒侵染细胞的途径。的途径。步骤三：目的基因导入受体细胞步骤三：目的基因导入受体细胞 1）将细菌用）将细菌用CaCl2处理处理，以，以增大增大细菌细菌细细胞壁的通透性胞壁的通透性。 2）使含有目的基因的）使含有目的基因的重组质粒进入重组质粒进入受体受体细胞。细胞。 3）目的基因在受体细胞内，随其繁殖而）目的基因在受体细胞内，随其繁殖而复制复制，由于细菌，由于细菌繁殖的速度繁殖的速度非常快，在很非常快，在很短的时间内就能获得短的时间内就能获得大量大量的目的基因。的目的基因。1、将目的基因导入植物细胞将目的基因导入植物细胞（1）农杆菌）农杆菌转化法转化法特点特点:能感染能感染双子叶植物双子叶植物和和祼子植物祼子植物,对对单子叶植物无感染能力单子叶植物无感染能力Ti质粒质粒的的TDNA可转移至受体细可转移至受体细胞并整合到其染色体上胞并整合到其染色体上转化过程转化过程:Ti质粒质粒目的基因目的基因构建构建表达表达载体载体导入导入植植物物细细胞胞插入插入植物细胞植物细胞染色染色DNA表达表达新新性性状状转入转入农农杆杆菌菌（2）基因枪法）基因枪法 基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。的基因与其整合并表达的方法。（3）花粉通道法）花粉通道法 植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。因借助花粉管通道进入受体细胞。2、将目的基因导入动物细胞将目的基因导入动物细胞方法方法:显微注射技术显微注射技术操作程序操作程序:提纯含目的基提纯含目的基因表达载体因表达载体取受精卵取受精卵显微注射显微注射移植到子宫移植到子宫受精卵发育受精卵发育新性状动物新性状动物3、将目的基因导入微生物细胞将目的基因导入微生物细胞常用法常用法：Ca2+处理处理常用菌常用菌：大肠杆菌：大肠杆菌微生物作受体细胞原因：微生物作受体细胞原因：繁殖快繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少、多为单细胞、遗传物质相对少过程：过程：Ca2+处理处理大肠杆菌大肠杆菌感受态感受态细胞细胞表达载体表达载体与感受态与感受态细胞混合细胞混合感受态细感受态细胞吸收胞吸收DNA步骤四：步骤四：目的基因的检测和表达目的基因的检测和表达四环素四环素抗性基因抗性基因氨苄青霉氨苄青霉素抗性基因素抗性基因( (四四) )目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定检测检测导入检测：目的基因是否导入受体细胞导入检测：目的基因是否导入受体细胞方法方法 DNADNA分子杂交分子杂交表达检测表达检测转录检测转录检测分子杂交分子杂交翻译检测翻译检测抗原抗体抗原抗体杂交杂交分分子子检检测测法法鉴定鉴定抗虫鉴定抗虫鉴定抗病鉴定抗病鉴定活性鉴定等活性鉴定等个体水平的鉴定个体水平的鉴定 不能，受体细胞必须表现出特定的性状，不能，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了才能说明目的基因完成了表达表达。受体细胞摄入受体细胞摄入DNA分子后就说明目的基因分子后就说明目的基因完成了表达吗？完成了表达吗？若若不能表达，不能表达，要对抗虫基因要对抗虫基因再进行再进行修饰修饰。知识延伸知识延伸DNADNA分子杂交技术分子杂交技术 该方法是根据碱基互补配对原则，把互补的双链该方法是根据碱基互补配对原则，把互补的双链DNA解开，把单股的解开，把单股的DNA小片段用同位素、荧光分子或小片段用同位素、荧光分子或化学发光催化剂等进行标记，之后同被检测的化学发光催化剂等进行标记，之后同被检测的DNA中的中的同源互补序列杂交，从而检出所要查明的同源互补序列杂交，从而检出所要查明的DNA或基因。或基因。返返返返 回回回回DNA附着在膜上附着在膜上硝化纤维素硝化纤维素加探针加探针报告基因（含荧光素分子）报告基因（含荧光素分子）变性变性DNA杂交杂交（如检测（如检测SARS病毒等）病毒等）abcd复习题复习题1）将目的基因导入受体细胞有哪些方法）将目的基因导入受体细胞有哪些方法?(试举例说明试举例说明)2）简述农杆菌转化法）简述农杆菌转化法非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区RNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点外显子外显子内含子内含子终止子终止子基因的结构基因的结构启动子启动子原核原核真核真核1）以下说法正确的是）以下说法正确的是 （ ） A、所所有有的的限限制制酶酶只只能能识识别别一一种种特特定定的的核核苷苷酸序列酸序列 B、质粒是基因工程中唯一的运载体质粒是基因工程中唯一的运载体 C、运运载载体体必必须须具具备备的的条条件件之之一一是是：具具有有多多个限制酶切点，以便与外源基因连接个限制酶切点，以便与外源基因连接 D、基因控制的性状都能在后代表现出来基因控制的性状都能在后代表现出来C练习练习2）不属于质粒被选为基因运载体的理由是）不属于质粒被选为基因运载体的理由是 A、能能复复制制 （ ） B、有、有多个限制酶切点多个限制酶切点 C、具有标记基因具有标记基因 D、它是环状它是环状DNAD练习练习3）有关基因工程的叙述中，错误的是）有关基因工程的叙述中，错误的是（ ） A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B、 限制性内切酶用于目的基因的获得限制性内切酶用于目的基因的获得 C、目的基因须由运载体导入受体细胞目的基因须由运载体导入受体细胞 D、 人工合成目的基因不用限制性内切酶人工合成目的基因不用限制性内切酶A练习练习4）有有关关基基因因工工程程的的叙叙述述正正确确的的是是 （ ） A、限制酶只在获得目的基因时才用限制酶只在获得目的基因时才用 B、重组质粒的形成在细胞内完成重组质粒的形成在细胞内完成 C、质粒都可作为运载体质粒都可作为运载体 D、蛋蛋白白质质的的结结构构可可为为合合成成目目的的基基因因提提供供资料资料D练习练习5）基基因因工工程程是是在在DNA分分子子水水平平上上进进行行设设计计施施工工的的。在在基基因因操操作作的的基基本本步步骤骤中中，不不进进行行碱碱基基互互补补配配对对的的步步骤骤是是 （ ） A、人工合成目的基因人工合成目的基因 B、目的基因与运载体结合目的基因与运载体结合 C、将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞 D、目的基因的检测和表达目的基因的检测和表达C练习练习