利用各种化学物质所具有的发射、吸收或散利用各种化学物质所具有的发射、吸收或散射光谱谱系的特征来确定其性质、结构或含射光谱谱系的特征来确定其性质、结构或含量的技术，称为光谱分析技术。量的技术，称为光谱分析技术。吸收光谱分析法吸收光谱分析法发射光谱分析发射光谱分析散射光谱分析散射光谱分析第二章第二章 光谱分析技术光谱分析技术光是电磁波，可用波长“”表示，电磁波谱是由不同性质的连续波长的光谱所组成，对于生物化学来说，最重要的波长区域是可见光和紫外光。光的波长是二个相邻的波峰之间的距离。光的传播是由相互垂直的电场分量“E”和磁场分量“H”所构成。C/波长 C光速 频率，单位时间通过一个定点的波数。 紫外可见吸收光谱的形成 按照量子力学原理，分子能态按一定的规律跳跃式地变化，物质在入射光的照射下，分子吸收光时，其能量的增加是不连续的，物质只能吸收一定能量的光，吸收光的频率和两个能级间的能量差要符合下列关系：EE2 E1hE1、E2分别表示初能态和终能态的能量，初能态与终能态之间的能量差愈大，则所吸收的光的频率愈高（即波长愈短），反之则所吸收的光的频率愈低（即波长愈长）。由于吸收是不连续的，因此在光的一定部位出现一系列吸收暗带。因为分子转动、振动及电子能级跃迁的能量差别较大，因此，它们的吸收光谱出现在不同的光谱区域。分子转动能级级差小，E0.05电子伏特（ev），分子转动光谱的吸收出现在远红外或微波区。振动能级纵间的差别较大， E0.051.0 ev，振动光谱出现在中红外区。电子能级的级差更大， E120 ev，所以由电子跃迁得到的光谱出现在可见、紫外或波长更短的光谱区。可见光、紫外光吸收光谱，是由于分子中联系较松散的价电子被激发产生跃迁从而吸收光辐射能量形成的，即分子由基态变为激发态，电子由一个低能级的轨道（即成键轨道），吸收了光能量跃迁到高能级轨道（称为反键轨道）。 若逐渐改变照射某物质的入射光的波长，并测定物质对各种波长光的吸收程度（吸光度“A”或光密度“O.D”）或透射程度（透光度“T”），以波长作横坐标，“A”或“T”为纵座标，画出连续的“A”或“T”曲线，即为该物质的吸收光谱曲线。曲线上“A”处称最大吸收峰，它所对应的波长称最大吸收波长，以max表示。曲线上“B”处有一谷，称最小吸收，它所对应的波长，所对应的波长，称最小吸收波长，以min 表示。曲线上在最大吸收峰旁边有一小峰“C”，称肩峰。在吸收曲线的波长最短的一端，曲线上“D”处，吸收相当强，但不成峰形，此处称为末端吸收。max是化合物中电子能级跃迁时吸收的特征波长，不同物质有不同的最大吸收峰，所以它对鉴定化合物极为重要。吸收光谱中，max、min、肩峰以及整个吸收光谱的形状决定于物质的性质，其特征随物质的结构而异，所以是物质定性的依据。测定某物质的紫外吸收光谱的曲线，可与已知标准的紫外光谱图相对照，对照时须注意测定的条件，如溶剂、浓度等。 常用标准的紫处吸收光谱是萨德勒研究实验公司编制的“Sadtler”紫外标准图谱集，到七十年代末为止已收集28585个化合物紫外光谱图，此外还有药物和非极性溶剂紫外光谱图2000多幅。 由于化合物紫外吸收峰较少，而且峰形都很宽，不象红外光谱是许多指纹峰，所以在用紫外吸收光谱进行化合物定性鉴定时，应注意：化合物相同，其紫外光谱应完全相同；但是紫外光谱相同不一定化合物就相同，可能仅是存在某些相同的发色团或基团，因此在鉴定时应与红外光谱相结合。常用的术语 紫外光谱中常用的术语有发色团、助色团、增色效应和减色效应。发色团：发色团：凡是与饱和碳氢化合物连接能引起n*、*、 n* 等电子跃迁的基团称为发色团。例如：CC、CO等发色团。助色团：助色团：助色团是一些具有非共价键的基团（如OH、NH2、SH等）。这些基团在波长200 nm处没有吸收，当它与发色团相连接时，使发色团的吸收带向长波移动，称为红移（或浅色效应），红移的同时吸收带的强度增加。若助色团与发色团相连接，产生 n* 跃迁，使吸收波长向短波移动，称为兰移（或深色效应）。增色效应（增色效应（hyperchromic effect）:核酸变性或降解，使得DNA或RNA溶液对紫外光的吸收明显增加，即 值（吸光系数或称消光系数）显著升高，此现象称为增色效应。此效应是由于碱基之间电子相互作用的改变所致，通常在260nm处测量。减色效应（减色效应（hypochromic effect）:在一定的条件下，变性的核酸又可以复性，此时值又明显减少，回复到原来的核酸分子值较低的水平，即此时DNA或RNA溶液的紫外光吸收显著降低，此现象称为减色效应，此效应也是由于碱基之间电子相互作用的变化所引起的，通常在260nm条件下测量。有色溶液对溶液对溶液对溶液对可见光线有选择性的吸收作用光线有选择性的吸收作用光线有选择性的吸收作用光线有选择性的吸收作用，有些无色溶液，所含物质可以吸收特定波长的紫外线或红外线。不同物质由于其分子结构不同，对不同波长光线的吸收能力也不同，因此，每种物质都具有其特异的吸收光谱每种物质都具有其特异的吸收光谱每种物质都具有其特异的吸收光谱每种物质都具有其特异的吸收光谱。利用紫外光、可见光、红外光和激光等测定物质的吸收光谱，利用此吸收光谱对物质进行定性定量分析和物质结构分析的方法，称为分光光度法或分光光度技术，分光光度法或分光光度技术，分光光度法或分光光度技术，分光光度法或分光光度技术，使用的仪器称为分光光度计。分光光度计。分光光度计。分光光度计。分光光度计灵敏度高，测定速度快，应用范围广。灵敏度高，测定速度快，应用范围广。灵敏度高，测定速度快，应用范围广。灵敏度高，测定速度快，应用范围广。第二章第二章 光谱分析技术光谱分析技术第一节第一节第一节第一节 朗伯朗伯朗伯朗伯- -比尔（比尔（比尔（比尔（Lambert-beerLambert-beer）光吸收定律）光吸收定律）光吸收定律）光吸收定律第二节第二节第二节第二节 分光光度计基本结构分光光度计基本结构分光光度计基本结构分光光度计基本结构 第三节第三节第三节第三节 光度法的误差光度法的误差光度法的误差光度法的误差第四节第四节第四节第四节 分光光度法的应用分光光度法的应用分光光度法的应用分光光度法的应用第五节第五节第五节第五节原子吸收分光光度法原子吸收分光光度法原子吸收分光光度法原子吸收分光光度法第六节第六节第六节第六节荧光分析法荧光分析法荧光分析法荧光分析法第七节第七节第七节第七节散射光谱分析法散射光谱分析法散射光谱分析法散射光谱分析法第一节第一节朗伯朗伯-比尔（比尔（Lambert-beer）1.1朗伯朗伯-比尔（比尔（Lambert-beer）光吸收定律：）光吸收定律：A：吸光度，又称光密度：吸光度，又称光密度“OD”T：透光度，：透光度，TI/I0I0：照射到吸收池上的光强：照射到吸收池上的光强It：透过吸收池的光强。：透过吸收池的光强。1.2吸光度、溶液浓度及液层厚度之间关系：吸光度、溶液浓度及液层厚度之间关系：A=A=bCbC ：摩尔吸光系数或克分子吸光系数，：摩尔吸光系数或克分子吸光系数，：摩尔吸光系数或克分子吸光系数，：摩尔吸光系数或克分子吸光系数，LmolLmol-1-1cmcm-1-1b b：样品光程（：样品光程（：样品光程（：样品光程（cmcm），通常使用），通常使用），通常使用），通常使用1.0cm1.0cm的吸收地。的吸收地。的吸收地。的吸收地。C C：样品浓度，：样品浓度，：样品浓度，：样品浓度，molLmolL-1-1摩尔吸光系数是物质对某波长的光的吸收能力的量度。 越大，吸收光越大，吸收光越大，吸收光越大，吸收光的能力越强，相应的分光度法测定的灵敏度就越高的能力越强，相应的分光度法测定的灵敏度就越高的能力越强，相应的分光度法测定的灵敏度就越高的能力越强，相应的分光度法测定的灵敏度就越高。值越大，说明电子跃迁的几率大，通常 10105：一般认为 104为强吸收；103104 为较强吸收； 102 为弱吸收，此时分光光度法不灵敏。1.3应用朗伯应用朗伯-比耳定律的条件：比耳定律的条件：入射光波长应为max，且单色性好；单色性好；单色性好；单色性好；被测溶液具有均匀性、非散射性被测溶液具有均匀性、非散射性被测溶液具有均匀性、非散射性被测溶液具有均匀性、非散射性(不浑浊，也不呈胶体)；被测物质的浓度应在一定范围内；被测物质的浓度应在一定范围内；被测物质的浓度应在一定范围内；被测物质的浓度应在一定范围内；朗伯-比耳定律不仅适用于可见光，适用于可见光，适用于可见光，适用于可见光，也适用于红外光和紫外光；红外光和紫外光；红外光和紫外光；红外光和紫外光；朗伯-比耳定律不仅适用于均匀非散射的液体，均匀非散射的液体，均匀非散射的液体，均匀非散射的液体，也适用于固体和固体和固体和固体和气体。气体。气体。气体。因此，它是各类吸光光度法定量的依据，用途很广。因此，它是各类吸光光度法定量的依据，用途很广。因此，它是各类吸光光度法定量的依据，用途很广。因此，它是各类吸光光度法定量的依据，用途很广。第二节第二节 分光光度计基本结构分光光度计基本结构 2.1常见的分光光度计类型常见的分光光度计类型2.2分光光度计基本结构分光光度计基本结构 2.2.1电光源系统电光源系统2.2.2样品室样品室2.2.3单色器单色器2.1 2.1 常见的分光光度计类型常见的分光光度计类型 2.1.1单光束分光光度计单光束分光光度计2.1.2双光束分光光度计双光束分光光度计2.1.3双波长分光光度计双波长分光光度计2.1.4光多道二极管阵列检浏分光光度计光多道二极管阵列检浏分光光度计2.1.1单光束分光光度计单光束分光光度计早期的分光光度计都是单光束的，例如751型、75lG型，有些仍为手动操作，即固定在某一波长固定在某一波长固定在某一波长固定在某一波长，分别测量比较样品、空白或参比液的透光率或吸光度，操作比较费时，要求光源和检测器的供电电压稳定性高，用于绘制吸收光谱图时很不方便，但其光路简单，能量损失小，适用于物质的定量分析。2.1.2双光束分光光度计双光束分光光度计双光束分光光度计是目前发展最快，应用最为普遍的一种。应用最为普遍的一种。既可直接读数，又可扫描图谱。因为单色光能在很短的时间内交替通过空白和因为单色光能在很短的时间内交替通过空白和样品溶液，所以可以减小因光源强度不稳带来样品溶液，所以可以减小因光源强度不稳带来的误差。的误差。双光束分光光度计在测量过程中不需移动吸收双光束分光光度计在测量过程中不需移动吸收池，可在随意改变波长的同时记录吸光度。其池，可在随意改变波长的同时记录吸光度。其操作简单，测量快速，自动化程度高。操作简单，测量快速，自动化程度高。测定含量时，为准确起见，仍宜用固定波长测量方式。宜用固定波长测量方式。2.1.3双波长分光光度计双波长分光光度计双波长分光光度计是双波长分光光度计是将光源发出的光分成两束，将光源发出的光分成两束，分别分别进人各自的单色器，获得进人各自的单色器，获得两束波长可任意调节的单两束波长可任意调节的单色光，色光，然后交替照射到然后交替照射到同一个吸收池，到达同一检同一个吸收池，到达同一检测器，测得在两个波长处的吸光度差值测器，测得在两个波长处的吸光度差值A，A与被测组分的量成正比。与被测组分的量成正比。此法可消除参比和样品溶液组成不一致及比色池不匹配带来此法可消除参比和样品溶液组成不一致及比色池不匹配带来的误差，的误差，主要用于存在干扰组分的样品、浑浊样主要用于存在干扰组分的样品、浑浊样品和多组分混合样品的测定。但仪器价格昂贵，品和多组分混合样品的测定。但仪器价格昂贵，体积较大。体积较大。2.1.4光多道二极管阵列检浏分光光度计光多道二极管阵列检浏分光光度计光多道二极管阵列检测分光光度计是一种具有全新光路系统的仪器。具有光谱响应宽、数字化扫描准确、光谱响应宽、数字化扫描准确、性能比较稳定等优点。性能比较稳定等优点。由于全部波长同时被检测，而且光二极管的响应很快，一般可在0.1s的极短时间内获得190820nm范围的全光光谱，可作为追踪化学反应和反应动力学研究追踪化学反应和反应动力学研究的重要工具。随着仪器的改进和计算机的应用，又出现了随着仪器的改进和计算机的应用，又出现了许多新的测量技术，如许多新的测量技术，如14阶导数光谱测阶导数光谱测量技术、三波长分光光度法、速率分析或量技术、三波长分光光度法、速率分析或动力学分析等。动力学分析等。2.2 2.2 分光光度计基本结构分光光度计基本结构光源单色器吸收池检测器显示系统2.2.12.2.1电光源系统电光源系统电光源系统电光源系统2.2.22.2.2样品室样品室样品室样品室2.2.32.2.3单色器单色器单色器单色器2.2.1电光源系统电光源系统可见光源：钨可见光源：钨可见光源：钨可见光源：钨/ /卤钨灯卤钨灯卤钨灯卤钨灯(320-2500nm)(320-2500nm)，卤钨灯更好。，卤钨灯更好。，卤钨灯更好。，卤钨灯更好。紫外光源：氢灯和氘灯发光二极管，氘灯紫外光源：氢灯和氘灯发光二极管，氘灯紫外光源：氢灯和氘灯发光二极管，氘灯紫外光源：氢灯和氘灯发光二极管，氘灯(160-(160-375nm)375nm)，氘灯产生的光谱强度比氢灯大，氘灯产生的光谱强度比氢灯大，氘灯产生的光谱强度比氢灯大，氘灯产生的光谱强度比氢灯大3 35 5倍，而倍，而倍，而倍，而且寿命也比氢灯长。且寿命也比氢灯长。且寿命也比氢灯长。且寿命也比氢灯长。 红外光源：红外光源：红外光源：红外光源：碘钨灯碘钨灯碘钨灯碘钨灯( (近红外近红外近红外近红外) )、能斯持灯能斯持灯能斯持灯能斯持灯( (中红外中红外中红外中红外) )、汞、汞、汞、汞灯灯灯灯( (远红外远红外远红外远红外) )。线光源：空心阴极灯线光源：空心阴极灯线光源：空心阴极灯线光源：空心阴极灯/ /金属金属金属金属( (汞汞汞汞/ /钠钠钠钠) )蒸汽灯蒸汽灯蒸汽灯蒸汽灯激光光源：固体激光光源：固体激光光源：固体激光光源：固体/ /气体气体气体气体/ /染料激光器染料激光器染料激光器染料激光器荧光分光光度计多用球形荧光分光光度计多用球形荧光分光光度计多用球形荧光分光光度计多用球形氙灯氙灯氙灯氙灯原子吸收光谱仪多用原子吸收光谱仪多用原子吸收光谱仪多用原子吸收光谱仪多用原子光谱灯原子光谱灯原子光谱灯原子光谱灯，要求辐射的原子，要求辐射的原子，要求辐射的原子，要求辐射的原子光谱线半宽度要窄，以利于提高仪器的灵敏度。光谱线半宽度要窄，以利于提高仪器的灵敏度。光谱线半宽度要窄，以利于提高仪器的灵敏度。光谱线半宽度要窄，以利于提高仪器的灵敏度。能斯特灯是由铈、锆、钍和钇等氧化物烧结而成能斯特灯是由铈、锆、钍和钇等氧化物烧结而成能斯特灯是由铈、锆、钍和钇等氧化物烧结而成能斯特灯是由铈、锆、钍和钇等氧化物烧结而成的长约的长约的长约的长约2cm2cm、直径约、直径约、直径约、直径约1mm1mm的实心或空心棒组成，的实心或空心棒组成，的实心或空心棒组成，的实心或空心棒组成，工作温度可达工作温度可达工作温度可达工作温度可达1300130017001700，其发射的波长范围，其发射的波长范围，其发射的波长范围，其发射的波长范围约为约为约为约为1 130m30m，它的寿命较长、稳定性好。对短，它的寿命较长、稳定性好。对短，它的寿命较长、稳定性好。对短，它的寿命较长、稳定性好。对短波范围辐射效率优于硅碳棒，但价格较贵，操作波范围辐射效率优于硅碳棒，但价格较贵，操作波范围辐射效率优于硅碳棒，但价格较贵，操作波范围辐射效率优于硅碳棒，但价格较贵，操作不如硅碳棒方便。不如硅碳棒方便。不如硅碳棒方便。不如硅碳棒方便。硅碳棒是由碳化硅烧结而成的实心捧，工作温度硅碳棒是由碳化硅烧结而成的实心捧，工作温度硅碳棒是由碳化硅烧结而成的实心捧，工作温度硅碳棒是由碳化硅烧结而成的实心捧，工作温度达达达达1200120015001500。对于长波，其辐射效率高于能。对于长波，其辐射效率高于能。对于长波，其辐射效率高于能。对于长波，其辐射效率高于能斯特灯，其使用波长范围比能斯特灯宽，发光面斯特灯，其使用波长范围比能斯特灯宽，发光面斯特灯，其使用波长范围比能斯特灯宽，发光面斯特灯，其使用波长范围比能斯特灯宽，发光面大，操作方便、廉价。大，操作方便、廉价。大，操作方便、廉价。大，操作方便、廉价。岛岛津津荧荧光分光光度光分光光度计计RF-5301PC荧光分光光度计在越来越多的领域发挥着巨大的作用，比如生命科学中的定性定量分析，化学中的光化学反应的研究，食品中的残留农药检测和环境中大气、水质、土壤的污染评估。相比于吸光度法，荧光法的灵敏度更高，选择性也更好，把激发光、荧光波长相结合，可以测定混合物。RF5301PC作为新一代的荧光分光光度计具有高水平的性价比和功能强大的软件，从日常分析到科学研究都发挥了极大的作用原子吸收光谱仪的光源原子吸收光谱仪的光源主要采用主要采用空心阴极灯。空心阴极灯。空心阴极灯的结构如左空心阴极灯的结构如左图所示。图所示。1 1紫外玻璃窗口；紫外玻璃窗口；紫外玻璃窗口；紫外玻璃窗口；2 2石英窗口，石英窗口，石英窗口，石英窗口，3 3密封密封密封密封4 4玻璃套，玻璃套，玻璃套，玻璃套，5 5云母屏蔽；云母屏蔽；云母屏蔽；云母屏蔽；6 6阳极；阳极；阳极；阳极；7 7阴极；阴极；阴极；阴极；8 8支架；支架；支架；支架；9 9管座，管座，管座，管座，1010连接管脚连接管脚连接管脚连接管脚2.2.2样品室样品室紫外紫外-可见分光光度计和荧光分光光度计的可见分光光度计和荧光分光光度计的样品室内装有比色皿，可以是玻璃或石英样品室内装有比色皿，可以是玻璃或石英比色皿。比色皿。可见光范围用可见光范围用玻璃比色皿玻璃比色皿。紫外光范围用紫外光范围用石英比色皿石英比色皿。原子吸收光谱仪的样品室为原子化器，常用原子吸收光谱仪的样品室为原子化器，常用的原子化器有火焰和石墨炉。的原子化器有火焰和石墨炉。2.2.3单色器单色器凡能把复合光分解为按波长顺序排列的单色凡能把复合光分解为按波长顺序排列的单色光，并能通过出射狭缝分离出某一波长单光，并能通过出射狭缝分离出某一波长单色光的仪器，称为单色器。色光的仪器，称为单色器。分光光度计中所用的单色器有两种类型：棱分光光度计中所用的单色器有两种类型：棱镜单色器和光栅单色器。镜单色器和光栅单色器。单色器单色器单色器单色器主要部分都是由入光狭缝、出光狭缝、色散主要部分都是由入光狭缝、出光狭缝、色散主要部分都是由入光狭缝、出光狭缝、色散主要部分都是由入光狭缝、出光狭缝、色散元件、准直镜以及附属机械装置所组成。元件、准直镜以及附属机械装置所组成。元件、准直镜以及附属机械装置所组成。元件、准直镜以及附属机械装置所组成。入光狭缝起着限制复合光进入单色器的作用；入光狭缝起着限制复合光进入单色器的作用；入光狭缝起着限制复合光进入单色器的作用；入光狭缝起着限制复合光进入单色器的作用；色散元件起着把复合光分解为单色光的作用；色散元件起着把复合光分解为单色光的作用；色散元件起着把复合光分解为单色光的作用；色散元件起着把复合光分解为单色光的作用；准直镜的作用一是把来自入光狭缝的光转变为平行准直镜的作用一是把来自入光狭缝的光转变为平行准直镜的作用一是把来自入光狭缝的光转变为平行准直镜的作用一是把来自入光狭缝的光转变为平行光，投射到色散元件上，作用二是把来自色散元件光，投射到色散元件上，作用二是把来自色散元件光，投射到色散元件上，作用二是把来自色散元件光，投射到色散元件上，作用二是把来自色散元件的平行光束聚焦于出光狭缝上，形成光谱像；的平行光束聚焦于出光狭缝上，形成光谱像；的平行光束聚焦于出光狭缝上，形成光谱像；的平行光束聚焦于出光狭缝上，形成光谱像；出光狭缝是单色光的出口。它只让光谱带中额定波出光狭缝是单色光的出口。它只让光谱带中额定波出光狭缝是单色光的出口。它只让光谱带中额定波出光狭缝是单色光的出口。它只让光谱带中额定波长的光从狭缝中透出，而将其他波长的光挡住，不长的光从狭缝中透出，而将其他波长的光挡住，不长的光从狭缝中透出，而将其他波长的光挡住，不长的光从狭缝中透出，而将其他波长的光挡住，不许其通过。许其通过。许其通过。许其通过。 1、棱镜单色器、棱镜单色器3030利特罗（利特罗（利特罗（利特罗（LitrowLitrow）式（自准式）式（自准式）式（自准式）式（自准式）6060棱镜利特罗（棱镜利特罗（棱镜利特罗（棱镜利特罗（LitrowLitrow）式）式）式）式瓦兹渥斯（瓦兹渥斯（瓦兹渥斯（瓦兹渥斯（WadsworchWadsworch）式）式）式）式泽尼特（泽尼特（泽尼特（泽尼特（Czerny-TurnerCzerny-Turner）式）式）式）式光从一种介质射到另一种介质时，一部分光从界光从一种介质射到另一种介质时，一部分光从界光从一种介质射到另一种介质时，一部分光从界光从一种介质射到另一种介质时，一部分光从界面反射回去称为反射，面反射回去称为反射，面反射回去称为反射，面反射回去称为反射， 另一部分光则改变前进方另一部分光则改变前进方另一部分光则改变前进方另一部分光则改变前进方向进入第二种介质称为折射。若入射角为向进入第二种介质称为折射。若入射角为向进入第二种介质称为折射。若入射角为向进入第二种介质称为折射。若入射角为i i、折射、折射、折射、折射角为角为角为角为 ，则其折射率，则其折射率，则其折射率，则其折射率n n为：为：为：为：n=n=sini/sinsini/sin。不同的光。不同的光。不同的光。不同的光学材料具有不同的折射率，即便是同一种光学材学材料具有不同的折射率，即便是同一种光学材学材料具有不同的折射率，即便是同一种光学材学材料具有不同的折射率，即便是同一种光学材料以相同的入射角照射，若波长不同，得到的折料以相同的入射角照射，若波长不同，得到的折料以相同的入射角照射，若波长不同，得到的折料以相同的入射角照射，若波长不同，得到的折射角也不一样。射角也不一样。射角也不一样。射角也不一样。 2 2、光栅单色器光路图、光栅单色器光路图 光栅色散均匀、谱线清晰、工作波段宽，是棱镜无法比拟的。再加上它所光栅色散均匀、谱线清晰、工作波段宽，是棱镜无法比拟的。再加上它所光栅色散均匀、谱线清晰、工作波段宽，是棱镜无法比拟的。再加上它所光栅色散均匀、谱线清晰、工作波段宽，是棱镜无法比拟的。再加上它所组成的单色器的结构比较简单，所以近年来逐步取代了棱镜，而成为色散组成的单色器的结构比较简单，所以近年来逐步取代了棱镜，而成为色散组成的单色器的结构比较简单，所以近年来逐步取代了棱镜，而成为色散组成的单色器的结构比较简单，所以近年来逐步取代了棱镜，而成为色散元件的主角。元件的主角。元件的主角。元件的主角。光栅光栅原是指大量等宽、等间距的平行狭缝所原是指大量等宽、等间距的平行狭缝所组成的光学元件，组成的光学元件，是一种多狭缝部件，光栅是一种多狭缝部件，光栅光谱的产生是多狭缝干涉和单狭缝衍射两者光谱的产生是多狭缝干涉和单狭缝衍射两者联合作用的结果。多缝干涉决定光谱线出现联合作用的结果。多缝干涉决定光谱线出现的位置，单狭缝衍射决定谱线的强度分布。的位置，单狭缝衍射决定谱线的强度分布。 光栅分为平面透射光栅和反射光栅，反射光光栅分为平面透射光栅和反射光栅，反射光栅应用更广泛。反射光栅又可分为平面反射栅应用更广泛。反射光栅又可分为平面反射光栅（或称闪耀光栅）和凹面反射光栅。光栅（或称闪耀光栅）和凹面反射光栅。b为狭缝宽度为狭缝宽度d为光栅常数，为光栅常数，它等于狭缝宽度它等于狭缝宽度加两狭缝之间的加两狭缝之间的距离，即相邻两距离，即相邻两刻痕间的距离。刻痕间的距离。为衍射角。为衍射角。i为入射角为入射角光栅的色散原理图光栅的色散原理图光栅的色散原理图光栅的色散原理图光栅光栅光栅光栅会聚透镜会聚透镜会聚透镜会聚透镜透镜焦平面透镜焦平面透镜焦平面透镜焦平面上的受光屏上的受光屏上的受光屏上的受光屏平面透射光栅平面透射光栅 当光以垂直方向照射光栅即当光以垂直方向照射光栅即i0，则，则n=0，1，2，n称为干涉的级。可以得到称为零级、一级、称为干涉的级。可以得到称为零级、一级、二级、二级、的光栅光谱。的光栅光谱。若入射光不是垂直地照射在光栅上，而是有若入射光不是垂直地照射在光栅上，而是有一定的角度，则上式写为：一定的角度，则上式写为：该式称为平面衍射光栅方程，简称光栅方程。该式称为平面衍射光栅方程，简称光栅方程。反射型复制光栅，它是在平面玻璃上粘结上反射型复制光栅，它是在平面玻璃上粘结上一定角度刻槽的铝反射膜而制成的。一定角度刻槽的铝反射膜而制成的。铝膜很薄铝膜很薄(约约0.11.5um)、很亮，故从外表、很亮，故从外表看不出和一般的反射镜有什么明显的差异。看不出和一般的反射镜有什么明显的差异。光栅表面的铝膜质地很松软，极易擦伤，所以在光栅表面的铝膜质地很松软，极易擦伤，所以在光栅表面的铝膜质地很松软，极易擦伤，所以在光栅表面的铝膜质地很松软，极易擦伤，所以在维护时，严禁用任何擦拭物擦拭，更不能用手去维护时，严禁用任何擦拭物擦拭，更不能用手去维护时，严禁用任何擦拭物擦拭，更不能用手去维护时，严禁用任何擦拭物擦拭，更不能用手去触摸，否则会造成永久性损坏。万一光栅上落上触摸，否则会造成永久性损坏。万一光栅上落上触摸，否则会造成永久性损坏。万一光栅上落上触摸，否则会造成永久性损坏。万一光栅上落上了灰尘，只能用吹气球吹去。了灰尘，只能用吹气球吹去。了灰尘，只能用吹气球吹去。了灰尘，只能用吹气球吹去。不同波长的光具有不同的衍射角，两者成比例关不同波长的光具有不同的衍射角，两者成比例关不同波长的光具有不同的衍射角，两者成比例关不同波长的光具有不同的衍射角，两者成比例关系。波长长者衍射角大，波长短者衍射角小。因系。波长长者衍射角大，波长短者衍射角小。因系。波长长者衍射角大，波长短者衍射角小。因系。波长长者衍射角大，波长短者衍射角小。因此，利用光栅可以把不同波长的光分开，这就是此，利用光栅可以把不同波长的光分开，这就是此，利用光栅可以把不同波长的光分开，这就是此，利用光栅可以把不同波长的光分开，这就是光栅的色散原理。光栅的色散原理。光栅的色散原理。光栅的色散原理。闪耀光栅闪耀光栅 光栅的宽度越大，光栅的宽度越大，总刻线数越多，总刻线数越多，分辨率越大。分辨率越大。对同一线光谱而对同一线光谱而言，光栅的分辨言，光栅的分辨率是常数，不随率是常数，不随波长而变化。波长而变化。 i是入射角，是入射角，是衍射角，是衍射角，是光栅刻痕角。反射面与是光栅刻痕角。反射面与光栅平面的夹角，称为闪光栅平面的夹角，称为闪耀角。耀角。3、滤光片、滤光片在简易的比色计中，使用滤光片能够获得有限波在简易的比色计中，使用滤光片能够获得有限波长范围的光。滤光片分为吸收滤光片和干涉滤光长范围的光。滤光片分为吸收滤光片和干涉滤光片两种。片两种。吸收滤光片吸收滤光片由有色玻璃或内夹在两玻璃片之间的有色染料的明胶所组成，这种滤光片适用于可见光区。适用于可见光区。干涉滤光片干涉滤光片是根据光的干涉原理设计的，它是由透明的电解质（如氟化钙或氟化镁），夹在两块内侧涂有一层半透明金属（如银）簿膜的玻璃或石英片之间所组成。电解质的厚度必须严格控制。这种滤光片适用于紫外光区。适用于紫外光区。偏离偏离Beer定律的因素定律的因素根据根据Beer定律，当波长和入射光强度一定时，定律，当波长和入射光强度一定时，吸光度吸光度A与吸光物质的浓度与吸光物质的浓度C成正比。成正比。不同浓度的标准溶液的吸光度，不同浓度的标准溶液的吸光度，C与与A之间的之间的关系应该是一条通过原点的直线。但实际工关系应该是一条通过原点的直线。但实际工作中常常会出现偏离直线的情况，即偏离作中常常会出现偏离直线的情况，即偏离Beer定律的现象。定律的现象。导致偏离的主要因素有化学因素与光学因素。导致偏离的主要因素有化学因素与光学因素。第三节第三节 光度法的误差光度法的误差3.1化学因素化学因素通常只有当溶液浓度小于通常只有当溶液浓度小于0.01molL的稀溶的稀溶液时液时Beer定律才能成立。定律才能成立。随着溶液浓度的改变，溶液中吸光物质可因随着溶液浓度的改变，溶液中吸光物质可因浓度的改变而发生离解、缔合、溶剂化以及浓度的改变而发生离解、缔合、溶剂化以及配合物组成等的变化，使吸光物质存在形式配合物组成等的变化，使吸光物质存在形式发生变化，从而使吸光物质对光吸收的选择发生变化，从而使吸光物质对光吸收的选择性和吸光强度也发生相应的变化。性和吸光强度也发生相应的变化。随着浓度的增大，随着浓度的增大，随着浓度的增大，随着浓度的增大，660nm660nm处吸收峰减弱，而处吸收峰减弱，而处吸收峰减弱，而处吸收峰减弱，而610nm610nm处吸收峰增强，吸收光谱形状改变。由于离子浓度处吸收峰增强，吸收光谱形状改变。由于离子浓度处吸收峰增强，吸收光谱形状改变。由于离子浓度处吸收峰增强，吸收光谱形状改变。由于离子浓度的变化，使吸光度与浓度成正比的关系发生偏离。的变化，使吸光度与浓度成正比的关系发生偏离。的变化，使吸光度与浓度成正比的关系发生偏离。的变化，使吸光度与浓度成正比的关系发生偏离。例例例例1 1：亚甲蓝阳离子水溶液的吸收光谱：亚甲蓝阳离子水溶液的吸收光谱：亚甲蓝阳离子水溶液的吸收光谱：亚甲蓝阳离子水溶液的吸收光谱例例2：重铬酸钾的水溶液：重铬酸钾的水溶液有以下平衡：有以下平衡：若溶液稀释若溶液稀释2倍，由于受稀释平衡向右移动倍，由于受稀释平衡向右移动的影响，的影响，Cr2O72-离子浓度不是减小离子浓度不是减小2倍，倍，Cr2O72-离子浓度的减少明显地多于离子浓度的减少明显地多于2倍。倍。Cr2O72-、CrO42-两种离子在某一波长处吸两种离子在某一波长处吸光强度相差较大，致使重铬酸钾水溶液吸光强度相差较大，致使重铬酸钾水溶液吸光度的降低与浓度的降低不成正比而偏离光度的降低与浓度的降低不成正比而偏离Beer定律。定律。若控制溶液的酸度，在强酸性条件下测定若控制溶液的酸度，在强酸性条件下测定Cr2O72-，或在强碱条件下测定，或在强碱条件下测定Cr2O72-，偏，偏离离Beer定律的现象可以避免。定律的现象可以避免。3.2光学因素光学因素3.2.1非单色光非单色光Beer定律只适用于单色光，而实际用于测量定律只适用于单色光，而实际用于测量的是一定波长范围的复合光，由于吸光物的是一定波长范围的复合光，由于吸光物质对不同波长的光的吸收能力不同，就导质对不同波长的光的吸收能力不同，就导致了对致了对Beer定律的偏离。定律的偏离。例如，右图例如，右图例如，右图例如，右图所示的吸收光谱，所示的吸收光谱，所示的吸收光谱，所示的吸收光谱，用谱带用谱带用谱带用谱带I I所对应的波长进行所对应的波长进行所对应的波长进行所对应的波长进行分析，造成的偏离就比较分析，造成的偏离就比较分析，造成的偏离就比较分析，造成的偏离就比较小。用谱带小。用谱带小。用谱带小。用谱带所对应的波所对应的波所对应的波所对应的波长进行分析就会造成较大长进行分析就会造成较大长进行分析就会造成较大长进行分析就会造成较大的偏离。的偏离。的偏离。的偏离。通常选择吸光物质的最大吸收波长作为测定波长。这通常选择吸光物质的最大吸收波长作为测定波长。这通常选择吸光物质的最大吸收波长作为测定波长。这通常选择吸光物质的最大吸收波长作为测定波长。这样不仅能保证测定有较高的灵敏度，而且此处曲线较样不仅能保证测定有较高的灵敏度，而且此处曲线较样不仅能保证测定有较高的灵敏度，而且此处曲线较样不仅能保证测定有较高的灵敏度，而且此处曲线较为平坦，吸光系数变化不大，对为平坦，吸光系数变化不大，对为平坦，吸光系数变化不大，对为平坦，吸光系数变化不大，对BeerBeer定律的偏离程度定律的偏离程度定律的偏离程度定律的偏离程度就比较小。就比较小。就比较小。就比较小。在保证一定光强的前提下，应使用尽可能窄的带宽宽在保证一定光强的前提下，应使用尽可能窄的带宽宽在保证一定光强的前提下，应使用尽可能窄的带宽宽在保证一定光强的前提下，应使用尽可能窄的带宽宽度，同时应尽量避免采用尖锐的吸收峰进行定量分析。度，同时应尽量避免采用尖锐的吸收峰进行定量分析。度，同时应尽量避免采用尖锐的吸收峰进行定量分析。度，同时应尽量避免采用尖锐的吸收峰进行定量分析。3.2.2杂散光杂散光从单色光器得到的单色光中，还有一些不在从单色光器得到的单色光中，还有一些不在谱带范围内的与所需波长相隔甚远的光，谱带范围内的与所需波长相隔甚远的光，称为杂散光称为杂散光(straylight)。主要由仪器光学系统的缺陷或光学元件受灰主要由仪器光学系统的缺陷或光学元件受灰尘、霉蚀的影响而引起。特别是在透光率尘、霉蚀的影响而引起。特别是在透光率很弱的情况下，杂散光的影响尤为显著。很弱的情况下，杂散光的影响尤为显著。杂散光杂散光杂散光杂散光I Is s常随入射光强度常随入射光强度常随入射光强度常随入射光强度I I0 0的增大而增大。若供试的增大而增大。若供试的增大而增大。若供试的增大而增大。若供试品不吸收杂散光，品不吸收杂散光，品不吸收杂散光，品不吸收杂散光，(I (Is s+I+I0 0) )( (I It t+I+Is s)I)I0 0/I /It t，A A变小，变小，变小，变小，为负偏离，供试品吸收杂散光，为负偏离，供试品吸收杂散光，为负偏离，供试品吸收杂散光，为负偏离，供试品吸收杂散光，A A增大，为正偏增大，为正偏增大，为正偏增大，为正偏离。前一种情况在分析中常会遇到。离。前一种情况在分析中常会遇到。离。前一种情况在分析中常会遇到。离。前一种情况在分析中常会遇到。 设照射光强度为设照射光强度为设照射光强度为设照射光强度为I I00，透过光强度为，透过光强度为，透过光强度为，透过光强度为I It t，杂散光强度，杂散光强度，杂散光强度，杂散光强度为为为为I Is s，则观察到的吸光度为：，则观察到的吸光度为：，则观察到的吸光度为：，则观察到的吸光度为：随着仪器制造工艺的提高，绝大部分波长内杂散随着仪器制造工艺的提高，绝大部分波长内杂散随着仪器制造工艺的提高，绝大部分波长内杂散随着仪器制造工艺的提高，绝大部分波长内杂散光的影响可忽略不计。光的影响可忽略不计。光的影响可忽略不计。光的影响可忽略不计。但在接近紫外末端处，因在短波长光源强度和检但在接近紫外末端处，因在短波长光源强度和检但在接近紫外末端处，因在短波长光源强度和检但在接近紫外末端处，因在短波长光源强度和检测器灵敏度均减弱，杂散光的比例相对增大，测测器灵敏度均减弱，杂散光的比例相对增大，测测器灵敏度均减弱，杂散光的比例相对增大，测测器灵敏度均减弱，杂散光的比例相对增大，测定时可能会出现假峰。定时可能会出现假峰。定时可能会出现假峰。定时可能会出现假峰。如用钨灯作为光源时，如用钨灯作为光源时，如用钨灯作为光源时，如用钨灯作为光源时，350-400nm350-400nm波长杂散光影波长杂散光影波长杂散光影波长杂散光影响显著；若用紫外光源时，响显著；若用紫外光源时，响显著；若用紫外光源时，响显著；若用紫外光源时，220nm220nm以下的杂散光以下的杂散光以下的杂散光以下的杂散光迅速增大。迅速增大。迅速增大。迅速增大。3.2.3散射光和反射光散射光和反射光吸光质点对入射光有散射作用，吸收池内外吸光质点对入射光有散射作用，吸收池内外界面之间入射光通过时又有反射作用。界面之间入射光通过时又有反射作用。散射光和反射光均由入射光谱带宽度内的光散射光和反射光均由入射光谱带宽度内的光产生，对透射光强度有直接影响。散射和产生，对透射光强度有直接影响。散射和反射作用致使透射光强度减弱。反射作用致使透射光强度减弱。真溶液散射作用较弱，可用空白进行补偿。真溶液散射作用较弱，可用空白进行补偿。混浊溶液散射作用较强，一般不易制备相混浊溶液散射作用较强，一般不易制备相同的空白溶液，常使测得的吸光度偏离，同的空白溶液，常使测得的吸光度偏离，分析中不容忽视。分析中不容忽视。3.2.4非平行光非平行光通过吸收池的光，一般都不是真正的平行光，通过吸收池的光，一般都不是真正的平行光，倾斜光通过吸收池的实际光程将比垂直照倾斜光通过吸收池的实际光程将比垂直照射的平行光的光程长。使厚度增大而影响射的平行光的光程长。使厚度增大而影响测量值。测量值。这种测量时实际厚度的变异也是同一物质用这种测量时实际厚度的变异也是同一物质用不同仪器测定吸光系数时，产生差异的主不同仪器测定吸光系数时，产生差异的主要原因之一。要原因之一。3.3 干扰的产生及其消除干扰的产生及其消除 干扰物质的影响有以下几种情况：干扰物质的影响有以下几种情况：干扰物质本身有颜色或无色但与显色剂形成干扰物质本身有颜色或无色但与显色剂形成有色化合物，在测定条件下也有吸收；有色化合物，在测定条件下也有吸收；在显色条件下，干扰物质水解，析出沉淀使在显色条件下，干扰物质水解，析出沉淀使溶液混浊，致使吸光度的测定无法进行；溶液混浊，致使吸光度的测定无法进行；与待测离子或显色剂形成更稳定的配合物，与待测离子或显色剂形成更稳定的配合物，使显色反应不能进行完全。使显色反应不能进行完全。3.3.1控制酸度控制酸度根据配合物的稳定性不同，可以利用控制酸根据配合物的稳定性不同，可以利用控制酸度的方法提高反应的选择性，保证主反应度的方法提高反应的选择性，保证主反应进行完全。进行完全。例如，双硫腺能与例如，双硫腺能与Hg2+、Pb2+、Cu2+、Ni2+、Cd2+、等十多种金属离子形成有色配合物，、等十多种金属离子形成有色配合物，其中与其中与Hg2+生成的配合物最稳定，在生成的配合物最稳定，在o.5mol/mlH2SO4介质中仍能定量进行，而介质中仍能定量进行，而上述其他离子在此条件下不发生反应。上述其他离子在此条件下不发生反应。3.3.2选择适当的掩蔽剂选择适当的掩蔽剂使用掩蔽剂消除干扰是常用的有效方法。使用掩蔽剂消除干扰是常用的有效方法。选取的条件是掩蔽剂不与待测离子作用；选取的条件是掩蔽剂不与待测离子作用；掩蔽剂以及它与干扰物质形成的配合物的颜掩蔽剂以及它与干扰物质形成的配合物的颜色应不干扰待测离子的测定。色应不干扰待测离子的测定。3.3.3利用生成惰性配合物利用生成惰性配合物例如钢铁中微量钴的测定例如钢铁中微量钴的测定例如钢铁中微量钴的测定例如钢铁中微量钴的测定常用钴试剂为显色剂，但钴试剂不仅与常用钴试剂为显色剂，但钴试剂不仅与常用钴试剂为显色剂，但钴试剂不仅与常用钴试剂为显色剂，但钴试剂不仅与CoCo2+2+发生发生发生发生反应，而且与反应，而且与反应，而且与反应，而且与NiNi2+2+、ZnZn2+2+、MnMn2+2+、FeFe2+2+、等都有反、等都有反、等都有反、等都有反应。应。应。应。钴试剂与钴试剂与钴试剂与钴试剂与CoCo2+2+在弱酸性介质中一旦完成反应后，在弱酸性介质中一旦完成反应后，在弱酸性介质中一旦完成反应后，在弱酸性介质中一旦完成反应后，即使再用强酸酸化溶液，该配合物也不会分解。即使再用强酸酸化溶液，该配合物也不会分解。即使再用强酸酸化溶液，该配合物也不会分解。即使再用强酸酸化溶液，该配合物也不会分解。NiNi2+2+、ZnZn2+2+、MnMn2+2+、FeFe2+2+、等与钴试剂形成的配台、等与钴试剂形成的配台、等与钴试剂形成的配台、等与钴试剂形成的配台物在强酸介质中很快分解，从而消除了上述离子物在强酸介质中很快分解，从而消除了上述离子物在强酸介质中很快分解，从而消除了上述离子物在强酸介质中很快分解，从而消除了上述离子的干扰，提高了反应的选择性。的干扰，提高了反应的选择性。的干扰，提高了反应的选择性。的干扰，提高了反应的选择性。3.3.4选择适当的测量波长选择适当的测量波长例如在例如在K2Cr2O7存在下测定存在下测定KMnO4时时不是选不是选max(525nm)，而是选，而是选=545nm。这。这样测定样测定KMn04溶液的吸光度，溶液的吸光度，K2Cr2O7就不就不干扰。干扰。3.3.5选择适宜的空白溶液选择适宜的空白溶液空白溶液又叫参比溶液。空白溶液除用以校正仪器透光率空白溶液又叫参比溶液。空白溶液除用以校正仪器透光率100100或吸光度为零，除作为测量的相对标准外，在中药或吸光度为零，除作为测量的相对标准外，在中药制剂分析中还用于消除干扰吸收。制剂分析中还用于消除干扰吸收。溶剂、试剂、器皿及试样溶剂、试剂、器皿及试样本身都可能引入干扰因素本身都可能引入干扰因素本身都可能引入干扰因素本身都可能引入干扰因素。常见的空白溶液有：常见的空白溶液有：溶剂空白、溶剂空白、溶剂空白、溶剂空白、试剂空白、试样空白、试剂空白、试样空白、试剂空白、试样空白、试剂空白、试样空白、不显色空白、平行操作空白不显色空白、平行操作空白不显色空白、平行操作空白不显色空白、平行操作空白等等。1、溶剂空白、溶剂空白在测定入射光波长下，溶液中只有被测组分对光有只有被测组分对光有吸收，而显色剂和其他组分对光无吸收，吸收，而显色剂和其他组分对光无吸收，或虽有少许吸收或虽有少许吸收，但所引起的测定误差在允许范围内，在此情况下可用溶剂作为空白溶液。2、试剂空白、试剂空白相同条件下只是不加试样溶液，依次加入各种试剂加入各种试剂和溶剂所得到的溶液称为试剂空白溶液和溶剂所得到的溶液称为试剂空白溶液。适用于在测定条件下，显色剂或其他试剂、溶剂等显色剂或其他试剂、溶剂等对待测组分的测定有干扰对待测组分的测定有干扰的情况。3、试样空白、试样空白与显色反应同样的条件取同量试样溶液，不加显色剂所制备的溶液称为试样空白溶液。适用于试样基体有色试样基体有色并在测定条件下有吸收，而显色剂溶液无并在测定条件下有吸收，而显色剂溶液无干扰吸收干扰吸收也不与试样基体显色的情况。4、不显色空白、不显色空白某些显色反应，当改变试剂加入顺序或某某些显色反应，当改变试剂加入顺序或某一操作（如加热改为不加热）时，可使被一操作（如加热改为不加热）时，可使被测组分与显色剂的显色反应不发生，这样测组分与显色剂的显色反应不发生，这样配制的溶液称为不显色空白溶液。这种空配制的溶液称为不显色空白溶液。这种空白能够同时消除试样基体和试剂的干扰。白能够同时消除试样基体和试剂的干扰。5、平行操作空白、平行操作空白如果容器、器材、溶剂、试剂以及环境可如果容器、器材、溶剂、试剂以及环境可能带入被测组分或干扰组分时可采用不能带入被测组分或干扰组分时可采用不含被测组分的试样基体作为空白试样，与含被测组分的试样基体作为空白试样，与试样在完全相同条件下平行操作，然后用试样在完全相同条件下平行操作，然后用此溶液为空白溶液，这种空白可当作一个此溶液为空白溶液，这种空白可当作一个试样来处理，测得的结果称为空白值，应试样来处理，测得的结果称为空白值，应从试样测得结果中减去。从试样测得结果中减去。3.3.6分离分离若上述方法不宜采用时，也可以采用预先分若上述方法不宜采用时，也可以采用预先分离的方法，如沉淀、萃取、离子交换、蒸离的方法，如沉淀、萃取、离子交换、蒸发和蒸馏以及色谱分离法等。发和蒸馏以及色谱分离法等。此外，还可以利用化学计量学方法实现多组此外，还可以利用化学计量学方法实现多组分同时测定。分同时测定。4.1定性分析定性分析4.2定量分析定量分析4.3分光光度法的具体应用分光光度法的具体应用第四节第四节 分光光度法的应用分光光度法的应用1、比较吸收光谱曲线。、比较吸收光谱曲线。2、比较最大吸收波长。、比较最大吸收波长。3、比较吸光度比值。、比较吸光度比值。4.1定性分析定性分析定性分析缺点：定性分析缺点：紫外和可见光谱的特征吸收带紫外和可见光谱的特征吸收带紫外和可见光谱的特征吸收带紫外和可见光谱的特征吸收带是主要的定性依据，但在定性分析上的应用是有限的，因为其吸收带很宽，缺吸收带很宽，缺吸收带很宽，缺吸收带很宽，缺乏精细结构乏精细结构乏精细结构乏精细结构的特征，在定性方面不如红外吸收光谱。在定性方面不如红外吸收光谱。在定性方面不如红外吸收光谱。在定性方面不如红外吸收光谱。如果只有一两个发色团相同，其它部分的结构略如果只有一两个发色团相同，其它部分的结构略如果只有一两个发色团相同，其它部分的结构略如果只有一两个发色团相同，其它部分的结构略有不同，对紫外和可见光谱影响变化不大，往往有不同，对紫外和可见光谱影响变化不大，往往有不同，对紫外和可见光谱影响变化不大，往往有不同，对紫外和可见光谱影响变化不大，往往具有十分接近的吸收光谱。具有十分接近的吸收光谱。具有十分接近的吸收光谱。具有十分接近的吸收光谱。所以在鉴定化合物时要注意，即使是光谱相同，所以在鉴定化合物时要注意，即使是光谱相同，所以在鉴定化合物时要注意，即使是光谱相同，所以在鉴定化合物时要注意，即使是光谱相同，未必是同一种化合物，要采用其它分析方法配合未必是同一种化合物，要采用其它分析方法配合未必是同一种化合物，要采用其它分析方法配合未必是同一种化合物，要采用其它分析方法配合进一步鉴定。进一步鉴定。进一步鉴定。进一步鉴定。 4.2定量分析定量分析定量分析的依据是比耳定律、在液层厚度一定量分析的依据是比耳定律、在液层厚度一定时，溶液的浓度与吸光度要成正比关系。定时，溶液的浓度与吸光度要成正比关系。标准曲线法、对比法、标准增量法，多组分标准曲线法、对比法、标准增量法，多组分混合物分析法，双波长分光光度法。混合物分析法，双波长分光光度法。4.2.1标准曲线法标准曲线法将一系列浓度不同的标准溶液按照一定操将一系列浓度不同的标准溶液按照一定操作过程显色后，分别测吸光度，以吸光度作过程显色后，分别测吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线。为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线。在相同条件下处理待测物质并测定其吸光在相同条件下处理待测物质并测定其吸光度，即可从标准曲线找出相对应的浓度。度，即可从标准曲线找出相对应的浓度。4.2.2对比法对比法先配制一种己知浓度的标准溶液先配制一种己知浓度的标准溶液先配制一种己知浓度的标准溶液先配制一种己知浓度的标准溶液C C标，测其吸光标，测其吸光标，测其吸光标，测其吸光度为度为度为度为A A标标标标，再在相同条件下测得样品溶液的吸光，再在相同条件下测得样品溶液的吸光，再在相同条件下测得样品溶液的吸光，再在相同条件下测得样品溶液的吸光度为度为度为度为A A样样样样，根据下列公式求得样品浓度。，根据下列公式求得样品浓度。，根据下列公式求得样品浓度。，根据下列公式求得样品浓度。此法可不做标准曲线但要求溶液中的待测物质此法可不做标准曲线但要求溶液中的待测物质此法可不做标准曲线但要求溶液中的待测物质此法可不做标准曲线但要求溶液中的待测物质能严格符合光的吸收定律，而且样品溶液和标准能严格符合光的吸收定律，而且样品溶液和标准能严格符合光的吸收定律，而且样品溶液和标准能严格符合光的吸收定律，而且样品溶液和标准溶液的吸光度值较为接近这种方法的测定误差溶液的吸光度值较为接近这种方法的测定误差溶液的吸光度值较为接近这种方法的测定误差溶液的吸光度值较为接近这种方法的测定误差比标准曲线法要大一些。比标准曲线法要大一些。比标准曲线法要大一些。比标准曲线法要大一些。4.2.3标准增量法标准增量法采用标准曲线法使未知样采用标准曲线法使未知样与标准样保持一致，在实与标准样保持一致，在实际中并不是总能做到的，际中并不是总能做到的，采用增量法可以弥补这一缺点。采用增量法可以弥补这一缺点。方法是将未知样分成体积相同若干份，除方法是将未知样分成体积相同若干份，除其中一份不加已知被测组分外，其余都加，其中一份不加已知被测组分外，其余都加，在合适条件下测定如未知样不含被测组在合适条件下测定如未知样不含被测组分，吸光值分，吸光值A应为零，曲线过原点。应为零，曲线过原点。但实际没过原点，上截矩但实际没过原点，上截矩A1，校正后，曲，校正后，曲线延长至线延长至OO浓度为浓度为Cx如图。如图。此法还可以检查实验过程的系统误差设此法还可以检查实验过程的系统误差设样品中校测组分真实含量为样品中校测组分真实含量为Cx实验值为实验值为C1，在样品中增加已知量，在样品中增加已知量b时，测得实验时，测得实验值为值为C2，实验过程系统误差为，实验过程系统误差为k则：则：必要条件是当被测组分含量的变化时必要条件是当被测组分含量的变化时K不随不随其改变。其改变。4.2.4多组分混合物分析法多组分混合物分析法当样品溶液中含有二种以上组分时，由于组当样品溶液中含有二种以上组分时，由于组分之间吸收峰相互干扰情况不同，计算方分之间吸收峰相互干扰情况不同，计算方式也有所不同。式也有所不同。 吸收光谱不重叠吸收光谱不重叠吸收光谱不重叠吸收光谱不重叠 吸收光谱重叠吸收光谱重叠吸收光谱重叠吸收光谱重叠吸收光谱不重叠。吸收光谱不重叠。在在1处处B无吸收，在无吸收，在2处处A无吸收，所以可无吸收，所以可分别在分别在1及及2处测定组分处测定组分A和和B的浓反，直的浓反，直接应用比尔定律计算。接应用比尔定律计算。吸收光谱重叠吸收光谱重叠如果二组分各自的吸收光谱互相重叠，则如果二组分各自的吸收光谱互相重叠，则混合物的吸收光谱为二组分各自吸收光谱混合物的吸收光谱为二组分各自吸收光谱的加和，则可根据吸光度的加合性求解联的加和，则可根据吸光度的加合性求解联立方程组得出各组分的含量。立方程组得出各组分的含量。A1 1=a1 1bca+b1 1bcbA2 2=a2 2bca+b2 2bcb 4.2.5双波长分光光度法双波长分光光度法不需空白溶液作参比；但需要两个单色器获得两束不需空白溶液作参比；但需要两个单色器获得两束不需空白溶液作参比；但需要两个单色器获得两束不需空白溶液作参比；但需要两个单色器获得两束单色光单色光单色光单色光( ( 1 1和和和和 2 2) )；以参比波长；以参比波长；以参比波长；以参比波长 1 1处的吸光度处的吸光度处的吸光度处的吸光度A A 1 1作为作为作为作为参比，来消除干扰。参比，来消除干扰。参比，来消除干扰。参比，来消除干扰。在分析浑浊或背景吸收较大的复杂试样时显示出很在分析浑浊或背景吸收较大的复杂试样时显示出很在分析浑浊或背景吸收较大的复杂试样时显示出很在分析浑浊或背景吸收较大的复杂试样时显示出很大的优越性。灵敏度、选择性、测量精密度等方面大的优越性。灵敏度、选择性、测量精密度等方面大的优越性。灵敏度、选择性、测量精密度等方面大的优越性。灵敏度、选择性、测量精密度等方面都比单波长法有所提高。都比单波长法有所提高。都比单波长法有所提高。都比单波长法有所提高。 A A A A 2 2 A A 1 1 ( ( 2 2 1 1) )b cb c两波长处测得的吸光度差值两波长处测得的吸光度差值两波长处测得的吸光度差值两波长处测得的吸光度差值AA与待测组分浓度成与待测组分浓度成与待测组分浓度成与待测组分浓度成正比。正比。正比。正比。 1 1和和和和 2 2分别表示待测组分在分别表示待测组分在分别表示待测组分在分别表示待测组分在 1 1和和和和 2 2处的摩尔处的摩尔处的摩尔处的摩尔吸光系数。吸光系数。吸光系数。吸光系数。双波长分光光度法双波长分光光度法双波长分光光度法双波长分光光度法 关键问题关键问题关键问题关键问题测量波长测量波长测量波长测量波长 2 2和参比波长和参比波长和参比波长和参比波长 1 1的选择与组合的选择与组合的选择与组合的选择与组合以两组分以两组分以两组分以两组分x x和和和和y y的双波长法测定为例：的双波长法测定为例：的双波长法测定为例：的双波长法测定为例：设：设：设：设：x x为待测组分，为待测组分，为待测组分，为待测组分，y y为干扰组分，二者的吸光度为干扰组分，二者的吸光度为干扰组分，二者的吸光度为干扰组分，二者的吸光度差分别为差分别为差分别为差分别为:AAx x和和和和AAy y。则该体系的总吸光度差则该体系的总吸光度差则该体系的总吸光度差则该体系的总吸光度差AAx+yx+y为：为：为：为： AAx+yx+y=A A x x+A A y y如何选择波长如何选择波长如何选择波长如何选择波长 1 1 、 2 2有一定的要求。有一定的要求。有一定的要求。有一定的要求。波长组合波长组合波长组合波长组合 1 1 、 2 2的基本要求是：的基本要求是：的基本要求是：的基本要求是： 选定的波长选定的波长选定的波长选定的波长 1 1和和和和 2 2处，干扰处，干扰处，干扰处，干扰组分应具有相同吸光度，即：组分应具有相同吸光度，即：组分应具有相同吸光度，即：组分应具有相同吸光度，即： AAy y=A A yy2 2-A A yy1 1=0=0故：故：故：故：AAx+yx+y=A A x x=(=( xx2 2- - xx1 1) )bcbcx x此时：测得的吸光度差此时：测得的吸光度差此时：测得的吸光度差此时：测得的吸光度差AA只与待测组分只与待测组分只与待测组分只与待测组分x x的浓度的浓度的浓度的浓度呈线性关系，而与干扰组分呈线性关系，而与干扰组分呈线性关系，而与干扰组分呈线性关系，而与干扰组分y y无关。若无关。若无关。若无关。若x x为干扰组为干扰组为干扰组为干扰组分，则也可用同样的方法测定分，则也可用同样的方法测定分，则也可用同样的方法测定分，则也可用同样的方法测定y y组分。组分。组分。组分。 在选定的两个波长在选定的两个波长在选定的两个波长在选定的两个波长 1 1和和和和 2 2处待测组分的吸光度应处待测组分的吸光度应处待测组分的吸光度应处待测组分的吸光度应具有足够大的差值。具有足够大的差值。具有足够大的差值。具有足够大的差值。采用作图法选择符合上述两个条件的波长组合采用作图法选择符合上述两个条件的波长组合采用作图法选择符合上述两个条件的波长组合采用作图法选择符合上述两个条件的波长组合。4.3分光光度法的具体应用分光光度法的具体应用4.3.1蛋白质测定蛋白质测定双缩脲法双缩脲法考马斯亮蓝考马斯亮蓝G250染色法染色法4.3.2核酸测定核酸测定4.3.3叶绿素的测定叶绿素的测定4.3.1蛋白质测定蛋白质测定蛋白质的分析是生物化学和其它生物学科、蛋白质的分析是生物化学和其它生物学科、食品检验、临床诊断等领域最常涉及到的食品检验、临床诊断等领域最常涉及到的分析检测手段。分析检测手段。由于蛋白质种类很多，分子组成、结构、分由于蛋白质种类很多，分子组成、结构、分子量差别很大，功能各异，因此分析蛋白子量差别很大，功能各异，因此分析蛋白质含且的方法很多，各有其持点。分光光质含且的方法很多，各有其持点。分光光度法是目前最常用的一种方法度法是目前最常用的一种方法(1)(1)双缩脲法双缩脲法双缩脲法双缩脲法利用双缩脲反应，蛋白质与二价铜离子在碱性溶液中形成利用双缩脲反应，蛋白质与二价铜离子在碱性溶液中形成利用双缩脲反应，蛋白质与二价铜离子在碱性溶液中形成利用双缩脲反应，蛋白质与二价铜离子在碱性溶液中形成紫色络合物，最大吸收波长在紫色络合物，最大吸收波长在紫色络合物，最大吸收波长在紫色络合物，最大吸收波长在540nm540nm，可测定含有，可测定含有，可测定含有，可测定含有10-120010-1200ug/mLug/mL蛋白质样品，标准曲线的线性关系和重复性好蛋白质样品，标准曲线的线性关系和重复性好蛋白质样品，标准曲线的线性关系和重复性好蛋白质样品，标准曲线的线性关系和重复性好双缩脲试剂：硫酸铜双缩脲试剂：硫酸铜双缩脲试剂：硫酸铜双缩脲试剂：硫酸铜1.5g1.5g，酒石酸钾钠，酒石酸钾钠，酒石酸钾钠，酒石酸钾钠6g6g，碘化钾，碘化钾，碘化钾，碘化钾1g1g，溶，溶，溶，溶于适量水，搅拌状态下加入于适量水，搅拌状态下加入于适量水，搅拌状态下加入于适量水，搅拌状态下加入300mL10300mL10氢氧化钠溶液，用氢氧化钠溶液，用氢氧化钠溶液，用氢氧化钠溶液，用水稀释至水稀释至水稀释至水稀释至1000mL1000mL，在塑料瓶中贮存，在塑料瓶中贮存，在塑料瓶中贮存，在塑料瓶中贮存标淮曲线绘制及样品测定：在试管中分别加入标淮曲线绘制及样品测定：在试管中分别加入标淮曲线绘制及样品测定：在试管中分别加入标淮曲线绘制及样品测定：在试管中分别加入0.00.0，0.10.1，0.20.2，0.30.3、0.40.4，0.50.5，0.6mL0.6mL标准蛋白液，用水补足到标准蛋白液，用水补足到标准蛋白液，用水补足到标准蛋白液，用水补足到0.6ml0.6ml，另取一份，另取一份，另取一份，另取一份0.6mL0.6mL样品，上述溶液中分别加入样品，上述溶液中分别加入样品，上述溶液中分别加入样品，上述溶液中分别加入2.4mL2.4mL双缩脲双缩脲双缩脲双缩脲试剂，混均后室温放置试剂，混均后室温放置试剂，混均后室温放置试剂，混均后室温放置15min15min，540nm540nm处测定处测定处测定处测定(2)(2)考马斯亮蓝考马斯亮蓝考马斯亮蓝考马斯亮蓝G250G250染色法染色法染色法染色法考马斯亮蓝考马斯亮蓝考马斯亮蓝考马斯亮蓝G250G250，在酸性溶液中为棕红色，它和蛋白质通，在酸性溶液中为棕红色，它和蛋白质通，在酸性溶液中为棕红色，它和蛋白质通，在酸性溶液中为棕红色，它和蛋白质通过疏水作用结合后产生颜色反应呈蓝色。过疏水作用结合后产生颜色反应呈蓝色。过疏水作用结合后产生颜色反应呈蓝色。过疏水作用结合后产生颜色反应呈蓝色。在在在在595nm595nm处有最大光吸收，在一定的范围内，蛋白质含量处有最大光吸收，在一定的范围内，蛋白质含量处有最大光吸收，在一定的范围内，蛋白质含量处有最大光吸收，在一定的范围内，蛋白质含量与与与与595nm595nm的吸收值成正比，测定蛋白质浓度范围为的吸收值成正比，测定蛋白质浓度范围为的吸收值成正比，测定蛋白质浓度范围为的吸收值成正比，测定蛋白质浓度范围为l- l-140ug/mL140ug/mL，几乎无测定干扰，灵敏度较高。，几乎无测定干扰，灵敏度较高。，几乎无测定干扰，灵敏度较高。，几乎无测定干扰，灵敏度较高。配制显色剂：将配制显色剂：将配制显色剂：将配制显色剂：将100mg100mg考马斯亮蓝考马斯亮蓝考马斯亮蓝考马斯亮蓝G250G250溶解于溶解于溶解于溶解于50mL9550mL95的乙醇中。加入的乙醇中。加入的乙醇中。加入的乙醇中。加入100mL85100mL85的磷酸，加水稀释至的磷酸，加水稀释至的磷酸，加水稀释至的磷酸，加水稀释至1L1L。 配制标准蛋白溶液：在试管中分别加入含配制标准蛋白溶液：在试管中分别加入含配制标准蛋白溶液：在试管中分别加入含配制标准蛋白溶液：在试管中分别加入含0 0，1010，2020，3030，4040，5050，60ug60ug的标准蛋白质，加水至的标准蛋白质，加水至的标准蛋白质，加水至的标准蛋白质，加水至60uL60uL加加加加3mL3mL染色染色染色染色液，另取样品液也加液，另取样品液也加液，另取样品液也加液，另取样品液也加3mL3mL染色液，混匀后室温放置染色液，混匀后室温放置染色液，混匀后室温放置染色液，混匀后室温放置15min15min。595nm595nm处测定。处测定。处测定。处测定。4.3.2核酸测定核酸测定由于核酸和蛋白质通常由于核酸和蛋白质通常(结合在一起结合在一起)以核蛋以核蛋白的形式存在，所以在提纯核酸的过程中白的形式存在，所以在提纯核酸的过程中要测定其中蛋白质杂质的含量。要测定其中蛋白质杂质的含量。通过两个波长通过两个波长(260nm/280nm)的吸收读数比的吸收读数比率和空白的校正，即可估算核酸的纯度。率和空白的校正，即可估算核酸的纯度。DNA比值为比值为1.8，RNA比值为比值为2.0。对核酸来说，对核酸来说，260nm/280nm的比值越小，说的比值越小，说明蛋白杂质越多，两个波长吸收比率小于所明蛋白杂质越多，两个波长吸收比率小于所规定的最小值，则核酸纯度不符合要求。规定的最小值，则核酸纯度不符合要求。常涉及到用于测定核酸样品的波长有常涉及到用于测定核酸样品的波长有常涉及到用于测定核酸样品的波长有常涉及到用于测定核酸样品的波长有4 4个个个个 230nm230nm，肽键的吸收波长，用此波长检测蛋白质的，肽键的吸收波长，用此波长检测蛋白质的，肽键的吸收波长，用此波长检测蛋白质的，肽键的吸收波长，用此波长检测蛋白质的含量比含量比含量比含量比280nm280nm处更灵敏但常用缓冲液处更灵敏但常用缓冲液处更灵敏但常用缓冲液处更灵敏但常用缓冲液( (如如如如TrisTris等等等等) )对对对对测定有干扰。测定有干扰。测定有干扰。测定有干扰。280nm280nm，蛋白质中芳香族氨基鼓的吸收波长，由于，蛋白质中芳香族氨基鼓的吸收波长，由于，蛋白质中芳香族氨基鼓的吸收波长，由于，蛋白质中芳香族氨基鼓的吸收波长，由于干扰少，经常使用。干扰少，经常使用。干扰少，经常使用。干扰少，经常使用。260nm260nm，大多数单核苷酸的最大吸收波长均在，大多数单核苷酸的最大吸收波长均在，大多数单核苷酸的最大吸收波长均在，大多数单核苷酸的最大吸收波长均在260nm260nm附近，用来检测核酸的含量。附近，用来检测核酸的含量。附近，用来检测核酸的含量。附近，用来检测核酸的含量。320nm320nm，用于本底校正，核酸和蛋白质在此波长下，用于本底校正，核酸和蛋白质在此波长下，用于本底校正，核酸和蛋白质在此波长下，用于本底校正，核酸和蛋白质在此波长下无吸收，一些干扰因素（如散射光）可产生吸收。无吸收，一些干扰因素（如散射光）可产生吸收。无吸收，一些干扰因素（如散射光）可产生吸收。无吸收，一些干扰因素（如散射光）可产生吸收。为使用方便起见，将上述为使用方便起见，将上述为使用方便起见，将上述为使用方便起见，将上述4 4种波长按不同组合编成四种波长按不同组合编成四种波长按不同组合编成四种波长按不同组合编成四个固定的指定参数方法。个固定的指定参数方法。个固定的指定参数方法。个固定的指定参数方法。核酸测定的四种指定的参数法：核酸测定的四种指定的参数法：(1)测定测定260nm/280nm及及280nm/260nm的比率。的比率。(2)测定测定260nm/280nm及及280nm/260nm的比率，的比率，背景校正波长背景校正波长320nm。(3)测定测定230nm/280nm及及260nm/230nm的比率，的比率，背景校正波长背景校正波长320nm。(4)测定测定260nm/280nm及及280nm/260nm的比率，的比率，用用Warburg和和Christian系数计算蛋白质和核系数计算蛋白质和核酸浓度。酸浓度。核酸中的嘌呤、嘧啶、蛋白质中的酪氨酸、核酸中的嘌呤、嘧啶、蛋白质中的酪氨酸、色氨酸都有共轭双键，分别在波长色氨酸都有共轭双键，分别在波长260nm、280nm处有紫外吸收。处有紫外吸收。由于各种核酸、蛋白的差异很大，为了更由于各种核酸、蛋白的差异很大，为了更准确的测定核酸和蛋白质的浓度，用经典准确的测定核酸和蛋白质的浓度，用经典浓度公式，即浓度公式，即Warburg和和Christian浓度公浓度公式测定核酸和蛋白质浓度式测定核酸和蛋白质浓度蛋白质蛋白质(ug/mL)1552A280757.3A260核酸（核酸（ug/mL）62.9A26036A2804.3.34.3.3叶绿素的测定叶绿素的测定叶绿素的测定叶绿素的测定将将将将2g2g鲜重叶片放在干净研钵内，加鲜重叶片放在干净研钵内，加鲜重叶片放在干净研钵内，加鲜重叶片放在干净研钵内，加40mL8040mL80丙丙丙丙酮，把组织研磨匀浆，研磨大约酮，把组织研磨匀浆，研磨大约酮，把组织研磨匀浆，研磨大约酮，把组织研磨匀浆，研磨大约3min3min，小心地把，小心地把，小心地把，小心地把绿色液体转移到一个垫有滤纸的漏斗内，当过滤绿色液体转移到一个垫有滤纸的漏斗内，当过滤绿色液体转移到一个垫有滤纸的漏斗内，当过滤绿色液体转移到一个垫有滤纸的漏斗内，当过滤提取液时提取液时提取液时提取液时( (抽滤抽滤抽滤抽滤) )，用另外，用另外，用另外，用另外30mL8030mL80丙酮重复研磨丙酮重复研磨丙酮重复研磨丙酮重复研磨所剩物成匀浆，所剩物成匀浆，所剩物成匀浆，所剩物成匀浆，3-4min3-4min之后，如前一样将第二次之后，如前一样将第二次之后，如前一样将第二次之后，如前一样将第二次提取液过滤到含第一次提取液的烧瓶里。提取液过滤到含第一次提取液的烧瓶里。提取液过滤到含第一次提取液的烧瓶里。提取液过滤到含第一次提取液的烧瓶里。最后用最后用最后用最后用8080丙酮将滤液定容至丙酮将滤液定容至丙酮将滤液定容至丙酮将滤液定容至100mL100mL。叶绿素有。叶绿素有。叶绿素有。叶绿素有叶绿素叶绿素叶绿素叶绿素a a和叶绿素和叶绿素和叶绿素和叶绿素b b，它们分别有持征吸收光谱。，它们分别有持征吸收光谱。，它们分别有持征吸收光谱。，它们分别有持征吸收光谱。在丙酮提取液中，叶绿素在丙酮提取液中，叶绿素在丙酮提取液中，叶绿素在丙酮提取液中，叶绿素a a在波长在波长在波长在波长663nm663nm；叶绿素；叶绿素；叶绿素；叶绿素b b在波长在波长在波长在波长645nm645nm有吸收蜂。有吸收蜂。有吸收蜂。有吸收蜂。式中式中式中式中C Ca a、C Cb b分别为叶绿素分别为叶绿素分别为叶绿素分别为叶绿素a a及叶绿素及叶绿素及叶绿素及叶绿素b b的浓度，为的浓度，为的浓度，为的浓度，为了便于区别用了便于区别用了便于区别用了便于区别用d d代表光径。代表光径。代表光径。代表光径。当当当当d=1.0cmd=1.0cm，C C取取取取mg/mg/mLmL为单位时，其为单位时，其为单位时，其为单位时，其 值已由实值已由实值已由实值已由实验测定，分别为：验测定，分别为：验测定，分别为：验测定，分别为： a a1 1=82.09=82.09b b1 1=9.24=9.24a a2 2=16.75=16.75b b2 2=45.6=45.6叶绿素提取液的消光度在两种波长下分别为叶绿素提取液的消光度在两种波长下分别为叶绿素提取液的消光度在两种波长下分别为叶绿素提取液的消光度在两种波长下分别为A1A1及及及及A2A2，它们可写为：，它们可写为：，它们可写为：，它们可写为：可得到每克叶片中所含叶绿素的毫克数可得到每克叶片中所含叶绿素的毫克数可得到每克叶片中所含叶绿素的毫克数可得到每克叶片中所含叶绿素的毫克数: : : :WW为叶片的鲜重、单位为克为叶片的鲜重、单位为克为叶片的鲜重、单位为克为叶片的鲜重、单位为克V V是是是是8080丙酮丙酮丙酮丙酮- -叶绿叶绿叶绿叶绿素提取液的最终体积，单位为毫升测量时以素提取液的最终体积，单位为毫升测量时以素提取液的最终体积，单位为毫升测量时以素提取液的最终体积，单位为毫升测量时以8080丙酮为空白对照，比色池的光径为丙酮为空白对照，比色池的光径为丙酮为空白对照，比色池的光径为丙酮为空白对照，比色池的光径为10mm10mm。另外，叶绿素另外，叶绿素另外，叶绿素另外，叶绿素a a、b b的等吸收点在的等吸收点在的等吸收点在的等吸收点在652nm652nm，故可在，故可在，故可在，故可在652nm652nm测定。测定。测定。测定。4.3.4酶动力学研究酶动力学研究分光光度法是酶动力学研究最有效的工具。分光光度法是酶动力学研究最有效的工具。通过酶促反应动力学的研究，有助于了解酶通过酶促反应动力学的研究，有助于了解酶与底物的结合机制和作用方式、酶的底物与底物的结合机制和作用方式、酶的底物浓度与酶促反应速度的关系符合米氏理论。浓度与酶促反应速度的关系符合米氏理论。第五节第五节原子吸收分光光度法原子吸收分光光度法1802年，发现原子吸收现象：原子蒸气对其年，发现原子吸收现象：原子蒸气对其原子共振辐射吸收的现象；原子共振辐射吸收的现象；1955年，澳大利亚物理学家年，澳大利亚物理学家WalshA（瓦尔（瓦尔西）发表了著名论文：西）发表了著名论文：原子吸收光谱法在原子吸收光谱法在分析化学中的应用分析化学中的应用，奠定了原子吸收光谱，奠定了原子吸收光谱法的基础，之后迅速发展。法的基础，之后迅速发展。原子吸收光谱法特点：原子吸收光谱法特点：(1)检出限低，检出限低，10-1010-14g；(2)准确度高，误差在准确度高，误差在1%5%；(3)选择性高，一般情况下共存元素不干扰；选择性高，一般情况下共存元素不干扰；(4)应用广，可测定各种样品中应用广，可测定各种样品中70多个元素。多个元素。原子吸收光谱法原子吸收光谱法局限性：局限性：(1)难熔元素、非金属元素测定困难难熔元素、非金属元素测定困难(2)不能同时多元素不能同时多元素第六节第六节荧光分析法荧光分析法某些物质经紫外线照射后，能立即放出能量较低某些物质经紫外线照射后，能立即放出能量较低某些物质经紫外线照射后，能立即放出能量较低某些物质经紫外线照射后，能立即放出能量较低（亦即波长较长）的光。（亦即波长较长）的光。（亦即波长较长）的光。（亦即波长较长）的光。 当照射停止后，如化合物的发射在当照射停止后，如化合物的发射在当照射停止后，如化合物的发射在当照射停止后，如化合物的发射在1010-9-9秒钟内停止，秒钟内停止，秒钟内停止，秒钟内停止，则称荧光则称荧光则称荧光则称荧光超过此限度即称为磷光。超过此限度即称为磷光。超过此限度即称为磷光。超过此限度即称为磷光。 荧光的波长与被照射物质有关。以紫外线作激发荧光的波长与被照射物质有关。以紫外线作激发荧光的波长与被照射物质有关。以紫外线作激发荧光的波长与被照射物质有关。以紫外线作激发光源，所发射的荧光常在可见光区。光源，所发射的荧光常在可见光区。光源，所发射的荧光常在可见光区。光源，所发射的荧光常在可见光区。测量荧光强度以确定物质含量的方法叫做荧光分测量荧光强度以确定物质含量的方法叫做荧光分测量荧光强度以确定物质含量的方法叫做荧光分测量荧光强度以确定物质含量的方法叫做荧光分析法，所使用的仪器叫荧光计。析法，所使用的仪器叫荧光计。析法，所使用的仪器叫荧光计。析法，所使用的仪器叫荧光计。6.1原理原理设设IF为荧光强度；为荧光强度；I0入射紫外线强度；入射紫外线强度；It为透过溶液后紫外线强度；为透过溶液后紫外线强度；Ia为溶液吸收紫外线；为溶液吸收紫外线；则：则：Ia=I0-ItC为溶液中被测物质的浓度；为溶液中被测物质的浓度；l为溶液层的厚度。为溶液层的厚度。据朗伯据朗伯-比尔定律比尔定律A A= lc lc经数学推导，当浓度很小时：经数学推导，当浓度很小时：经数学推导，当浓度很小时：经数学推导，当浓度很小时：又又又又 I Ia a= =I I0 0- -I It t，则，则，则，则荧光强度荧光强度IF与物质吸收紫外线的强度成正比与物质吸收紫外线的强度成正比当紫外线的强度一定，溶液的厚度一定，对同当紫外线的强度一定，溶液的厚度一定，对同一物质而言一物质而言2.3KI0l为常数，以为常数，以A表示，故表示，故:IF=AC这说明浓度与荧光强度成正比，这就是荧光这说明浓度与荧光强度成正比，这就是荧光定量分析的理论基础。定量分析的理论基础。只要测出样品溶液的荧光强度和标准溶液只要测出样品溶液的荧光强度和标准溶液的荧光强度，就可按正比关系计算样品溶的荧光强度，就可按正比关系计算样品溶液的浓度。液的浓度。CX为样品溶液浓度为样品溶液浓度CS为标准溶液浓度为标准溶液浓度IFX为样品溶液荧光强度为样品溶液荧光强度IFS为标准溶液荧光强度为标准溶液荧光强度6.2荧光计荧光计荧光分析中有两种光线：紫外线和荧光。荧光分析中有两种光线：紫外线和荧光。在比色计中光源、比色杯和光电源三者排列在比色计中光源、比色杯和光电源三者排列成一条直线。成一条直线。在荧光计中三者需排成三角形，通常呈直角在荧光计中三者需排成三角形，通常呈直角三角形，如图。三角形，如图。比色计与荧光计两种装置不同点之二比色计与荧光计两种装置不同点之二比色计中光源是普通的钨丝灯。比色计中光源是普通的钨丝灯。荧光计中的光源则必须是产生紫外线的汞灯，荧光计中的光源则必须是产生紫外线的汞灯，常用的是高压汞灯，发射的是线状光谱；能常用的是高压汞灯，发射的是线状光谱；能透过汞灯玻璃套管的主要射线波长是透过汞灯玻璃套管的主要射线波长是365nm。比色计与荧光计两种装置不同点之三比色计与荧光计两种装置不同点之三比色计中只有一种光源，只需要一个滤光板比色计中只有一种光源，只需要一个滤光板荧光计中有两种辐射、三个滤光板荧光计中有两种辐射、三个滤光板:滤光板滤光板滤光板滤光板1 1用于过滤紫外线，除去其中可见光用于过滤紫外线，除去其中可见光用于过滤紫外线，除去其中可见光用于过滤紫外线，除去其中可见光滤光板滤光板滤光板滤光板2 2用于过滤荧光，以去除其他颜色的杂光；用于过滤荧光，以去除其他颜色的杂光；用于过滤荧光，以去除其他颜色的杂光；用于过滤荧光，以去除其他颜色的杂光；滤光板滤光板滤光板滤光板3 3可滤去荧光中夹杂的紫外线可滤去荧光中夹杂的紫外线可滤去荧光中夹杂的紫外线可滤去荧光中夹杂的紫外线6.3荧光分析的操作荧光分析的操作6.3.1标准曲线法标准曲线法先配制一第列浓度由大到小的标准管先配制一第列浓度由大到小的标准管C1，C2、C3、，C1为浓度最大的标准管为浓度最大的标准管作为起始浓度，置荧光计透光率为作为起始浓度，置荧光计透光率为100，调节光栅使检流计指零。调节光栅使检流计指零。然后再测一系列浓度较低的标准管的透光然后再测一系列浓度较低的标准管的透光率，以浓度对透光率作标准曲线。率，以浓度对透光率作标准曲线。6.3.1标准曲线法标准曲线法标准曲线的另一作法是以空白溶液为起始浓标准曲线的另一作法是以空白溶液为起始浓度，置荧光计透光率于度，置荧光计透光率于10或或20处，调节光栅处，调节光栅使检流计指零。使检流计指零。然后再测一系列浓度较高的标准管的透光率，然后再测一系列浓度较高的标准管的透光率，作出标准曲线。作出标准曲线。6.3.26.3.2比较法比较法比较法比较法先配一标准溶液，其浓度应略大于样品溶液，浓先配一标准溶液，其浓度应略大于样品溶液，浓先配一标准溶液，其浓度应略大于样品溶液，浓先配一标准溶液，其浓度应略大于样品溶液，浓度越接近，误差越小。度越接近，误差越小。度越接近，误差越小。度越接近，误差越小。以此标准溶液为准，调节透光率在以此标准溶液为准，调节透光率在以此标准溶液为准，调节透光率在以此标准溶液为准，调节透光率在20602060之间的某之间的某之间的某之间的某一数值上。一数值上。一数值上。一数值上。然后测定样品溶液及空白溶液的透光率。然后测定样品溶液及空白溶液的透光率。然后测定样品溶液及空白溶液的透光率。然后测定样品溶液及空白溶液的透光率。由下式求得由下式求得由下式求得由下式求得: : C C标准标准标准标准透光率为透光率为透光率为透光率为6060；C C样品样品样品样品的透光率为的透光率为的透光率为的透光率为X X；空白溶液的透光率为空白溶液的透光率为空白溶液的透光率为空白溶液的透光率为Y Y 6.4荧光分析的注意事项荧光分析的注意事项6.4.1荧光的减退荧光的减退荧光物质经紫外线长时间照射及空气荧光物质经紫外线长时间照射及空气的氧化作用，会使荧光逐渐减退的氧化作用，会使荧光逐渐减退.6.4.2试剂的浓度试剂的浓度有些试剂能吸收紫外线，有颜色的试有些试剂能吸收紫外线，有颜色的试剂还有吸收荧光的作用，因此分析时剂还有吸收荧光的作用，因此分析时所加试剂的量不可太多所加试剂的量不可太多。6.4.3pH的影响的影响大多数荧光反应都受溶液酸碱度的影响，故大多数荧光反应都受溶液酸碱度的影响，故荧光分析需在适合的酸碱度溶液中进行。荧光分析需在适合的酸碱度溶液中进行。最适当的酸碱度必须由实验来确定。最适当的酸碱度必须由实验来确定。所用酸的种类也影响荧光的强度，例如，奎所用酸的种类也影响荧光的强度，例如，奎宁在硫酸溶液中的荧光较在盐酸中的要强些。宁在硫酸溶液中的荧光较在盐酸中的要强些。6.4.4溶剂溶剂许多有机物及金属的有机络合物，在乙醇溶许多有机物及金属的有机络合物，在乙醇溶液中的荧光比在水溶液中强。乙醇、甘油、液中的荧光比在水溶液中强。乙醇、甘油、丙酮、氯仿及苯都是常用的溶剂。丙酮、氯仿及苯都是常用的溶剂。荧光分析所用的有机试剂，在有机溶剂中大荧光分析所用的有机试剂，在有机溶剂中大多有荧光，应设法避免；一般避免的办法是多有荧光，应设法避免；一般避免的办法是稀释，或加入一部分水。稀释，或加入一部分水。6.4.5盐类的影响盐类的影响能与试剂发生反应的其他金属盐类都应事先能与试剂发生反应的其他金属盐类都应事先除去。除去。碱金属与铵盐虽不参与反应，但量太大亦有碱金属与铵盐虽不参与反应，但量太大亦有妨碍。妨碍。强氧化剂、还原剂及络合剂均不应存在于溶强氧化剂、还原剂及络合剂均不应存在于溶液中。液中。6.4.6荧光强度达到峰值的时间不同荧光强度达到峰值的时间不同有的反应加入试剂后立即达到最高峰。有的反应加入试剂后立即达到最高峰。有的反应需要经过有的反应需要经过1530min达到最高峰。达到最高峰。6.4.7其他影响其他影响有机溶剂中常有产生荧光的杂质，可用蒸馏有机溶剂中常有产生荧光的杂质，可用蒸馏法提纯。法提纯。橡皮塞、软木塞及滤纸中也常有能溶于溶剂橡皮塞、软木塞及滤纸中也常有能溶于溶剂的一些带荧光的物质。的一些带荧光的物质。6.5荧光分析法优点小结荧光分析法优点小结灵敏度高灵敏度高仪器设备相对简单，休积小仪器设备相对简单，休积小操作较简便操作较简便反应时间也较快反应时间也较快 第七节第七节散射光谱分析法散射光谱分析法 光线通过溶液混悬颗粒后的光吸收光线通过溶液混悬颗粒后的光吸收或光散射程度的一类定量方法。或光散射程度的一类定量方法。