第三章第三章工业菌种的选育及改进工业菌种的选育及改进工业菌种的选育及改进课件尽管生产菌种最初均是来自于自然界，但尽管生产菌种最初均是来自于自然界，但天然菌种的生产天然菌种的生产性能一般比较低下性能一般比较低下。2020世纪世纪4040年代抗生素工业的兴起，推年代抗生素工业的兴起，推动了微生物遗传学的快速发展，也为微生物发酵工业优良动了微生物遗传学的快速发展，也为微生物发酵工业优良菌种的人工选育奠定了理论基础。菌种的人工选育奠定了理论基础。优良菌种的选育为生产提供了各种类型的突变株，大幅度优良菌种的选育为生产提供了各种类型的突变株，大幅度提高了菌种产生有利用价值代谢产物的水平，还可以改进提高了菌种产生有利用价值代谢产物的水平，还可以改进产品质量，去除不需要的代谢产物或产生新的代谢产物。产品质量，去除不需要的代谢产物或产生新的代谢产物。特别是基因工程、细胞工程和蛋白质工程等较为定向技术特别是基因工程、细胞工程和蛋白质工程等较为定向技术的发展，使菌种选育技术不断更新，而研制出众多有价值的发展，使菌种选育技术不断更新，而研制出众多有价值的微生物工程产品。的微生物工程产品。自然选育、诱变选育、抗噬菌体菌种的选育、杂交育种、自然选育、诱变选育、抗噬菌体菌种的选育、杂交育种、原生质体融合技术、基因工程技术等都被应用于生产菌种原生质体融合技术、基因工程技术等都被应用于生产菌种的选育。的选育。【Background】工业菌种的选育及改进课件提高菌种生产力的途径提高菌种生产力的途径：自然突变体的筛选自然突变体的筛选 （自然选育）（自然选育）诱导突变体的筛选（诱变育种）诱导突变体的筛选（诱变育种）杂交育种杂交育种原生质体融合原生质体融合基因克隆基因克隆通过遗传修饰通过遗传修饰工业菌种的选育及改进课件第一节第一节自然突变体的筛选（自然突变体的筛选（自然选育）自然选育） 不经人工处理，利用微生物的自发（然）突变进行菌种选不经人工处理，利用微生物的自发（然）突变进行菌种选育的过程称为育的过程称为自然选育自然选育(spontaneous mutation)(spontaneous mutation)。二、自发突变机制二、自发突变机制（一）自发突变的定义：（一）自发突变的定义：自发突变是指在没有人工参与下生物体自然发生的突变自发突变是指在没有人工参与下生物体自然发生的突变。 自发突变并不意味着这种突变没有原因，而只是说明我们自发突变并不意味着这种突变没有原因，而只是说明我们对它还没有很好的或很具体的认识而已。对它还没有很好的或很具体的认识而已。 一、自然选育的定义工业菌种的选育及改进课件1 1、 背景辐射和环境因素的诱变：背景辐射和环境因素的诱变： 不少不少“自发突变自发突变”实质上是由于一些实质上是由于一些原原因不详的低剂量诱变因素的长期综合诱变效因不详的低剂量诱变因素的长期综合诱变效应。应。 例如，充满宇宙的各种短波辐射或高温例如，充满宇宙的各种短波辐射或高温诱变效应，以及自然界中普遍存在的一些低诱变效应，以及自然界中普遍存在的一些低浓度的诱变物质（在微环境中有时也可能是浓度的诱变物质（在微环境中有时也可能是高浓度）的作用等。高浓度）的作用等。 （二）自发突变的机制（二）自发突变的机制工业菌种的选育及改进课件2 2、 微生物自身有害代谢产物的诱变效应：微生物自身有害代谢产物的诱变效应： 过氧化氢过氧化氢是普遍存在于微生物体内的一种代谢产物。是普遍存在于微生物体内的一种代谢产物。 过氧化氢对脉胞菌（过氧化氢对脉胞菌（NeurosporaNeurospora）有诱变作用，这）有诱变作用，这种作用可因同时加入种作用可因同时加入过氧化氢酶过氧化氢酶而降低；而降低； 如果在加入该酶的同时又加入如果在加入该酶的同时又加入酶抑制剂酶抑制剂(KCN)(KCN)，则又，则又可提高突变率。可提高突变率。 这就说明，过氧化氢很可能是这就说明，过氧化氢很可能是“自发突变自发突变”中的一中的一种种内源性诱变剂内源性诱变剂。 在许多微生物的在许多微生物的陈旧培养物陈旧培养物中易出现自发突变（剂）中易出现自发突变（剂），可能也是同样的原因。，可能也是同样的原因。工业菌种的选育及改进课件3 3、 互变异构效应：互变异构效应： 微生物的自发突变可由于本身微生物的自发突变可由于本身DNADNA在复制过程在复制过程中发生了中发生了酮式至烯醇式酮式至烯醇式（或（或氨基式至亚氨基式氨基式至亚氨基式）的互变异构效应而引起的。的互变异构效应而引起的。 因为因为A A、T T、G G、C C四种碱基的第六位上如果不四种碱基的第六位上如果不是酮基（是酮基（T T、G G），就是氨基（），就是氨基（C C、A A），所以有人），所以有人认为，认为，T T和和G G会以酮式或烯醇式两种互变异构的状会以酮式或烯醇式两种互变异构的状态出现，而态出现，而C C和和A A则会以氨基式或亚氨基式两种互则会以氨基式或亚氨基式两种互变异构的状态出现。变异构的状态出现。工业菌种的选育及改进课件第七章 微生物的遗传变异和育种第七章 微生物的遗传变异和育种图3.1 由5-BU引起的互变异构效应工业菌种的选育及改进课件A-TA-TA-TA-TG-TG-CA-T（酮式）（烯醇式）图3.2 胸腺嘧啶（T）在以酮式或烯醇式状态存在时引起碱基配对的变化工业菌种的选育及改进课件由于由于平衡一般趋向酮式或氨基式平衡一般趋向酮式或氨基式，因此在，因此在DNADNA双双链结构中一般总是以链结构中一般总是以A A：T T和和G G：C C碱基配对的形式碱基配对的形式出现出现; ;在偶然情况下，在偶然情况下，T T也会以稀有的也会以稀有的烯醇式形式烯醇式形式出现，出现，因此在因此在DNADNA复制到达这一位置的瞬间，通过复制到达这一位置的瞬间，通过DNADNA聚聚合酶合酶的作用，在它的相对位置上就不再出现常规的作用，在它的相对位置上就不再出现常规的的A A而是出现而是出现G G；同样，如果同样，如果C C以稀有的以稀有的亚氨基形式亚氨基形式出现在出现在DNADNA复制复制到达这一位置的刹那间，则在新合成到达这一位置的刹那间，则在新合成DNADNA单链的单链的与与C C相应的位置上就将是相应的位置上就将是A A，而不是往常的，而不是往常的G G。这。这或许就是发生相应的自发突变的原因或许就是发生相应的自发突变的原因. .工业菌种的选育及改进课件必须说明的是，由于在任何一瞬间，某一碱基必须说明的是，由于在任何一瞬间，某一碱基是处于酮式或烯醇式，还是氨基式或亚氨式状是处于酮式或烯醇式，还是氨基式或亚氨式状态，目前还无法预测，所以要预言在某一时间、态，目前还无法预测，所以要预言在某一时间、某一基因发生自发突变仍是不可能的。某一基因发生自发突变仍是不可能的。但是，人们在运用数学方法对这些偶发事件作但是，人们在运用数学方法对这些偶发事件作大量统计分析后，还是可以发现并掌握其中规大量统计分析后，还是可以发现并掌握其中规律的。例如，据统计，律的。例如，据统计，DNADNA链在每次复制中，链在每次复制中，每个碱基对错误配对的频率是每个碱基对错误配对的频率是1010-7-71010-11-11，而，而一个基因平均约含一个基因平均约含1000bp1000bp，故自发突变频率约，故自发突变频率约为为1010-6-6。工业菌种的选育及改进课件4 4、 环出效应：即环状突出效应环出效应：即环状突出效应 有人提出，在有人提出，在DNADNA的复制过程中，如果其中某一单链上偶然产生一小环，的复制过程中，如果其中某一单链上偶然产生一小环，则会因其上的基因越过复制而发生则会因其上的基因越过复制而发生遗传缺失遗传缺失，从而造成自发突变。，从而造成自发突变。 图图3.3环出效应环出效应在上链中，标记在上链中，标记B处发生处发生“环出环出”，故只有，故只有A及及C能获得复制，能获得复制，从而发生自发突变。而在下链中，则复制仍正常进行。从而发生自发突变。而在下链中，则复制仍正常进行。工业菌种的选育及改进课件5、转座效应、转座效应 转座作用的频率虽然仅为转座作用的频率虽然仅为1010-5-51010-7-7，但它却，但它却是一种自然界所固有的是一种自然界所固有的“自发基因工程自发基因工程”或或“内内源性基因工程源性基因工程”。工业菌种的选育及改进课件1）转座因子（）转座因子（transposableelement)定义：定义：位于染色体或质粒位于染色体或质粒上的一段能改变自身位置的上的一段能改变自身位置的DNA序列。广泛分布于原核和真核序列。广泛分布于原核和真核细胞中。细胞中。又称又称“跳跃基因跳跃基因”2）转座因子的特点转座因子的特点在转座时，通过转座因子的复制，可将新形成的拷贝以在转座时，通过转座因子的复制，可将新形成的拷贝以非同源非同源重组重组的方式转移到染色体的新部位上；的方式转移到染色体的新部位上； 都携带有编码转座酶的基因，该酶具有都携带有编码转座酶的基因，该酶具有转移位置转移位置的功能，是转的功能，是转座所必需的座所必需的;两端都有正向或反向两端都有正向或反向末端重复序列末端重复序列。 工业菌种的选育及改进课件(3)根据分子结构和遗传性质，转座因子可分为根据分子结构和遗传性质，转座因子可分为3类：类：插入序列（插入序列（Insertionsequence,IS）仅含有编码转座所必需的转座酶的基因，两端存在仅含有编码转座所必需的转座酶的基因，两端存在941bp的反的反向重复序列向重复序列 。但其插入可干扰基因的正常读码序列，导致基因失。但其插入可干扰基因的正常读码序列，导致基因失活或引起突变。活或引起突变。转座子（转座子（Transposon,Tn）除转座基因外，还有抗药性基因。分为除转座基因外，还有抗药性基因。分为复合转座子复合转座子和和复杂转座子复杂转座子Mu噬菌体噬菌体是以大肠杆菌为宿主的温和性噬菌体。它在几方面不同于另一是以大肠杆菌为宿主的温和性噬菌体。它在几方面不同于另一种温和噬菌体种温和噬菌体：第一、：第一、MuDNA几乎可以插入到宿主染色体的几乎可以插入到宿主染色体的任何一个位点上；第二、任何一个位点上；第二、DNA两端没有粘性末端；第三、会引两端没有粘性末端；第三、会引起宿主的被插入基因的基因突变。起宿主的被插入基因的基因突变。 工业菌种的选育及改进课件(4)转座的过程：转座的过程：由转座因子中基因编码的转座酶能由转座因子中基因编码的转座酶能识别受体识别受体DNA分子中的分子中的靶序列靶序列（3-12bp），它可先把靶序列切成两条单链，并使转座因子的一条链与），它可先把靶序列切成两条单链，并使转座因子的一条链与靶序列的一条链相连接，另一条链与靶序列相反一端的另一条链相连接。形成靶序列的一条链相连接，另一条链与靶序列相反一端的另一条链相连接。形成的单链缺口可经的单链缺口可经DNA多聚酶多聚酶I的作用而合成，再经的作用而合成，再经DNA连接酶连接酶的作用而缝合。的作用而缝合。于是，随着转座因子的插入就使靶序列得到了复制。于是，随着转座因子的插入就使靶序列得到了复制。工业菌种的选育及改进课件插入突变插入突变 (基因失活)染色体畸变染色体畸变(染色体的缺失染色体的缺失重复和倒位重复和倒位) 转座作用的频率虽然仅为转座作用的频率虽然仅为10-510-7，但它却是一种自然界，但它却是一种自然界所固有的所固有的“自发基因工程自发基因工程”或或“内源性基因工程内源性基因工程”。(5)转座的遗传学效应：转座的遗传学效应：工业菌种的选育及改进课件三、自然选育三、自然选育在工业生产上在工业生产上的意义的意义1、在工业生产上，由于各种条件因素的影响，、在工业生产上，由于各种条件因素的影响，自然突变是自然突变是经常发生的经常发生的，也造成了生产水平的波动，所以技术人员很，也造成了生产水平的波动，所以技术人员很注意从高生产水平的批次中，分离高生产力的菌种再用于注意从高生产水平的批次中，分离高生产力的菌种再用于生产。生产。2、自然变异可能会产生两种截然不同的结果自然变异可能会产生两种截然不同的结果，一种是菌种，一种是菌种退化而导致目标产物产量或质量下降；另一种是对生产有退化而导致目标产物产量或质量下降；另一种是对生产有益的突变。为了保证生产水平的稳定和提高，应经常的进益的突变。为了保证生产水平的稳定和提高，应经常的进行生产菌种自然选育，以淘汰退化的，选出优良的菌种。行生产菌种自然选育，以淘汰退化的，选出优良的菌种。3、经诱变或杂交选育获得的突变株，往往会继续发生变异经诱变或杂交选育获得的突变株，往往会继续发生变异，导致不同生产能力菌株的比例改变，这种情况下，自然选导致不同生产能力菌株的比例改变，这种情况下，自然选育可以有效地用于高性能突变株的分离。育可以有效地用于高性能突变株的分离。工业菌种的选育及改进课件四、自然选育的特点四、自然选育的特点自然选育是一种自然选育是一种简单易行的选育方法简单易行的选育方法，可，可以达到纯化菌种，防止菌种退化，稳定生以达到纯化菌种，防止菌种退化，稳定生产，提高产量的目的。产，提高产量的目的。自然选育的效率低自然选育的效率低，因此经常与诱变育种，因此经常与诱变育种交叉使用，以提高育种效率。交叉使用，以提高育种效率。 工业菌种的选育及改进课件五、自然选育的方法五、自然选育的方法自然选育的一般程序是将菌种制成菌自然选育的一般程序是将菌种制成菌悬液，用稀释法在固定平板上分离单菌落，悬液，用稀释法在固定平板上分离单菌落，再分别测定单菌落的生产能力，从中选出再分别测定单菌落的生产能力，从中选出高水平菌种。高水平菌种。工业菌种的选育及改进课件第二节第二节诱导突变体的筛选（诱导突变体的筛选（诱变育种）诱变育种）一、诱变育种在工业生产上的意义一、诱变育种在工业生产上的意义微生物在长期的进化过程中，形成了一套微生物在长期的进化过程中，形成了一套严密的严密的代谢调控机制代谢调控机制。其自身代谢过程是被严格调控的，。其自身代谢过程是被严格调控的，并且还存在着并且还存在着代谢产物的分解途径代谢产物的分解途径，所有的，所有的代谢代谢产物都不会过量积累产物都不会过量积累。因此从自然环境中分离的菌种的生产能力有限，因此从自然环境中分离的菌种的生产能力有限，一般不能满足生产的实际需要。诱变育种是提高一般不能满足生产的实际需要。诱变育种是提高菌种生产能力，使所需要的某一种特定的代谢产菌种生产能力，使所需要的某一种特定的代谢产物过量积累的有效方法之一。物过量积累的有效方法之一。 工业菌种的选育及改进课件二、诱变育种的原理二、诱变育种的原理诱变育种的理论基础是基因突变，突变主要包括染诱变育种的理论基础是基因突变，突变主要包括染色体畸变和基因突变两大类。色体畸变和基因突变两大类。染色体畸变是指染色体畸变是指染色体或染色体或DNADNA片段发生缺失、易位、片段发生缺失、易位、逆位、重复等。逆位、重复等。基因突变指的是基因突变指的是DNADNA中的中的碱基发生变化即点突变碱基发生变化即点突变。诱变育种就是利用各种被称为诱变剂的物理因素和诱变育种就是利用各种被称为诱变剂的物理因素和化学试剂处理微生物细胞，提高化学试剂处理微生物细胞，提高基因突变频率基因突变频率，再，再通过适当的筛选方法获得所需要的高产优质菌种的通过适当的筛选方法获得所需要的高产优质菌种的育种方法。育种方法。常用的诱变剂包括物理、化学和生物的三大类。常用的诱变剂包括物理、化学和生物的三大类。工业菌种的选育及改进课件第七章 微生物的遗传变异和育种第七章 微生物的遗传变异和育种表表3.1常用的各种诱变剂常用的各种诱变剂工业菌种的选育及改进课件二、诱变育种的基本方法二、诱变育种的基本方法 诱变育种一般包括诱变育种一般包括诱变诱变和和筛选筛选两个部分，两个部分，诱变部分成功的关键诱变部分成功的关键包括：包括： 出发菌株的选择、出发菌株的选择、 诱变剂种类和剂量的选择，诱变剂种类和剂量的选择， 合理的使用方法合理的使用方法。 筛选部分包括初筛和复筛来测定菌种的生筛选部分包括初筛和复筛来测定菌种的生产能力。产能力。 诱变育种是诱变和筛选过程的不断重复，诱变育种是诱变和筛选过程的不断重复，直到获得高产菌株。直到获得高产菌株。工业菌种的选育及改进课件1 1、 出发菌株的选择出发菌株的选择用来进行诱变的出发菌株性能对提高诱变效果和用来进行诱变的出发菌株性能对提高诱变效果和效率十分重要，选择出发菌株应注意，诱变出发效率十分重要，选择出发菌株应注意，诱变出发菌株要有一定的菌株要有一定的目标产物的生产能力目标产物的生产能力。其他生产性能如其他生产性能如: : 生产繁殖快生产繁殖快 营养要求低营养要求低 产孢子多且早产孢子多且早 对诱变剂敏感对诱变剂敏感( (变异幅度大变异幅度大) )还必须了解用作诱变的出发菌株的产量、形态、还必须了解用作诱变的出发菌株的产量、形态、生理等方面的情况。可选择已经经过诱变处理的生理等方面的情况。可选择已经经过诱变处理的菌株，因为这样的菌株对诱变剂的敏感性会有所菌株，因为这样的菌株对诱变剂的敏感性会有所提高。提高。工业菌种的选育及改进课件2 2、 诱变剂的使用方法诱变剂的使用方法 在微生物诱变育种中，诱变的方法有单一诱在微生物诱变育种中，诱变的方法有单一诱变剂处理和复合诱变剂处理。变剂处理和复合诱变剂处理。 对对野生菌株野生菌株单一诱变剂处理有时也能取得好单一诱变剂处理有时也能取得好的效果。的效果。 对经过多次诱变处理的对经过多次诱变处理的老菌种老菌种，单一诱变因，单一诱变因素重复处理效果甚微。可以采用复合诱变剂处理素重复处理效果甚微。可以采用复合诱变剂处理来提高诱变效果。来提高诱变效果。 工业菌种的选育及改进课件 复合诱变处理包括：复合诱变处理包括： 同一诱变剂多次处理同一诱变剂多次处理 两种以上诱变剂先后分别处理两种以上诱变剂先后分别处理 两种以上诱变剂同时或多次处理两种以上诱变剂同时或多次处理 例如，青霉菌的选育中先用不足以引例如，青霉菌的选育中先用不足以引起突变的氮芥短时处理，再用紫外线处理，起突变的氮芥短时处理，再用紫外线处理，可使诱变效率大大提高。可使诱变效率大大提高。工业菌种的选育及改进课件3 3、诱变剂的剂量选择、诱变剂的剂量选择对不同的微生物使用的剂量不同，对不同的微生物使用的剂量不同，诱变剂的剂量与致死率诱变剂的剂量与致死率有关，而致死率又与诱变率有一定的关系。有关，而致死率又与诱变率有一定的关系。因此可用致死因此可用致死率作为诱变剂剂量选择的依据。率作为诱变剂剂量选择的依据。一般来说，一般来说，诱变率随诱变剂剂量的增加而提高，但达到一诱变率随诱变剂剂量的增加而提高，但达到一定程度以后，再提高剂量反而使诱变率下降定程度以后，再提高剂量反而使诱变率下降。因此近年来。因此近年来已将处理剂量从过去的致死率已将处理剂量从过去的致死率99%-99.9%99%-99.9%降至降至70%-80%70%-80%，甚至更低。甚至更低。诱变剂剂量也不宜过低诱变剂剂量也不宜过低，高剂量诱变可导致一些细菌的细，高剂量诱变可导致一些细菌的细胞核发生变异，也可使另一些细胞核破坏，引起细胞死亡，胞核发生变异，也可使另一些细胞核破坏，引起细胞死亡，形成较纯的变异菌落。并且形成较纯的变异菌落。并且高剂量会引起细胞遗传物质发高剂量会引起细胞遗传物质发生难以恢复的巨大损伤，促使变异菌株稳定，不易产生回生难以恢复的巨大损伤，促使变异菌株稳定，不易产生回复突变。复突变。工业菌种的选育及改进课件三、突变菌株的筛选三、突变菌株的筛选诱变处理后，诱变处理后，正向突变的菌株通常为少数正向突变的菌株通常为少数，须进，须进行大量的筛选才能获得高产菌株。通过初筛和复行大量的筛选才能获得高产菌株。通过初筛和复筛后，还要经过筛后，还要经过发酵条件的优化研究发酵条件的优化研究，确定最佳，确定最佳的发酵条件，才能使高产菌株的生产能力充分发的发酵条件，才能使高产菌株的生产能力充分发挥出来。挥出来。经诱变后，菌种的性能有可能发生各种各样的变经诱变后，菌种的性能有可能发生各种各样的变异，如营养变异、抗性变异、代谢变异、形态变异，如营养变异、抗性变异、代谢变异、形态变异、生长繁殖变异和发酵温度变异等。这些变异异、生长繁殖变异和发酵温度变异等。这些变异的菌种可用各种方法筛选出来。的菌种可用各种方法筛选出来。工业菌种的选育及改进课件第三节第三节 杂交育种杂交育种一、概念：一、概念： 杂交育种的目的是将不同菌株的遗传物杂交育种的目的是将不同菌株的遗传物质进行交换、重组，使不同菌株的优良性质进行交换、重组，使不同菌株的优良性状集中在重组体中，克服长期诱变引起的状集中在重组体中，克服长期诱变引起的生活力下降等缺陷。生活力下降等缺陷。工业菌种的选育及改进课件 二、意义二、意义生产上，长期使用诱变剂处理，会使菌种的生活生产上，长期使用诱变剂处理，会使菌种的生活能力逐渐下降，如生长周期延长，孢子数量减少，能力逐渐下降，如生长周期延长，孢子数量减少，代谢速率减慢，产量增加缓慢，因此有必要利用代谢速率减慢，产量增加缓慢，因此有必要利用杂交育种的方法，提高菌种的生产能力。杂交育种的方法，提高菌种的生产能力。通过杂交还可以扩大变异范围，改变产品的产量通过杂交还可以扩大变异范围，改变产品的产量和质量，甚至创造出新品种。和质量，甚至创造出新品种。由于多数微生物（细菌、放线菌及霉菌中的半知由于多数微生物（细菌、放线菌及霉菌中的半知菌等）尚未发现菌等）尚未发现有性世代有性世代，因此直接亲本菌株应，因此直接亲本菌株应具有具有适当的遗传标记适当的遗传标记，如颜色、营养要求（即营，如颜色、营养要求（即营养缺陷标记）或抗药性等。养缺陷标记）或抗药性等。 工业菌种的选育及改进课件三、三、杂交育种应用杂交育种应用（一）真核微生物的有性杂交（一）真核微生物的有性杂交 1、 定义： 不同遗传型两性细胞间发生的接合和随之进行的染色体重组，进而产生新遗传型后代的一种育种技术。 凡能产有性孢子的酵母菌、霉菌，原则上都能应用与高等动、植物杂交育种相似的有性杂交方法进行育种。在真核微生物中，有的能产生在真核微生物中，有的能产生单倍体单倍体的有性孢子，的有性孢子，这类微生物和高等植物一样，能进行有性杂交，通过这类微生物和高等植物一样，能进行有性杂交，通过减数分裂细胞中的减数分裂细胞中的染色体变换和随机分配染色体变换和随机分配而导致基因而导致基因重组。重组。工业菌种的选育及改进课件2、酿酒酵母的有性杂交育种程序：酿酒酵母的有性杂交育种程序：两亲本菌株的选择两亲本菌株的选择单倍体细胞的分离与验证单倍体细胞的分离与验证单倍体细胞遗传标记的制作单倍体细胞遗传标记的制作杂交杂交杂合子的检出杂合子的检出优良性状个体的筛选与性能测试优良性状个体的筛选与性能测试工业菌种的选育及改进课件 过程过程 以以Sac.cerevisiaeSac.cerevisiae为例：为例：从自然界分离到的或在工业生产中应用的酵母，一从自然界分离到的或在工业生产中应用的酵母，一般都是其般都是其“2n”2n”细胞。将不同性状的细胞。将不同性状的A A、B B两个亲本两个亲本（2n2n）分别接种到产孢子培养基（如）分别接种到产孢子培养基（如CHCH3 3COONaCOONa培养培养基）斜面上，使其产生子囊，经减数分裂后，在每基）斜面上，使其产生子囊，经减数分裂后，在每个子囊内会产生四个单倍体的子囊孢子。个子囊内会产生四个单倍体的子囊孢子。用蒸馏水洗下子囊，经酶法（如蜗牛酶）破碎子囊，用蒸馏水洗下子囊，经酶法（如蜗牛酶）破碎子囊，再经离心后用获得的子囊孢子涂布平板，就可以得再经离心后用获得的子囊孢子涂布平板，就可以得到单倍体培养物。到单倍体培养物。把两个亲本的不同性别（把两个亲本的不同性别（“+”+”及及“-”-”）的单倍体）的单倍体细胞密集在一起就有更多机会出现种种双倍体的杂细胞密集在一起就有更多机会出现种种双倍体的杂交后代。它们的双倍体细胞和单倍体细胞有很大不交后代。它们的双倍体细胞和单倍体细胞有很大不同，易识别。同，易识别。工业菌种的选育及改进课件表表3.2Sac.cerevisiae的双倍体和单倍体细胞间的区别的双倍体和单倍体细胞间的区别双倍体双倍体单倍体单倍体细胞细胞大、椭圆形大、椭圆形小、球形小、球形菌落菌落大、形态均一大、形态均一小、形态多变小、形态多变液体培养液体培养繁殖较快，细胞较分散繁殖较快，细胞较分散繁殖较慢，细胞聚集成繁殖较慢，细胞聚集成团团在产孢子培养基上在产孢子培养基上形成子囊形成子囊不形成子囊不形成子囊工业菌种的选育及改进课件3、有性杂交应用、有性杂交应用工业菌种的选育及改进课件（二）细菌的杂交育种（二）细菌的杂交育种细菌的杂交可以通过细菌的转化、转导和接合、细菌的杂交可以通过细菌的转化、转导和接合、以及相关以及相关F F因子转导、因子转导、R R因子转移等方法促使基因因子转移等方法促使基因重组。在这些基因重组的过程中，并不涉及重组。在这些基因重组的过程中，并不涉及整个整个染色体组染色体组，所形成的都是，所形成的都是部分合子部分合子。在细菌接合中，将带有两个以上不同选择性遗传在细菌接合中，将带有两个以上不同选择性遗传标记的两个菌株进行杂交，如标记的两个菌株进行杂交，如A A+ +B B- -和和A A- -B B+ +，杂交中，杂交中会出现会出现A A+ +B B- -、A A- -B B+ +、A A+ +B B+ +和和A A- -B B- -这四种重组类型，这四种重组类型，为了获得原养型为了获得原养型A A+ +B B+ +，采用了排斥亲本，采用了排斥亲本A A+ +B B- -和和A A- -B B+ +，以及另一重组类型，以及另一重组类型A A- -B B- -，只允许原养型只允许原养型A A+ +B B+ +生长生长的培养条件，将杂交菌株筛选出来。的培养条件，将杂交菌株筛选出来。工业菌种的选育及改进课件一、一、概念概念。通过人为的方法，使遗传性状不同的两个细胞的原通过人为的方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体发生融合，并进而发生遗传重组以产生同时生质体发生融合，并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的、遗传性稳定的融合子（带有双亲性状的、遗传性稳定的融合子（FusantFusant）的过程，称的过程，称原生质体融合原生质体融合（protoplast fusionprotoplast fusion）。）。融合是继转化、转导和接合之后发展出来的一种更融合是继转化、转导和接合之后发展出来的一种更有效地转移遗传物质的手段。有效地转移遗传物质的手段。第四节第四节 原生质体融合技术原生质体融合技术工业菌种的选育及改进课件对微生物育种来说，有性重组的局限性很大，这对微生物育种来说，有性重组的局限性很大，这是因为是因为迄今发现有杂交现象的微生物并不多迄今发现有杂交现象的微生物并不多，这，这就妨碍了基因重组在微生物育种中的应用。就妨碍了基因重组在微生物育种中的应用。原生质体融合技术提供了充分利用遗传重组杂交原生质体融合技术提供了充分利用遗传重组杂交的方法。的方法。原生质体融合技术首先是在动植物细胞融合研究原生质体融合技术首先是在动植物细胞融合研究的基础上发展起来的，然后才应用于真菌、细菌的基础上发展起来的，然后才应用于真菌、细菌和放线菌。由于这一技术可以打破种属间的界限，和放线菌。由于这一技术可以打破种属间的界限，提高重组频率，扩大重组幅度，而倍受关注。提高重组频率，扩大重组幅度，而倍受关注。工业菌种的选育及改进课件二、二、意义：意义： 1 1、 是当前重要的育种手段之一（除基因克隆之外）是当前重要的育种手段之一（除基因克隆之外） 细胞原生质体融合促使育种工作发生了四个改变：细胞原生质体融合促使育种工作发生了四个改变： 低效低效高效；高效； 随机随机定向；定向； 不自觉不自觉自觉；自觉； 近缘杂交近缘杂交远缘杂交。远缘杂交。 原生质体融合的重组频率目前原生质体融合的重组频率目前最高可以达最高可以达1010-1-1以上以上，而诱变育种仅能达而诱变育种仅能达1010-6-6。 2 2、 为远缘杂交提供了一个重要手段（或途径）为远缘杂交提供了一个重要手段（或途径） 细胞融合现已越过种、属间，发展到科间或者更远细胞融合现已越过种、属间，发展到科间或者更远缘的微生物和高等生物间，可以获得更优良的新物种缘的微生物和高等生物间，可以获得更优良的新物种工业菌种的选育及改进课件三、三、 融合的范围融合的范围（或对象）（或对象）原核微生物原核微生物真核微生物真核微生物高等动、植物及人体的不同细胞高等动、植物及人体的不同细胞工业菌种的选育及改进课件四、四、细胞融合技术和方法的历史回顾细胞融合技术和方法的历史回顾 其发展经历了三个阶段：其发展经历了三个阶段：1 1、仙台病毒、仙台病毒（上世纪年代）：（上世纪年代）： 自自19551955年年OkadaOkada发现紫外灭活的仙台病毒可发现紫外灭活的仙台病毒可以诱导细胞融合以来，细胞融合技术得到了迅速以诱导细胞融合以来，细胞融合技术得到了迅速的发展与应用。由于灭活的仙台病毒诱导细胞融的发展与应用。由于灭活的仙台病毒诱导细胞融合存在着以下问题合存在着以下问题: :制备困难；制备困难；细胞融合率差别极大细胞融合率差别极大 所以从年起聚乙醇（）逐所以从年起聚乙醇（）逐渐代替了仙台病毒进行细胞融合。渐代替了仙台病毒进行细胞融合。工业菌种的选育及改进课件 2 2、（上世纪年代）：（上世纪年代）： 年起，英国的年起，英国的PeberdyPeberdy研究组在微生物方面研究组在微生物方面（尤其是真菌方面）做了大量理论研究和应用实践，证明（尤其是真菌方面）做了大量理论研究和应用实践，证明诱导真菌细胞杂交具有简便、快速和效率高等优点。诱导真菌细胞杂交具有简便、快速和效率高等优点。【问题问题】其一，诱导细胞融合的有效浓度是在一非常窄的其一，诱导细胞融合的有效浓度是在一非常窄的范围内，最适浓度是在，此时对细胞毒性范围内，最适浓度是在，此时对细胞毒性很大。很大。其二，诱导悬浮细胞融合效率要远低于诱导单层其二，诱导悬浮细胞融合效率要远低于诱导单层培养时同样细胞的融合率。培养时同样细胞的融合率。其三，诱导产生杂交细胞的频率仍在其三，诱导产生杂交细胞的频率仍在1010-5-5这一这一很低水平。很低水平。其四，不能在显微镜下观察细胞的融合过程。其四，不能在显微镜下观察细胞的融合过程。工业菌种的选育及改进课件 3 3、电融合、电融合（上世纪（上世纪8080年代）：年代）： 7070年代末和年代末和8080年代初以年代初以ZimmermannZimmermann和和NeumannNeumann等人率先等人率先采用了一种新的方法进行融合研究，称作采用了一种新的方法进行融合研究，称作“电融合技术电融合技术（electrofusion methodelectrofusion method）”。 8080年代初，年代初，ZinmermannZinmermann利用利用非均匀的高压电脉冲非均匀的高压电脉冲（变压变压电场电场）处理酵母菌，核配频率为）处理酵母菌，核配频率为510510-3-3，质配频率为，质配频率为1010-2-2。 至至8080年代末期，电融合技术一般采用年代末期，电融合技术一般采用均一的高压脉冲均一的高压脉冲（低电流）（低电流）作用于细胞悬液，并且细胞悬液不直接和两极接作用于细胞悬液，并且细胞悬液不直接和两极接触（例如美国触（例如美国BAEKON-2000BAEKON-2000，德国，德国eppendorfeppendorf产品）。产品）。工业菌种的选育及改进课件图3.4 细胞融合仪（左）及细胞融合模拟图（右）工业菌种的选育及改进课件【电融合在育种上的优点电融合在育种上的优点】 1 1）诱导产生杂交细胞的频率是）诱导产生杂交细胞的频率是PEGPEG的的100100倍，倍， 为为110110-3-3； 2 2）操作简便、快速；）操作简便、快速； 3 3）系物理刺激，不具有细胞毒性发生问题；）系物理刺激，不具有细胞毒性发生问题； 4 4）可用显微镜观察融合过程。）可用显微镜观察融合过程。工业菌种的选育及改进课件五、五、 融合方法与步骤融合方法与步骤： 1 1、遗传标记的选择、遗传标记的选择 （选择营养缺陷型或抗药性标记）（选择营养缺陷型或抗药性标记） 2 2、制备原生质体、制备原生质体 （需摸索的参数：酶的种类、酶源、酶浓、菌龄、渗透压稳定剂等因素（需摸索的参数：酶的种类、酶源、酶浓、菌龄、渗透压稳定剂等因素均会影响原生质体制备的效果）均会影响原生质体制备的效果） 3 3、融合：融合： PEG PEG（PEGPEG分子量、浓度、作用时间）分子量、浓度、作用时间） 电融合（脉冲电压电融合（脉冲电压/ /电流、两极间距、作用时间）电流、两极间距、作用时间） 4 4、融合子再生培养、融合子再生培养 （CMCM上再生。需摸索再生培养基的种类组成、再生时间和条件）上再生。需摸索再生培养基的种类组成、再生时间和条件） 5 5、融合子检出、融合子检出 （在（在MMMM上采用影印接种法检出或采用其他选择条件，如抗药性或改变上采用影印接种法检出或采用其他选择条件，如抗药性或改变 培养温度）培养温度） ， 6 6、筛选出优良性状的融合子、筛选出优良性状的融合子 （检测融合子的酶活或代谢物的表达）。（检测融合子的酶活或代谢物的表达）。工业菌种的选育及改进课件图3.5原生质体融合的操作示意图工业菌种的选育及改进课件工业菌种的选育及改进课件图图3.6用影印平板法检出营养缺陷型突变株用影印平板法检出营养缺陷型突变株工业菌种的选育及改进课件六、原生质体融合的优越性六、原生质体融合的优越性1 1、无供体和受体之分无供体和受体之分： 受受结合型结合型或或致育型致育型的限制小，两亲体没有供体和受的限制小，两亲体没有供体和受体之分，有利于不同种属微生物的杂交。体之分，有利于不同种属微生物的杂交。2 2、重组频率相对高重组频率相对高： 重组频率高于其他杂交方法。有报道，放线菌原生质重组频率高于其他杂交方法。有报道，放线菌原生质体融合频率达体融合频率达1010-2-2-10-10-1-1，丝状真菌达，丝状真菌达1010-3-3-10-10-2-2，细菌和，细菌和酵母也可达酵母也可达1010-6-6-10-10-5-5. .3 3、遗传物质传递充分与完善遗传物质传递充分与完善： 遗传物质的传递更加充分、完善，既有核配又有质遗传物质的传递更加充分、完善，既有核配又有质配。原核微生物可以有两个以上完整基因组融合的机会。配。原核微生物可以有两个以上完整基因组融合的机会。放线菌还能形成短暂的或拟双倍体，真菌中也能形成暂时放线菌还能形成短暂的或拟双倍体，真菌中也能形成暂时的或稳定的双倍体。的或稳定的双倍体。4 4、可钝化菌株提高筛选效率可钝化菌株提高筛选效率： 可以采用温度、药物、紫外线等处理钝化亲株的一可以采用温度、药物、紫外线等处理钝化亲株的一方或双方，然后使其融合，筛选再生重组子菌落，提高筛方或双方，然后使其融合，筛选再生重组子菌落，提高筛选效率。选效率。工业菌种的选育及改进课件七、原生质体融合的问题讨论七、原生质体融合的问题讨论1 1、融合效果的认可和确认（即发表论文的要求）：、融合效果的认可和确认（即发表论文的要求）： 必须做遗传分析，首先检测倍数是否加倍，要求测融合必须做遗传分析，首先检测倍数是否加倍，要求测融合后的细胞体积及重量、后的细胞体积及重量、DNADNA含量是否加倍；其次检测含量是否加倍；其次检测DNADNA上是上是否有基因结构和数量上的改变。否有基因结构和数量上的改变。2 2、有关融合效果保持的方法与技巧：、有关融合效果保持的方法与技巧： 鉴于融合二倍体存在着稳定性的问题（即有分离的风险）鉴于融合二倍体存在着稳定性的问题（即有分离的风险），可利用单倍体化试剂（如秋水仙素）促进融合子单倍体化，可利用单倍体化试剂（如秋水仙素）促进融合子单倍体化，使特定的优良性状长期保存。使特定的优良性状长期保存。3 3、减少了筛选工作量的方法与技巧：、减少了筛选工作量的方法与技巧： 利用加热、利用加热、UVUV处理灭活等手段，杀死一方标记的原生质处理灭活等手段，杀死一方标记的原生质体而进行融合，有利于融合后的菌种筛选，减少工作量。体而进行融合，有利于融合后的菌种筛选，减少工作量。4 4、遗传标记的获得问题：、遗传标记的获得问题： 如没有合适的遗传标记菌株，则要采用生物技术的若如没有合适的遗传标记菌株，则要采用生物技术的若干方法制备标记菌株，如筛选抗药性菌株，或人工诱变营养干方法制备标记菌株，如筛选抗药性菌株，或人工诱变营养缺陷型菌株。缺陷型菌株。工业菌种的选育及改进课件八、原生质体融合技术在微生物育种中的应用八、原生质体融合技术在微生物育种中的应用 由于目前应用于生产的菌种，大多数是经过由于目前应用于生产的菌种，大多数是经过反复诱变处理获得的，对许多诱变剂已经不敏感，反复诱变处理获得的，对许多诱变剂已经不敏感，效果也不明显。采用原生质体融合技术，获得了效果也不明显。采用原生质体融合技术，获得了不少有工业利用价值的菌株。不少有工业利用价值的菌株。工业菌种的选育及改进课件1 1、用于选育高产优质菌株、用于选育高产优质菌株应用（应用（1 1） 酿酒酵母可以利用葡萄糖生产酒精，但不能利用淀粉酿酒酵母可以利用葡萄糖生产酒精，但不能利用淀粉和糊精，糖化酵母能利用淀粉和糊精，将这两个菌株进行和糊精，糖化酵母能利用淀粉和糊精，将这两个菌株进行原生质体融合，可得到利用淀粉和糊精直接产生酒精的融原生质体融合，可得到利用淀粉和糊精直接产生酒精的融合子合子应用（应用（2)2) 产生蛋白酶的地衣芽孢杆菌对噬菌体敏感，很容易被产生蛋白酶的地衣芽孢杆菌对噬菌体敏感，很容易被噬菌体感染，将产蛋白酶对噬菌体敏感的菌株与抗噬菌体噬菌体感染，将产蛋白酶对噬菌体敏感的菌株与抗噬菌体菌株进行融合，获得了抗噬菌体的高产蛋白酶菌株。菌株进行融合，获得了抗噬菌体的高产蛋白酶菌株。工业菌种的选育及改进课件2 2、产生新的产物、产生新的产物有效的种间原生质体融合，有可能发生不同菌种有效的种间原生质体融合，有可能发生不同菌种的调节基因和结构基因的重组，诱发原处于抑制的调节基因和结构基因的重组，诱发原处于抑制状态的沉默基因的表达。特别是在抗生素产生菌状态的沉默基因的表达。特别是在抗生素产生菌中可以产生新的杂种抗生素。中可以产生新的杂种抗生素。例如，庆丰霉素产生菌和井冈霉素产生菌的原生例如，庆丰霉素产生菌和井冈霉素产生菌的原生质体种间融合，得到的重组子中有的产生聚醚类质体种间融合，得到的重组子中有的产生聚醚类抗生素，有的产生环状多肽类新的抗生素。抗生素，有的产生环状多肽类新的抗生素。工业菌种的选育及改进课件第五节第五节 基因克隆（基因工程技术）基因克隆（基因工程技术） 一、概念：一、概念：将外源将外源DNADNA通过体外重组后，导入受体细胞，使通过体外重组后，导入受体细胞，使其在受体细胞中复制、转录、翻译表达的技术称其在受体细胞中复制、转录、翻译表达的技术称为基因工程或为基因工程或DNADNA体外重组技术。体外重组技术。这项在微生物遗传学和分子生物学基础理论上发这项在微生物遗传学和分子生物学基础理论上发展起来的新兴技术，不仅是生命科学研究发展的展起来的新兴技术，不仅是生命科学研究发展的里程碑，也使现代生物技术产业发生了革命性的里程碑，也使现代生物技术产业发生了革命性的变化。变化。工业菌种的选育及改进课件二、发展历史二、发展历史19741974年，波依耳（年，波依耳（Boyer,USABoyer,USA）和科恩（）和科恩（CohenCohen）首次在实）首次在实验室中实现了基因转移（验室中实现了基因转移（gene transformgene transform），为基因工程），为基因工程（gene engineeringgene engineering）开启了通向现实的大门，从而使人）开启了通向现实的大门，从而使人有可能在实验室中组建有可能在实验室中组建按人们意志按人们意志设计出来的新生命体。设计出来的新生命体。这样我们就可以通过这些重组体的培养而这样我们就可以通过这些重组体的培养而“借腹怀胎借腹怀胎”地地获得所需要的目标产品。获得所需要的目标产品。此后，利用微生物细胞表达和生产了许多重组基因产物，此后，利用微生物细胞表达和生产了许多重组基因产物，包括受体细胞自身原有的和原来不能产生的各种物质。例包括受体细胞自身原有的和原来不能产生的各种物质。例如许多在疾病诊断、预防和治疗中有重要价值的内源生理如许多在疾病诊断、预防和治疗中有重要价值的内源生理活性物质作为药物已应用了多年，像治疗糖尿病的胰岛素，活性物质作为药物已应用了多年，像治疗糖尿病的胰岛素，治疗侏儒症的人生长激素、细胞因子、神经多肽、调节蛋治疗侏儒症的人生长激素、细胞因子、神经多肽、调节蛋白、酶类、凝血因子以及某些疫苗等。白、酶类、凝血因子以及某些疫苗等。工业菌种的选育及改进课件由于上述药物在传统制药工业制造过程中或是由于上述药物在传统制药工业制造过程中或是材料来源困难材料来源困难，或是或是制造技术问题制造技术问题，或是，或是造价过于昂贵造价过于昂贵，而无法大量生产并，而无法大量生产并在临床上广泛付诸应用。在临床上广泛付诸应用。然而利用微生物生长繁殖迅速，人工培养方便等特点，将重然而利用微生物生长繁殖迅速，人工培养方便等特点，将重组基因导入微生物细胞来生产这些生理活性物质，从根本上组基因导入微生物细胞来生产这些生理活性物质，从根本上解决了上述问题。解决了上述问题。19821982年第一个基因工程产品年第一个基因工程产品-人胰岛素在美国问世，吸引人胰岛素在美国问世，吸引和鼓励了大批科学家投身这一领域的研究和开发，获得了大和鼓励了大批科学家投身这一领域的研究和开发，获得了大批的成果，也产生了巨大的经济效益和社会效益。批的成果，也产生了巨大的经济效益和社会效益。工业菌种的选育及改进课件三、基因工程的基本操作步骤三、基因工程的基本操作步骤目的基因的取得（即外源基因或供体基因）目的基因的取得（即外源基因或供体基因）载体系统的选择载体系统的选择目的基因与载体基因的构建目的基因与载体基因的构建重组载体导入受体细胞重组载体导入受体细胞“工程菌工程菌”的表达、筛选及鉴定的表达、筛选及鉴定工程菌生产性试验及大规模生产工程菌生产性试验及大规模生产工业菌种的选育及改进课件第七章 微生物的遗传变异和育种第七章 微生物的遗传变异和育种图3.7 将目的基因克隆到大肠杆菌细胞中的操作步骤工业菌种的选育及改进课件（一）目的基因的取得（一）目的基因的取得取得具有生产意义的目的基因主要有取得具有生产意义的目的基因主要有3 3条途径：条途径：从适当的供体生物包括微生物、动物或植物中提从适当的供体生物包括微生物、动物或植物中提取；取；通过逆转录酶的作用，由通过逆转录酶的作用，由mRNAmRNA合成合成cDNAcDNA（complementary DNAcomplementary DNA，即互补，即互补DNADNA）；）；由化学合成方法合成有特定功能的目的基因由化学合成方法合成有特定功能的目的基因工业菌种的选育及改进课件（二）优良载体的选择（二）优良载体的选择基因工程使用的载体分为克隆载体和表达基因工程使用的载体分为克隆载体和表达载体。无论原核基因还是真核基因要在大载体。无论原核基因还是真核基因要在大肠杆菌中复制和表达，都必须将其与合适肠杆菌中复制和表达，都必须将其与合适的表达载体连接后导入宿主细菌，才能表的表达载体连接后导入宿主细菌，才能表达成蛋白质。达成蛋白质。工业菌种的选育及改进课件1 1、克隆载体、克隆载体 优良的克隆载体必须具备的条件：优良的克隆载体必须具备的条件：1 1）是一个具自我复制能力的复制子（）是一个具自我复制能力的复制子（repliconreplicon）；）；2 2）能在受体细胞内大量增殖；）能在受体细胞内大量增殖；3 3）载体上最好只有一个限制性内切核酸酶的切口，）载体上最好只有一个限制性内切核酸酶的切口，使目的基因能固定地整合到载体使目的基因能固定地整合到载体DNADNA的一定位置上；的一定位置上；4)4)其上必须有一种选择性遗传标记，以便及时高效其上必须有一种选择性遗传标记，以便及时高效地选择出工程菌。地选择出工程菌。工业菌种的选育及改进课件 2 2、表达载体、表达载体 表达载体必须具备以下条件：表达载体必须具备以下条件：1 1）应具有很强的启动子应具有很强的启动子，能被大肠杆菌的，能被大肠杆菌的RNARNA聚合酶识别。聚合酶识别。 【启动子是指在一条启动子是指在一条DNADNA链内，在转录起始期间可以被链内，在转录起始期间可以被RNARNA聚合聚合酶识别并结合的一段酶识别并结合的一段DNADNA序列。转录起始位点通常在启动子序序列。转录起始位点通常在启动子序列内。列内。】2 2）应具有使启动子受到抑制的阻遏子应具有使启动子受到抑制的阻遏子，只有在受到诱导时才能进，只有在受到诱导时才能进行转录。行转录。 因外源基因的高效表达往往会抑制宿主细胞的生长、增值，因外源基因的高效表达往往会抑制宿主细胞的生长、增值，而阻遏子可使宿主细胞免除此不良影响。而阻遏子可使宿主细胞免除此不良影响。 例如可先使宿主细胞快速生长增值到相当量，再通过瞬时例如可先使宿主细胞快速生长增值到相当量，再通过瞬时消除阻遏，使所表达的蛋白质在短时间内大量积累，同时也可消除阻遏，使所表达的蛋白质在短时间内大量积累，同时也可减少表达产物的降解。减少表达产物的降解。 阻遏子的阻遏作用可以由物理（如温度）、化学（如阻遏子的阻遏作用可以由物理（如温度）、化学（如IPTGIPTG、IAAIAA等）因素进行调节，这样可人为地选择启动子启动转录等）因素进行调节，这样可人为地选择启动子启动转录mRNAmRNA的时机。的时机。工业菌种的选育及改进课件3 3）所产生的所产生的mRNAmRNA必须具有翻译的起始信号必须具有翻译的起始信号，即起始密，即起始密码码AUGAUG和和SDSD序列（核糖体结合序列）。序列（核糖体结合序列）。4 4）应具有很强的终止子应具有很强的终止子，以便使，以便使RNARNA聚合酶集中力量转聚合酶集中力量转录克隆的外源基因，而不转录其他无关的基因。同录克隆的外源基因，而不转录其他无关的基因。同时强终止子所产生的时强终止子所产生的mRNAmRNA较为稳定。较为稳定。 诱导表达时，由于强启动子所致的高水平转录反诱导表达时，由于强启动子所致的高水平转录反过来会影响质粒过来会影响质粒DNADNA自身的复制，从而引起质粒的不自身的复制，从而引起质粒的不稳定或脱质粒现象。因此在外源基因的下游安置强稳定或脱质粒现象。因此在外源基因的下游安置强终止子可以克服由质粒转录引起的质粒不稳定。终止子可以克服由质粒转录引起的质粒不稳定。【终止子：位于操纵子或基因编码区末端的一段终止子：位于操纵子或基因编码区末端的一段DNADNA序序列，在原核生物中，在转录部分末端的终止子常有列，在原核生物中，在转录部分末端的终止子常有一个反向重复序列和紧接着一小段一个反向重复序列和紧接着一小段U U。】工业菌种的选育及改进课件3、载体的常见类型、载体的常见类型根据受体细胞不同，目前具备上述条件的载体有如下：根据受体细胞不同，目前具备上述条件的载体有如下： 1 1）原核受体细胞）原核受体细胞 入噬菌体入噬菌体 松弛型细菌质粒松弛型细菌质粒(E.coli pBR322) (E.coli pBR322) 2)2)真核受体细胞真核受体细胞 在酵母方面，主要是在酵母方面，主要是2 2质粒，质粒， 在植物方面，主要是在植物方面，主要是TiTi质粒，质粒， 在动物方面，主要有在动物方面，主要有SV40SV40病毒。病毒。（注：（注：SV40SV40病毒：猿猴病毒，为多瘤病毒属的病毒，诱发成纤维瘤）病毒：猿猴病毒，为多瘤病毒属的病毒，诱发成纤维瘤） 工业菌种的选育及改进课件第七章 微生物的遗传变异和育种第七章 微生物的遗传变异和育种图图3.8典型克隆载体典型克隆载体E.coli的的pBR322质粒的构造质粒的构造工业菌种的选育及改进课件图3.9 Ti质粒引发烟杆瘤的形成工业菌种的选育及改进课件（三）目的基因与载体（三）目的基因与载体DNADNA的体外重组的体外重组采用限制性核酸内切酶的处理或人为地在采用限制性核酸内切酶的处理或人为地在DNADNA的的33端上接上端上接上polyApolyA和和polyTpolyT，就可使参与重组的，就可使参与重组的两个两个DNADNA分子产生分子产生“准头准头”和和“卯眼卯眼”似的互补似的互补粘性末端。粘性末端。 然后把两者放在然后把两者放在5-65-6下温和地退火。下温和地退火。由于每一种限制性核酸内切酶所切断的双链由于每一种限制性核酸内切酶所切断的双链DNADNA片段的粘性末端都有相同的核苷酸组分，所以当片段的粘性末端都有相同的核苷酸组分，所以当两者相混时，在外加连接酶的作用下，目的基因两者相混时，在外加连接酶的作用下，目的基因就与载体就与载体DNADNA进行共价结合，形成一个完整的、进行共价结合，形成一个完整的、有复制能力的环状重组载体或嵌合体。有复制能力的环状重组载体或嵌合体。工业菌种的选育及改进课件（四）重组载体导入受体细胞（四）重组载体导入受体细胞上述由体外操纵手续构建的重组载体，只有将它上述由体外操纵手续构建的重组载体，只有将它导入受体细胞中，才能使其中的目的基因获得扩导入受体细胞中，才能使其中的目的基因获得扩增和表达。受体细胞种类极多，最初以原核生物增和表达。受体细胞种类极多，最初以原核生物为主，如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌，后来发展到为主，如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌，后来发展到真核微生物如酿酒酵母以及各种高等动植物的细真核微生物如酿酒酵母以及各种高等动植物的细胞株、组织。目前正在向各种大生物扩展，如转胞株、组织。目前正在向各种大生物扩展，如转基因动物和转基因植物等。基因动物和转基因植物等。工业菌种的选育及改进课件（五）重组受体细胞表达、筛选和鉴定（五）重组受体细胞表达、筛选和鉴定 对工业生产有重要意义的基因克隆反映在以下几方面：对工业生产有重要意义的基因克隆反映在以下几方面： 基因的表达产量基因的表达产量 表达产物的稳定性表达产物的稳定性 产物的生物活性产物的生物活性 产物的分离纯化产物的分离纯化 因此进行基因表达设计时，必须考虑各种影响因素，选因此进行基因表达设计时，必须考虑各种影响因素，选择最佳的基因表达系统。择最佳的基因表达系统。工业菌种的选育及改进课件1 1、基因表达系统、基因表达系统从育种的角度考虑，最为重要的是目的基因的高效表达。从育种的角度考虑，最为重要的是目的基因的高效表达。因为目的基因被插入某种载体中，并不意味着这个基因就因为目的基因被插入某种载体中，并不意味着这个基因就会表达或能高效表达。因此选择一个适宜的表达系统，才会表达或能高效表达。因此选择一个适宜的表达系统，才能保证表达产物能够高产并且具有功能。能保证表达产物能够高产并且具有功能。基因的表达系统分两大类：基因的表达系统分两大类： * *原核生物表达系统，目前常用的有大肠杆菌、枯草芽孢原核生物表达系统，目前常用的有大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌等；杆菌、链霉菌等； * *真核生物表达系统，有酵母、丝状真菌等。真核生物表达系统，有酵母、丝状真菌等。工业菌种的选育及改进课件1 1）原核表达系统）原核表达系统如果能够采取适当的基因操作技术，原核基因和如果能够采取适当的基因操作技术，原核基因和许多真核基因都能够在原核生物中获得表达。对许多真核基因都能够在原核生物中获得表达。对于需要转录或翻译后加工处理的真核基因，则不于需要转录或翻译后加工处理的真核基因，则不能用原核表达系统来表达。能用原核表达系统来表达。这是因为原核细胞缺乏像真核细胞那样的转录和这是因为原核细胞缺乏像真核细胞那样的转录和翻译后加工系统：翻译后加工系统： 不能切除不能切除mRNAmRNA的内含子的内含子 不能对氨基酸进行修饰不能对氨基酸进行修饰 不能进行蛋白质的糖基化不能进行蛋白质的糖基化工业菌种的选育及改进课件【内含子概念内含子概念】真核生物的基因与原核生物的基因有许多不同。真核生物的基因与原核生物的基因有许多不同。最明显的是它们一般无操作子结构，存在着大量最明显的是它们一般无操作子结构，存在着大量不编码序列和重复序列。转录与转译在细胞中有不编码序列和重复序列。转录与转译在细胞中有空间分隔，以及基因被许多无编码功能的内含子空间分隔，以及基因被许多无编码功能的内含子（intronintron）阻隔，从而使编码序列变成不连续的）阻隔，从而使编码序列变成不连续的外显子（外显子（exonexon）状态。）状态。大多数真核结构基因中的间插序列（大多数真核结构基因中的间插序列（intervening intervening sequencesequence）或不编码序列。它们可以转录，但在）或不编码序列。它们可以转录，但在基因转录后，由这些间插序列转录的部分（也可基因转录后，由这些间插序列转录的部分（也可用内含子这个术语表示）经加工被从初级转录本用内含子这个术语表示）经加工被从初级转录本中准确除去，才产生有功能的中准确除去，才产生有功能的RNARNA。工业菌种的选育及改进课件 基因的编码部分称基因的编码部分称外显子外显子。内含子常比外显。内含子常比外显子长，且占基因的更大比例。真核基因所含内含子长，且占基因的更大比例。真核基因所含内含子的数目、位置和长度不尽相同，如鸡卵清蛋白子的数目、位置和长度不尽相同，如鸡卵清蛋白基因的外显子被基因的外显子被7 7个内含子隔开，鸡卵伴清蛋白个内含子隔开，鸡卵伴清蛋白基因有基因有1717个内含子，个内含子，-珠蛋白基因有珠蛋白基因有2 2个内含子，个内含子，卵粘蛋白基因有卵粘蛋白基因有6 6个内含子等。个内含子等。 需注意的是，在需注意的是，在古细菌古细菌中也有内含子。中也有内含子。工业菌种的选育及改进课件A A、 大肠杆菌大肠杆菌由于大肠杆菌生产繁殖迅速，对其分子遗传学由于大肠杆菌生产繁殖迅速，对其分子遗传学的研究比较深入，所以目前它仍是基因工程中的研究比较深入，所以目前它仍是基因工程中最常用的原核表达系统。大肠杆菌因本身的特最常用的原核表达系统。大肠杆菌因本身的特点，其基因工程表达产物的形式多种多样点，其基因工程表达产物的形式多种多样: : 细胞内不溶性表达（包含体）细胞内不溶性表达（包含体） 胞内可溶性表达胞内可溶性表达 细胞周质表达细胞周质表达 可分泌到细胞外表达可分泌到细胞外表达( (极少数情况下极少数情况下) )不同的表达形式具有不同的表达水平，也会带不同的表达形式具有不同的表达水平，也会带来不同的杂质。来不同的杂质。工业菌种的选育及改进课件在大肠杆菌中的表达不存在翻译后修饰作用在大肠杆菌中的表达不存在翻译后修饰作用在大肠杆菌中的表达不存在信号肽，故其产物多为胞内产在大肠杆菌中的表达不存在信号肽，故其产物多为胞内产物，不能分泌至胞外。产物纯化须破碎细胞，而细胞质内物，不能分泌至胞外。产物纯化须破碎细胞，而细胞质内其他蛋白质也一起释放出来，造成分离纯化的困难。其他蛋白质也一起释放出来，造成分离纯化的困难。由于分泌能力不足，真核蛋白质常形成不溶性包含体，必由于分泌能力不足，真核蛋白质常形成不溶性包含体，必须经过变性和复性处理才能恢复生物活性。须经过变性和复性处理才能恢复生物活性。【信号肽定义：蛋白质在合成的时候在信号肽定义：蛋白质在合成的时候在N-末端融合有一段氨基酸残基末端融合有一段氨基酸残基即为信号肽或信号序列或引导序列，它以前体（前蛋白）形式存在。即为信号肽或信号序列或引导序列，它以前体（前蛋白）形式存在。信号肽对蛋白质的跨膜和转运是必须的，但在转运过程中一般被切除信号肽对蛋白质的跨膜和转运是必须的，但在转运过程中一般被切除】工业菌种的选育及改进课件但现已找到了一个解决的方法，如在碱性青霉素酶但现已找到了一个解决的方法，如在碱性青霉素酶（penicillinasepenicillinase）的研究中，嗜碱芽孢杆菌）的研究中，嗜碱芽孢杆菌sp.no.170sp.no.170的的这个基因在大肠杆菌克隆后，这个基因在大肠杆菌克隆后，胞内外来目的基因表达产物胞内外来目的基因表达产物可以分泌在培养基中。同时大肠杆菌中的原生质蛋白质也可以分泌在培养基中。同时大肠杆菌中的原生质蛋白质也可分泌出来。可分泌出来。这是由于嗜碱菌这是由于嗜碱菌DNADNA的插入，激活了的插入，激活了pMB9 pMB9 中的中的kilkil基因。基因。kilkil基因是相应于细胞水解中大肠杆菌素基因是相应于细胞水解中大肠杆菌素E1E1的释放，但由的释放，但由于它缺乏启动子，在于它缺乏启动子，在pMB9pMB9中并不表达。中并不表达。这种解决方法已被用于木聚糖酶、纤维素酶、人类生长激这种解决方法已被用于木聚糖酶、纤维素酶、人类生长激素和人类素和人类FcFc蛋白的胞外生产。大约总产量的蛋白的胞外生产。大约总产量的60%-70%60%-70%可被可被分泌出来。分泌出来。补充相关概念：补充相关概念： 【pMB9pMB9：一种多拷贝质粒，携带编码大肠杆菌素一种多拷贝质粒，携带编码大肠杆菌素E1E1、大肠、大肠杆菌相关免疫蛋白和杆菌相关免疫蛋白和EcoRIEcoRI限制性内切酶等的基因限制性内切酶等的基因】 【大肠杆菌素大肠杆菌素E1:E1:在敏感细胞内，在敏感细胞内， Ecol E1Ecol E1造成小孔，与造成小孔，与胞内产物释放到胞外相关胞内产物释放到胞外相关】工业菌种的选育及改进课件B B、 链霉菌链霉菌 链霉菌是重要的工业微生物，作为外源基因表链霉菌是重要的工业微生物，作为外源基因表达系统有以下特点：达系统有以下特点： 不致病、使用安全不致病、使用安全 分泌能力强，可将表达产物分泌到胞外分泌能力强，可将表达产物分泌到胞外 具有具有糖基化糖基化能力能力 例如，例如，变铅青链霉菌变铅青链霉菌限制能力弱，是一个限制能力弱，是一个理想的受体菌。并且现在已构建了一系列有效理想的受体菌。并且现在已构建了一系列有效的载体，培养工艺也比较成熟。的载体，培养工艺也比较成熟。工业菌种的选育及改进课件2)2)真核表达系统真核表达系统 在细菌中表达真核基因产物，往往会因在细菌中表达真核基因产物，往往会因为翻译后加工过程的缺陷，导致产物失去为翻译后加工过程的缺陷，导致产物失去原有的生物活性。原有的生物活性。 为此人们构建了真核表达系统，用于生为此人们构建了真核表达系统，用于生产真核蛋白质。在真核表达系统中生产的产真核蛋白质。在真核表达系统中生产的蛋白质，就会与天然蛋白质具有一致的生蛋白质，就会与天然蛋白质具有一致的生理生化和生物学功能。理生化和生物学功能。工业菌种的选育及改进课件A A、酵、酵 母母酵母菌是研究基因表达调控最有效的单细胞真核微生物：酵母菌是研究基因表达调控最有效的单细胞真核微生物：基因组较小，仅为大肠杆菌的基因组较小，仅为大肠杆菌的4 4倍倍世代周期短，酵母菌生长繁殖迅速，容易培育世代周期短，酵母菌生长繁殖迅速，容易培育有单倍体、双倍体两种形式有单倍体、双倍体两种形式不产生有毒物质不产生有毒物质基因工程操作方便（与原核生物相似）基因工程操作方便（与原核生物相似）表达产物能正确进行翻译后加工（包括糖基化和肽剪切）表达产物能正确进行翻译后加工（包括糖基化和肽剪切）能够将表达产物直接分泌至胞外能够将表达产物直接分泌至胞外在细菌系统中表达不良的真核基因，均能在酵母中良好表达在细菌系统中表达不良的真核基因，均能在酵母中良好表达 工业菌种的选育及改进课件 鉴于上述原因，酵母菌被认为是表达外源蛋鉴于上述原因，酵母菌被认为是表达外源蛋白质，特别是真核生物蛋白质的最适表达系统。白质，特别是真核生物蛋白质的最适表达系统。 在各种酵母中，以酿酒酵母的研究和应用最在各种酵母中，以酿酒酵母的研究和应用最为广泛，目前已有不少真核基因在酵母中成功地为广泛，目前已有不少真核基因在酵母中成功地表达，如干扰素、乙肝表面抗原基因等。表达，如干扰素、乙肝表面抗原基因等。工业菌种的选育及改进课件B、丝状真菌、丝状真菌 丝状真菌也是重要的工业菌株，近年来已在丝状真菌也是重要的工业菌株，近年来已在3030多种真菌中建立了多种真菌中建立了DNADNA转化系统。其特点是：转化系统。其特点是：有很强的蛋白质分泌能力，有很强的蛋白质分泌能力，能正确进行翻译后加工，包括肽剪切和糖基化等。能正确进行翻译后加工，包括肽剪切和糖基化等。糖基化方式与高等真核生物相似。糖基化方式与高等真核生物相似。丝状真菌（如曲霉等）又确认是安全菌株，并有成丝状真菌（如曲霉等）又确认是安全菌株，并有成熟的发酵和后加工工艺熟的发酵和后加工工艺。工业菌种的选育及改进课件 综上所述，虽然各种微生物从理论上讲，综上所述，虽然各种微生物从理论上讲，都可以用于基因的表达，但由于克隆载体都可以用于基因的表达，但由于克隆载体DNADNA导入方法以及遗传背景等方面的限制，导入方法以及遗传背景等方面的限制，所以目前最广泛使用的宿主菌仍是所以目前最广泛使用的宿主菌仍是大肠杆大肠杆菌菌和和酿酒酵母酿酒酵母。工业菌种的选育及改进课件2 2、影响目的基因在工程菌中表达的因素、影响目的基因在工程菌中表达的因素1 1）影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素）影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素外源基因的表达产量与细胞浓度和每一个细外源基因的表达产量与细胞浓度和每一个细胞平均表达产量是正相关的，要想获得最高产量，胞平均表达产量是正相关的，要想获得最高产量，必须了解影响这两者的各种因素，如外源基因的必须了解影响这两者的各种因素，如外源基因的拷贝数、基因表达效率、表达产物的稳定性和细拷贝数、基因表达效率、表达产物的稳定性和细胞代谢负荷等与表达产量的关系胞代谢负荷等与表达产量的关系。工业菌种的选育及改进课件A A、外源基因的拷贝数、外源基因的拷贝数 一般来说细胞内基因拷贝数增加，基因表一般来说细胞内基因拷贝数增加，基因表达产物的产量也会增加。克隆在高拷贝数表达达产物的产量也会增加。克隆在高拷贝数表达载体上的外源基因，会因表达载体拷贝数的增载体上的外源基因，会因表达载体拷贝数的增加而增加，因此高拷贝数表达载体的使用，有加而增加，因此高拷贝数表达载体的使用，有利于提高外源基因的总体表达水平。利于提高外源基因的总体表达水平。工业菌种的选育及改进课件B B、外源基因的表达效率、外源基因的表达效率 有许多因素都会不同程度地影响外源有许多因素都会不同程度地影响外源基因的表达效率，如启动子的强度、核糖基因的表达效率，如启动子的强度、核糖体结合位点的有效性、体结合位点的有效性、SDSD序列和起始密码序列和起始密码子子ATGATG之间的距离、密码子的组成等。之间的距离、密码子的组成等。工业菌种的选育及改进课件a）启动子的强度）启动子的强度 启动子启动子是在转录水平上影响基因表达。转录的最大效率是在转录水平上影响基因表达。转录的最大效率取决于启动子中碱基的组成，往往会因一个碱基的不同，取决于启动子中碱基的组成，往往会因一个碱基的不同，启动子效率可能提高上千倍。也就是说启动子会有强弱之启动子效率可能提高上千倍。也就是说启动子会有强弱之分。要获得高效表达需要选择强启动子。分。要获得高效表达需要选择强启动子。 由于真核基因启动子不能被大肠杆菌由于真核基因启动子不能被大肠杆菌RNARNA聚合酶识别，聚合酶识别，因此必须将真核基因编码区连接在肠杆菌因此必须将真核基因编码区连接在肠杆菌RNARNA聚合酶能够识聚合酶能够识别的强启动子控制下。别的强启动子控制下。 常用的强启动子有常用的强启动子有laclac、trptrp、tactac等，将外源基因插入等，将外源基因插入这类强启动子的下游，可以增加基因的表达产量。这类强启动子的下游，可以增加基因的表达产量。 但是如果启动子太强，但是如果启动子太强，RNARNA聚合酶有时超过了终止信号，聚合酶有时超过了终止信号，引起过度转录和杂蛋白的生成，对宿主细胞的正常生长和引起过度转录和杂蛋白的生成，对宿主细胞的正常生长和基因工程产物的纯化不利，同时影响载体的稳定性。所以基因工程产物的纯化不利，同时影响载体的稳定性。所以一般在多克隆位点的下游要插入一段核糖体一般在多克隆位点的下游要插入一段核糖体RNARNA的转录终止的转录终止子（子（rrnBrrnB）。）。工业菌种的选育及改进课件 b） SDSD序列和起始密码子序列和起始密码子ATGATG之间的距离之间的距离 SDSD序列和起始密码子序列和起始密码子ATGATG之间的距离及序列对mRNA翻译成蛋白质的效率有明显影响，SD序列和起始密码子之间的距离过长或过短都会影响真核基因的表达。调整SD序列与起始密码子ATG的间距，改变附近核苷酸序列，可提高非融合蛋白的合成水平。工业菌种的选育及改进课件c c）核糖体结合位点的有效性核糖体结合位点的有效性 大肠杆菌核糖体结合位点大肠杆菌核糖体结合位点对真核基因在细菌中的高效对真核基因在细菌中的高效表达也十分重要，所以必须增加核糖体结合位点的有效性，表达也十分重要，所以必须增加核糖体结合位点的有效性，消除核糖体结合位点及其附近的潜在二级结构。消除核糖体结合位点及其附近的潜在二级结构。 d d）密码子组成密码子组成 密码子的组成是影响翻译效率的另一重要因素。这主密码子的组成是影响翻译效率的另一重要因素。这主要是因为真核基因和原核基因对编码同一种氨基酸所要是因为真核基因和原核基因对编码同一种氨基酸所“偏偏爱性爱性”使用的密码子不尽相同的缘故，或可能是与不同的使用的密码子不尽相同的缘故，或可能是与不同的宿主系统中不同种类宿主系统中不同种类tRNAtRNA浓度有关。浓度有关。 所以真核系统中所以真核系统中“偏爱性偏爱性”的密码子在原核细胞中的的密码子在原核细胞中的翻译效率有可能下降。为了提高表达水平，在设计引物或翻译效率有可能下降。为了提高表达水平，在设计引物或合成基因时，应选择大肠杆菌合成基因时，应选择大肠杆菌“偏爱偏爱”的密码子。的密码子。工业菌种的选育及改进课件C、表达产物的稳定性 真核基因在原核细胞中表达时，可以产生融合型和非融合型表达蛋白，非融合蛋白是指不与细菌的任何蛋白和多肽融合在一起的表达蛋白，这类蛋白质具有近似于真核蛋白质的结构，生物学功能也更接近生物体内天然蛋白质的性质。但当非融合蛋白表达时，细胞内降解该蛋白质的蛋白酶由于应急反应，其产量也会迅速增加，所以即使原始表达量很高，也会被产生的蛋白酶所降解，而实际产量仍然很低。工业菌种的选育及改进课件D D、细胞的代谢负荷、细胞的代谢负荷 大量的外源基因表达产物可能打破宿主细胞的正常大量的外源基因表达产物可能打破宿主细胞的正常生长代谢平衡，如大量的氨基酸被用于合成与细胞生长生长代谢平衡，如大量的氨基酸被用于合成与细胞生长无关的蛋白质，就会影响细胞的正常代谢过程。无关的蛋白质，就会影响细胞的正常代谢过程。 有的表达产物对宿主细胞有害，其大量积累可能导有的表达产物对宿主细胞有害，其大量积累可能导致细胞生长缓慢甚至死亡。致细胞生长缓慢甚至死亡。 所以合理调节这种消长关系，才能使宿主细胞的代所以合理调节这种消长关系，才能使宿主细胞的代谢负荷不至过重，又能高效表达外源基因产物。谢负荷不至过重，又能高效表达外源基因产物。 减轻宿主细胞代谢负荷的措施是将宿主细胞的生长减轻宿主细胞代谢负荷的措施是将宿主细胞的生长和外源基因的表达分成两个阶段，首先使宿主细胞的生和外源基因的表达分成两个阶段，首先使宿主细胞的生物量达到饱和，在这一阶段中或采用一定的方法抑制重物量达到饱和，在这一阶段中或采用一定的方法抑制重组质粒的复制或不诱导基因产物的合成，以减少宿主细组质粒的复制或不诱导基因产物的合成，以减少宿主细胞的代谢负荷；在第二阶段再诱导细胞重组质粒的复制胞的代谢负荷；在第二阶段再诱导细胞重组质粒的复制或诱导基因产物表达。或诱导基因产物表达。工业菌种的选育及改进课件2 2）影响外源基因在酵母中表达的因素）影响外源基因在酵母中表达的因素 外源基因的拷贝数外源基因的拷贝数 表达效率表达效率 外源蛋白糖基化外源蛋白糖基化 宿主菌株宿主菌株工业菌种的选育及改进课件A A、外源基因的拷贝数、外源基因的拷贝数外源基因通常是构建在多拷贝的质粒载体上，再导入宿主外源基因通常是构建在多拷贝的质粒载体上，再导入宿主细胞，所以质粒的拷贝数和在宿主细胞中的稳定性对外源细胞，所以质粒的拷贝数和在宿主细胞中的稳定性对外源基因的高效表达至关重要。基因的高效表达至关重要。有些质粒导入宿主细胞后，在传代培养中很容易丢失，而有些质粒导入宿主细胞后，在传代培养中很容易丢失，而不能用于工业生产。不能用于工业生产。利用整合质粒将外源基因整合到宿主染色体上，虽然很稳利用整合质粒将外源基因整合到宿主染色体上，虽然很稳定，但通常仅有一个拷贝，不能高效表达。定，但通常仅有一个拷贝，不能高效表达。高度稳定的高拷贝数质粒可使外源基因高效表达，但往往高度稳定的高拷贝数质粒可使外源基因高效表达，但往往会引起细胞生长量的降低；会引起细胞生长量的降低；而单拷贝数的质粒对细胞获得最大生长量没有影响，因此而单拷贝数的质粒对细胞获得最大生长量没有影响，因此也有可能达到高效表达。也有可能达到高效表达。工业菌种的选育及改进课件B B、外源基因的表达效率、外源基因的表达效率外源基因在酵母中表达效率主要与启动子、分泌信号和终外源基因在酵母中表达效率主要与启动子、分泌信号和终止序列有关。止序列有关。分泌信号包括信号肽部分和前导肽部分的编码序列，它帮分泌信号包括信号肽部分和前导肽部分的编码序列，它帮助表达产物分泌出酵母细胞，并在分泌过程中被胞内蛋白助表达产物分泌出酵母细胞，并在分泌过程中被胞内蛋白酶加工切割，产生正确的表达产物。酶加工切割，产生正确的表达产物。表达产物分泌到细胞外，既可避免对酵母细胞可能产生的表达产物分泌到细胞外，既可避免对酵母细胞可能产生的不利影响，又可简化纯化步骤，不必破碎细胞，防止杂蛋不利影响，又可简化纯化步骤，不必破碎细胞，防止杂蛋白质对分离造成的困难。白质对分离造成的困难。由于酵母对表达蛋白的分泌、转运和加工方式与高等真核由于酵母对表达蛋白的分泌、转运和加工方式与高等真核生物相似，所以许多哺乳动物的蛋白质都能在酵母中正确生物相似，所以许多哺乳动物的蛋白质都能在酵母中正确加工并分泌到胞外。加工并分泌到胞外。酵母菌也能利用异源的分泌信号，但利用酵母菌自身的分酵母菌也能利用异源的分泌信号，但利用酵母菌自身的分泌信号一般较利用异源的分泌信号效率更高。泌信号一般较利用异源的分泌信号效率更高。工业菌种的选育及改进课件C C、外源蛋白的糖基化、外源蛋白的糖基化与哺乳动物细胞相同，酿酒酵母也能使表达的外与哺乳动物细胞相同，酿酒酵母也能使表达的外源蛋白在分泌过程中发生源蛋白在分泌过程中发生N-N-糖苷键和糖苷键和O-O-糖苷键连糖苷键连接的两种糖基化。所分泌出来的异源蛋白糖基化接的两种糖基化。所分泌出来的异源蛋白糖基化产物与天然产物完全相同。产物与天然产物完全相同。酵母菌合成的外源蛋白经氨基末端修饰、二硫键酵母菌合成的外源蛋白经氨基末端修饰、二硫键形成、蛋白质折叠和糖基化后，可以分泌到培养形成、蛋白质折叠和糖基化后，可以分泌到培养基中，便于分离纯化。基中，便于分离纯化。工业菌种的选育及改进课件D D、宿主菌株的影响、宿主菌株的影响酵母菌株及其生理状况不同，明显影响外源基因的表达。酵母菌株及其生理状况不同，明显影响外源基因的表达。用于表达外源基因的酵母宿主菌株应具备以下特点用于表达外源基因的酵母宿主菌株应具备以下特点: : 生长能力强生长能力强 菌体内源蛋白酶较弱菌体内源蛋白酶较弱 菌株性能稳定菌株性能稳定 分泌能力强分泌能力强外源基因表达产物容易受到酵母细胞内蛋白酶的分解，内外源基因表达产物容易受到酵母细胞内蛋白酶的分解，内源蛋白酶活力低的菌株造成的破坏较小。常用的宿主菌株源蛋白酶活力低的菌株造成的破坏较小。常用的宿主菌株几乎都是突变株，应避免使用回复突变率高的不稳定菌株。几乎都是突变株，应避免使用回复突变率高的不稳定菌株。工业菌种的选育及改进课件3 3、基因工程菌的稳定性、基因工程菌的稳定性基因工程菌在传代中常出现质粒不稳定现象。质粒基因工程菌在传代中常出现质粒不稳定现象。质粒不稳定可分为不稳定可分为分裂不稳定分裂不稳定和和结构不稳定结构不稳定两种情况。两种情况。质粒的分裂不稳定是指基因工程菌分裂时，出现一质粒的分裂不稳定是指基因工程菌分裂时，出现一定比例不含质粒的子代菌。定比例不含质粒的子代菌。质粒的结构不稳定是指外源基因从质粒上丢失、碱质粒的结构不稳定是指外源基因从质粒上丢失、碱基重排或缺失，引起基因工程菌性能的改变。基重排或缺失，引起基因工程菌性能的改变。由于这类菌（指丢失了质粒的工程菌）与带有质粒由于这类菌（指丢失了质粒的工程菌）与带有质粒的菌相比有一定的生长优势，因此在培养中能逐渐的菌相比有一定的生长优势，因此在培养中能逐渐代替带有质粒的菌成为优势菌，以致减少了外源基代替带有质粒的菌成为优势菌，以致减少了外源基因的表达产量。因的表达产量。工业菌种的选育及改进课件1 1）质粒不稳定的产生原因）质粒不稳定的产生原因质粒不稳定常见的是分裂不稳定，它主要与两个因素有关：质粒不稳定常见的是分裂不稳定，它主要与两个因素有关： 一是含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率；一是含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率； 二是这两种菌的比生长速率差异的大小。二是这两种菌的比生长速率差异的大小。含低拷贝数的工程菌产生不含质粒子代菌的频率较高，因此增含低拷贝数的工程菌产生不含质粒子代菌的频率较高，因此增加工程菌中的质粒拷贝数有利于提高质粒的稳定性；加工程菌中的质粒拷贝数有利于提高质粒的稳定性；含高拷贝数质粒的工程菌产生不含质粒子代菌的频率较低，但含高拷贝数质粒的工程菌产生不含质粒子代菌的频率较低，但是大量外源质粒的产生，造成含质粒菌的比生长速率明显低于是大量外源质粒的产生，造成含质粒菌的比生长速率明显低于不含质粒菌，所以一旦产生了不含质粒菌，能较快地取代质粒不含质粒菌，所以一旦产生了不含质粒菌，能较快地取代质粒菌成为优势菌，因此进一步提高质粒的拷贝数反而会增加含质菌成为优势菌，因此进一步提高质粒的拷贝数反而会增加含质粒菌的生长负势，影响质粒的稳定性。粒菌的生长负势，影响质粒的稳定性。工业菌种的选育及改进课件菌体生长对质粒拷贝数有一定的影响，质粒的拷菌体生长对质粒拷贝数有一定的影响，质粒的拷贝数除与工程菌本身的特性有关外，还与培养条贝数除与工程菌本身的特性有关外，还与培养条件有关。有报道，在高比生长速率时质粒拷贝数件有关。有报道，在高比生长速率时质粒拷贝数下降，但质粒稳定性明显增加。例如，表达下降，但质粒稳定性明显增加。例如，表达-半乳糖苷酶的工程菌半乳糖苷酶的工程菌JM103JM103在连续培养中，比生在连续培养中，比生长速率从长速率从0.2h0.2h-1-1增加到增加到0.4h0.4h-1-1，质粒拷贝数则从，质粒拷贝数则从950950降到降到40.40.但是在含高拷贝数质粒的工程菌中，质粒拷贝数但是在含高拷贝数质粒的工程菌中，质粒拷贝数的增加与产物的增加往往不成正比，这也许是含的增加与产物的增加往往不成正比，这也许是含高拷贝数质粒的菌中，蛋白质的限速步骤是转录高拷贝数质粒的菌中，蛋白质的限速步骤是转录和翻译，基因的大量复制加重了转录和翻译的负和翻译，基因的大量复制加重了转录和翻译的负担，反而减慢了转录和翻译的速度。担，反而减慢了转录和翻译的速度。工业菌种的选育及改进课件2 2）提高质粒稳定性的方法）提高质粒稳定性的方法工程菌的培养一般采用分成两阶段培养法来提高工程菌的培养一般采用分成两阶段培养法来提高质粒的稳定性。质粒的稳定性。在培养的第一阶段以增加菌体的生长达到一定密在培养的第一阶段以增加菌体的生长达到一定密度为目的，外源基因不表达，从而使工程菌与质度为目的，外源基因不表达，从而使工程菌与质粒丢失菌的比生长速率的差别减少，增加了质粒粒丢失菌的比生长速率的差别减少，增加了质粒的稳定性；的稳定性；第二阶段再诱导外源基因的表达。可以在培养基第二阶段再诱导外源基因的表达。可以在培养基中加入选择性压力如抗生素等，以抑制质粒丢失中加入选择性压力如抗生素等，以抑制质粒丢失菌的生长。菌的生长。工业菌种的选育及改进课件控制适当的培养条件也能使工程菌具有优势的比控制适当的培养条件也能使工程菌具有优势的比生长速率，可调控的培养条件有温度、生长速率，可调控的培养条件有温度、pHpH、培养、培养基组分和溶解氧等。基组分和溶解氧等。有些含质粒的菌对发酵环境改变的反应比不含质有些含质粒的菌对发酵环境改变的反应比不含质粒的菌要慢，通过间歇改变培养条件可以改变两粒的菌要慢，通过间歇改变培养条件可以改变两者的比生长速率，达到改善质粒稳定性的效果。者的比生长速率，达到改善质粒稳定性的效果。如间歇供氧和改变稀释速率都可以提高质粒的稳如间歇供氧和改变稀释速率都可以提高质粒的稳定性。在研究大肠杆菌表达干扰素定性。在研究大肠杆菌表达干扰素-a-a中，发现中，发现随着稀释度的增加，质粒稳定性明显增加，干扰随着稀释度的增加，质粒稳定性明显增加，干扰素的比效价明显增大。素的比效价明显增大。工业菌种的选育及改进课件（六）工程菌的大规模培养（六）工程菌的大规模培养不同于传统的发酵工艺，工程菌发酵目的是希望不同于传统的发酵工艺，工程菌发酵目的是希望能够获得大量的外源基因产物，尽可能减少宿主能够获得大量的外源基因产物，尽可能减少宿主细胞本身蛋白的污染。细胞本身蛋白的污染。外源基因的高水平表达，不仅涉及宿主、载体和外源基因的高水平表达，不仅涉及宿主、载体和克隆基因之间的相互关系，而且与其所处的环境克隆基因之间的相互关系，而且与其所处的环境条件息息相关。条件息息相关。不同的发酵条件，工程菌的代谢途径也许不一样，不同的发酵条件，工程菌的代谢途径也许不一样，对下游的纯化工艺也会造成不同的影响。对下游的纯化工艺也会造成不同的影响。仅按传统的发酵工艺生产生物制品是远远不够的，仅按传统的发酵工艺生产生物制品是远远不够的，需要对影响外源基因表达的因素进行分析，探索需要对影响外源基因表达的因素进行分析，探索出一套既始于外源基因高效表达，又有利于产品出一套既始于外源基因高效表达，又有利于产品纯化的发酵工艺。纯化的发酵工艺。工业菌种的选育及改进课件1 1、培养基的影响、培养基的影响 培养基的组成既要提高工程菌的比生长速率，又要保持重培养基的组成既要提高工程菌的比生长速率，又要保持重组质粒的稳定性，使外源基因能够高效表达。组质粒的稳定性，使外源基因能够高效表达。 1)1)碳源的影响碳源的影响 使用不同的碳源对菌体生长和外源基因表达有较大的影响。使用不同的碳源对菌体生长和外源基因表达有较大的影响。葡萄糖和甘油相比，它们所导致的菌体比生长速率及呼吸强度葡萄糖和甘油相比，它们所导致的菌体比生长速率及呼吸强度相差不大，但甘油的菌体得率较大，而葡萄糖所产生的副产物相差不大，但甘油的菌体得率较大，而葡萄糖所产生的副产物较多。较多。 2) 2)无机磷的影响无机磷的影响 无机磷在许多初级代谢的酶促反应中是一个效应因子，如无机磷在许多初级代谢的酶促反应中是一个效应因子，如在在DNADNA、RNARNA、蛋白质的合成，糖代谢，细胞呼吸及、蛋白质的合成，糖代谢，细胞呼吸及ATPATP水平的水平的控制中，过量的无机磷会刺激葡萄糖的利用、菌体生长和氧消控制中，过量的无机磷会刺激葡萄糖的利用、菌体生长和氧消耗。耗。 Ryan Ryan等研究无机磷浓度对重组大肠杆菌生长及克隆基因表等研究无机磷浓度对重组大肠杆菌生长及克隆基因表达的结果表明，在低磷浓度下，尽管菌体浓度较低，但产物比达的结果表明，在低磷浓度下，尽管菌体浓度较低，但产物比产率及产物浓度都最高。产率及产物浓度都最高。工业菌种的选育及改进课件2 2、接种量的影响、接种量的影响 接种量是指移入的种子液体积和培养液体积的接种量是指移入的种子液体积和培养液体积的比例，接种量的大小影响发酵的产量和发酵周期，比例，接种量的大小影响发酵的产量和发酵周期，它的大小取决于生产菌种在发酵中的生长繁殖速它的大小取决于生产菌种在发酵中的生长繁殖速度。度。接种量小，菌体延迟期较长，不利于外源基因的接种量小，菌体延迟期较长，不利于外源基因的表达。表达。接种量大，由于种子液中含有大量胞外水解酶，接种量大，由于种子液中含有大量胞外水解酶，有利于对基质的利用，可以缩短生长延迟期，并有利于对基质的利用，可以缩短生长延迟期，并使生产菌能迅速占领整个培养环境，减少污染机使生产菌能迅速占领整个培养环境，减少污染机会；会；接种量过高往往会使菌体生长过快，代谢产物积接种量过高往往会使菌体生长过快，代谢产物积累较多，反而会抑制后期菌体的生长。累较多，反而会抑制后期菌体的生长。工业菌种的选育及改进课件3 3、温度的影响、温度的影响温度对基因表达的调控作用可发生在复制、转录、温度对基因表达的调控作用可发生在复制、转录、翻译或低分子量的调节分子合成等水平上。在复翻译或低分子量的调节分子合成等水平上。在复制水平上可通过调控复制，来改变基因剂量，影制水平上可通过调控复制，来改变基因剂量，影响基因表达。响基因表达。温度诱导的基因工程菌温度诱导的基因工程菌, ,其最佳的诱导温度可能其最佳的诱导温度可能随产物而异。温敏扩增型质粒，升温后质粒拷贝随产物而异。温敏扩增型质粒，升温后质粒拷贝数就处于失控状态，对菌体生长有很大影响。对数就处于失控状态，对菌体生长有很大影响。对含此类质粒的工程菌，通常要先在较低温度下培含此类质粒的工程菌，通常要先在较低温度下培养，然后升温，以大量增加质粒拷贝数，诱导外养，然后升温，以大量增加质粒拷贝数，诱导外源基因表达。源基因表达。工业菌种的选育及改进课件4 4、溶解氧的影响、溶解氧的影响溶解氧是工程菌培养过程中影响菌体代谢的一个溶解氧是工程菌培养过程中影响菌体代谢的一个重要参数，溶解氧浓度对菌体生长和产物生成的重要参数，溶解氧浓度对菌体生长和产物生成的影响很大。影响很大。采用两阶段培养工艺，培养前期阶段着重于优化采用两阶段培养工艺，培养前期阶段着重于优化工程菌的最佳生长条件，培养后期阶段着重于优工程菌的最佳生长条件，培养后期阶段着重于优化外源蛋白的表达条件。化外源蛋白的表达条件。控制适当的溶解氧也能使工程菌具有优势的比生控制适当的溶解氧也能使工程菌具有优势的比生长速率。例如间歇供氧和改变稀释速率都可以提长速率。例如间歇供氧和改变稀释速率都可以提高质粒的稳定性。从理论上说，外源基因表达的高质粒的稳定性。从理论上说，外源基因表达的产量会更高。产量会更高。工业菌种的选育及改进课件5 5、pHpH的影响的影响采用两阶段培养工艺，培养前期阶段着重于优化工程菌的采用两阶段培养工艺，培养前期阶段着重于优化工程菌的最佳生长条件，培养后期阶段着重于优化外源蛋白的表达最佳生长条件，培养后期阶段着重于优化外源蛋白的表达条件。条件。采用自动调节程序，就可避免环境采用自动调节程序，就可避免环境pHpH激烈变化对细胞生长激烈变化对细胞生长和代谢造成的不利影响。和代谢造成的不利影响。实验发现，细胞生长期的最佳实验发现，细胞生长期的最佳pHpH范围在范围在6.8-7.46.8-7.4左右，而左右，而外源蛋白表达的最佳外源蛋白表达的最佳pHpH为为6.0-6.56.0-6.5，因此发酵前期，因此发酵前期，pHpH可可以控制在以控制在7.07.0左右；当开始热诱导表达时，关闭碱泵，由左右；当开始热诱导表达时，关闭碱泵，由于细胞自身代谢的结果，于细胞自身代谢的结果，pHpH逐渐下降，这时有利于外源蛋逐渐下降，这时有利于外源蛋白表达；当白表达；当pHpH降至降至6.06.0时，重新启动碱泵，使时，重新启动碱泵，使pHpH维持在维持在6.0-6.56.0-6.5之间，促使代谢尽可能朝有利于外源蛋白高度表之间，促使代谢尽可能朝有利于外源蛋白高度表达的方向发展。达的方向发展。工业菌种的选育及改进课件总总 结结必须建立工程菌发酵的最佳化工艺。最佳化工艺必须建立工程菌发酵的最佳化工艺。最佳化工艺是指最短周期、最高产量、最好质量、最低消耗、是指最短周期、最高产量、最好质量、最低消耗、最大安全性、最周全的废物处理效果与最低失败最大安全性、最周全的废物处理效果与最低失败率等综合指标。率等综合指标。工艺最佳化需对不同的菌种做大量试验，取得重工艺最佳化需对不同的菌种做大量试验，取得重复性好的准确数据后，模拟发酵代谢曲线，预测复性好的准确数据后，模拟发酵代谢曲线，预测放大值。只有对菌种生物特性和发酵工艺了如指放大值。只有对菌种生物特性和发酵工艺了如指掌，最佳工艺条件设计才更合理。掌，最佳工艺条件设计才更合理。工业菌种的选育及改进课件练练 习习1 1 简述自然选育的特点及方法，在生产实践中为什么要进行简述自然选育的特点及方法，在生产实践中为什么要进行自然选育？自然选育？2 2 叙述诱变育种的意义。阐述诱变育种方法学上包括哪两部叙述诱变育种的意义。阐述诱变育种方法学上包括哪两部分？为了达到对菌种的高效率的诱变在操作时要注意哪些方分？为了达到对菌种的高效率的诱变在操作时要注意哪些方面。面。3 3 叙述工业微生物杂交育种的意义，并以酿酒酵母为例说明叙述工业微生物杂交育种的意义，并以酿酒酵母为例说明有性杂交育种的步骤以及在发酵生产上有哪些应用。有性杂交育种的步骤以及在发酵生产上有哪些应用。 4 4 叙述细胞原生质体融合技术在育种上的意义及其操作步骤。叙述细胞原生质体融合技术在育种上的意义及其操作步骤。论述该技术在工业发酵上有哪些优越性及其应用前景。论述该技术在工业发酵上有哪些优越性及其应用前景。5 5 何谓基因克隆（基因工程技术）？简述基因工程技术的基何谓基因克隆（基因工程技术）？简述基因工程技术的基本操作步骤。论述利用基因克隆技术生产重组基因产物（例本操作步骤。论述利用基因克隆技术生产重组基因产物（例如生理活性物质作为药物或某些疫苗生产等）从根本上解决如生理活性物质作为药物或某些疫苗生产等）从根本上解决了传统制药生产上述产物的哪些难题？了传统制药生产上述产物的哪些难题？6 6 论述优良载体应具备哪些条件（特点）？在遗传工程上常论述优良载体应具备哪些条件（特点）？在遗传工程上常见的载体类型有哪些？见的载体类型有哪些？工业菌种的选育及改进课件7 7 在基因操作应用上与真核细胞相比，原核表达在基因操作应用上与真核细胞相比，原核表达系统具有哪些普遍的表达特色？据你所学的知识，系统具有哪些普遍的表达特色？据你所学的知识，论述以论述以E.coliE.coli作为表达系统具有哪些优势及缺陷作为表达系统具有哪些优势及缺陷？就？就E.coliE.coli的表达缺陷设计一个弥补措施（提示：的表达缺陷设计一个弥补措施（提示：针对胞外分泌的缺陷设计）针对胞外分泌的缺陷设计）8 8 作为基因表达系统，酵母菌有哪些优势作为基因表达系统，酵母菌有哪些优势/ /特色特色？（为什么酵母菌被认为是表达外源蛋白，特别？（为什么酵母菌被认为是表达外源蛋白，特别是真核蛋白的最适合的表达系统？）是真核蛋白的最适合的表达系统？）9 9 论述外源基因在论述外源基因在E.coliE.coli中表达的影响因素。中表达的影响因素。10 10 论述外源基因在酿酒酵母中表达的影响因素。论述外源基因在酿酒酵母中表达的影响因素。11 11 基因工程菌常出现哪几种质粒不稳定现象？基因工程菌常出现哪几种质粒不稳定现象？叙述其产生原因，它会给发酵生产带来何种危害叙述其产生原因，它会给发酵生产带来何种危害？简述提高质粒稳定性的方法。？简述提高质粒稳定性的方法。12 12 论述基因工程菌大规模生产的影响因素。论述基因工程菌大规模生产的影响因素。工业菌种的选育及改进课件Thank you for your attention!工业菌种的选育及改进课件