病毒感染性疾病的实验室诊断病毒感染性疾病的实验室诊断1病毒的发现与研究历史病毒的发现与研究历史 v 病毒病由来已久病毒病由来已久 公元前二至三个世纪公元前二至三个世纪 天花天花 中国中国 公元十世纪公元十世纪 接种人痘预防天花接种人痘预防天花 1796英国医生琴纳英国医生琴纳 牛痘使人预防天花牛痘使人预防天花 阿里斯多德在公元前四世纪阿里斯多德在公元前四世纪 狂犬病狂犬病 法国人巴斯德在法国人巴斯德在1884年年 狂犬疫苗狂犬疫苗 2病毒学的发展历程病毒学的发展历程 v病毒的病原研究阶段病毒的病原研究阶段v病毒的化学和结构研究阶段病毒的化学和结构研究阶段 v病毒研究的细胞水平时期病毒研究的细胞水平时期 v分子病毒学的研究时期分子病毒学的研究时期 3病毒病的病原研究阶段病毒病的病原研究阶段 v自病毒发现直到上个世纪自病毒发现直到上个世纪30年代初，病毒学研究主要集中在：分离和鉴定年代初，病毒学研究主要集中在：分离和鉴定 引起各种病毒性疾病的病毒；病毒对疾体所引起的特异性病理效应；病毒引起各种病毒性疾病的病毒；病毒对疾体所引起的特异性病理效应；病毒 的传播方式和感染宿主范围；各种理化因子对病毒感染的影响等方面的传播方式和感染宿主范围；各种理化因子对病毒感染的影响等方面。v在这一阶段，人们对病毒本质的认识还很肤浅，认为病毒是一种与细菌类在这一阶段，人们对病毒本质的认识还很肤浅，认为病毒是一种与细菌类 似的病原体，所不同的仅在于病毒必须在生活的细胞内才能繁殖，再就是似的病原体，所不同的仅在于病毒必须在生活的细胞内才能繁殖，再就是 体积十分微小，以致在显微镜下不能见到，能够通过细菌滤器。这也正是体积十分微小，以致在显微镜下不能见到，能够通过细菌滤器。这也正是 在那一时期把病毒称之为在那一时期把病毒称之为“超显微的滤过性病毒超显微的滤过性病毒”的原因。的原因。 4病毒的化学和结构研究阶段病毒的化学和结构研究阶段 v1934年年M.Schlesinger获得了纯化的噬菌体；获得了纯化的噬菌体；1935年，美国生化学家年，美国生化学家Stanley第一次提纯了烟草花叶病毒（简称第一次提纯了烟草花叶病毒（简称TMV），因为这项贡献），因为这项贡献 1946年被授予诺贝尔奖，这是病毒学领域第一个获此殊荣的科学家；年被授予诺贝尔奖，这是病毒学领域第一个获此殊荣的科学家；1938年年W.J.Elford测定了各种病毒颗粒大小；测定了各种病毒颗粒大小； 1939年，年，G.A.Kansche在电镜下在电镜下直接观察到直接观察到TMV ；1955年，年，Scaffer和和Schwerdt成功结晶了脊髓灰质炎成功结晶了脊髓灰质炎病毒，这是第一个被结晶出来的动物病毒；等等。病毒，这是第一个被结晶出来的动物病毒；等等。v这一阶段，病毒学工作者主要采用敏感动物（如小白鼠）或动物胚胎这一阶段，病毒学工作者主要采用敏感动物（如小白鼠）或动物胚胎（如鸡胚）来研究病毒，分离鉴定了近百种病毒。同时在机体水平上研（如鸡胚）来研究病毒，分离鉴定了近百种病毒。同时在机体水平上研究了病毒的繁殖、发病机理和免疫反应等。只是微生物学的一个分支。究了病毒的繁殖、发病机理和免疫反应等。只是微生物学的一个分支。5病毒的细胞水平研究时期病毒的细胞水平研究时期 v利用大肠杆菌研究噬菌体的感染过程取得了迅速发展利用大肠杆菌研究噬菌体的感染过程取得了迅速发展v组织培养技术开始应用于动物病毒的研究组织培养技术开始应用于动物病毒的研究 我国学者黄祯祥早在我国学者黄祯祥早在1943年就利用鸡胚组织块在试管内进行病毒传代、定量滴定及年就利用鸡胚组织块在试管内进行病毒传代、定量滴定及中和试验。中和试验。 组织培养技术对动物病毒研究所作的贡献主要包括：病毒转录新途径和翻译新途径组织培养技术对动物病毒研究所作的贡献主要包括：病毒转录新途径和翻译新途径的发现；病毒对宿主范围的选择；某些肿瘤病毒引起的细胞转化；某些病毒侵染引的发现；病毒对宿主范围的选择；某些肿瘤病毒引起的细胞转化；某些病毒侵染引起的细胞融合；发现有的病毒核酸由若干片段组成；有的病毒核酸具有极性的不同，起的细胞融合；发现有的病毒核酸由若干片段组成；有的病毒核酸具有极性的不同，如小如小RNA病毒为正链病毒为正链RNA病毒，正粘病毒为负链病毒，正粘病毒为负链RNA病毒。病毒。 v植物病毒不断有重要的发现植物病毒不断有重要的发现 此阶段，病毒学逐步形成了一门独立的学科。此阶段，病毒学逐步形成了一门独立的学科。6分子病毒学的研究时期分子病毒学的研究时期 自从自从1953年年DNA双螺旋结构理论建立以来，由于分子生物学双螺旋结构理论建立以来，由于分子生物学的迅速发展，使病毒学的研究步入了分子病毒学的发展时期，的迅速发展，使病毒学的研究步入了分子病毒学的发展时期，分子病毒学也正是分子生物学的发展过程中应运而生。分子分子病毒学也正是分子生物学的发展过程中应运而生。分子病毒学的发展是各相关学科如分子生物学、细胞生物学、遗病毒学的发展是各相关学科如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学与病毒学理论和技术相互渗透的结果。尤其是传学、免疫学与病毒学理论和技术相互渗透的结果。尤其是分子生物学新技术的发明极大剌激了分子病毒学的发展。分子生物学新技术的发明极大剌激了分子病毒学的发展。 7时间时间研究者研究者成果成果19531953年年Watson,CrickWatson,Crick建立建立DNADNA双螺旋结构理论双螺旋结构理论, ,为分子生物学和分子病毒学的创立奠定基础为分子生物学和分子病毒学的创立奠定基础19621962年年D.L.D.CasfarD.L.D.Casfar阐明病毒的二十面体结构，是对病毒超微结构认识的重大突破阐明病毒的二十面体结构，是对病毒超微结构认识的重大突破19621962年年D.NathansD.Nathans进行了噬菌体进行了噬菌体RNARNA的体外翻译的体外翻译19651965年年S.SpiegelmanS.Spiegelman体外复制出体外复制出QQ噬菌体噬菌体RNARNA19671967年年M.GoulianM.Goulian体外复制体外复制X174X174噬菌体噬菌体, ,对以后阐明对以后阐明DNADNA病毒和病毒和RNARNA病毒的繁殖机制起了重要作用病毒的繁殖机制起了重要作用19671967年年T.O.DienerT.O.Diener发现类病毒发现类病毒, ,揭示了自然界存在着比病毒更简单的生物揭示了自然界存在着比病毒更简单的生物, ,加深了对生命起源的认识。加深了对生命起源的认识。19681968年年P.H.DuesbergP.H.Duesberg发现流感病毒的多节段发现流感病毒的多节段RNARNA基因组基因组19701970年年P.H.DuesbergP.H.Duesberg发现发现RousRous肉瘤病毒含有癌基因肉瘤病毒含有癌基因v-srcv-src，使人们对肿瘤发生的机制有了更深刻的了解，使人们对肿瘤发生的机制有了更深刻的了解19701970年年H.M.Temin,D.BaH.M.Temin,D.Baltimorltimor分别发现了病毒的逆转录酶，这是对分别发现了病毒的逆转录酶，这是对Crick 1958Crick 1958年提出的遗传学中心法则的重要补充和发展年提出的遗传学中心法则的重要补充和发展19711971年年限制性内切酶技术的发现成功地为乳头瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、疱疹病毒构建了酶切图谱限制性内切酶技术的发现成功地为乳头瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、疱疹病毒构建了酶切图谱19771977年年SangerSanger完成了完成了X174-DNAX174-DNA全部序列的测定，发现了发现了基因重叠现象全部序列的测定，发现了发现了基因重叠现象19771977年年L LT TChowChow阐明了腺病毒转录过程中的阐明了腺病毒转录过程中的mRNAmRNA拼接现象，从而明确了内含子和外显子的概念拼接现象，从而明确了内含子和外显子的概念19781978年年W WFiers Fiers V.B.ReddyV.B.Reddy测定了测定了SV40-DNASV40-DNA的一级结构由的一级结构由52245224个碱基对组成。个碱基对组成。SV40SV40是第一个全部核苷酸序列被搞清楚的病毒是第一个全部核苷酸序列被搞清楚的病毒分子病毒学的研究时期的研究成果（一）分子病毒学的研究时期的研究成果（一）8时间时间研究者研究者成果成果19791979年年T TTaniguchiTaniguchi用载体成功地表达了人干扰素基因用载体成功地表达了人干扰素基因19811981年年D.K.KleidD.K.Kleid利用重组利用重组DNADNA技术制备出口蹄疫病毒疫苗技术制备出口蹄疫病毒疫苗19821982年年J.SummersJ.Summers发现乙型肝炎病毒发现乙型肝炎病毒DNADNA复制中有逆转录过程复制中有逆转录过程19821982年年B.MossB.Moss，E.PaolettiE.Paoletti用痘苗病毒作为载体表达外源基因用痘苗病毒作为载体表达外源基因19831983年年MontagnierMontagnier，R.C.GalloR.C.Gallo分别分离到与分别分离到与AIDSAIDS相关的人类逆转录病毒（相关的人类逆转录病毒（HIVHIV）19851985年年H.Vonder H.Vonder PattenPatten阐明了鼻病毒的晶体结构阐明了鼻病毒的晶体结构19881988年年ChuoChuo，YamayaYamaya用弱病毒全长用弱病毒全长cDNAcDNA导入产生抗病毒的转化植株导入产生抗病毒的转化植株19911991年年HanHan将将MoloneyMoloney鼠白血病毒的反义表达序列导入小鼠受精卵中，从而培育成功对该病毒有抗性的转基因小鼠鼠白血病毒的反义表达序列导入小鼠受精卵中，从而培育成功对该病毒有抗性的转基因小鼠19921992年年DesrosiersDesrosiers利用利用SIV mac239/nefSIV mac239/nef缺失突变株制备出减毒活疫苗，取得了抗缺失突变株制备出减毒活疫苗，取得了抗SIVSIV感染成功感染成功19931993年年K.MullisK.Mullis发明了发明了PCRPCR仪仪19951995年年HIVHIV天冬氨酰蛋白酶三维结构的鉴定，使得一些针对病毒蛋白酶活性位点的抑制剂先后问世天冬氨酰蛋白酶三维结构的鉴定，使得一些针对病毒蛋白酶活性位点的抑制剂先后问世19961996年年David HoDavid Ho利用逆转录酶抑制剂与蛋白酶抑制剂配成的利用逆转录酶抑制剂与蛋白酶抑制剂配成的“鸡尾酒鸡尾酒”式药，成功地抵抗了式药，成功地抵抗了HIVHIV感染感染19971997年年S.PrusinerS.Prusiner发现羊瘙痒病致病因子是朊病毒，提出疯牛病、发现羊瘙痒病致病因子是朊病毒，提出疯牛病、KuruKuru病等脑退化性疾病是由朊病毒引起，从而获诺贝病等脑退化性疾病是由朊病毒引起，从而获诺贝尔医学奖尔医学奖分子病毒学的研究时期的研究成果（二）分子病毒学的研究时期的研究成果（二）9病毒感染性疾病病毒感染性疾病v肝炎病毒（肝炎病毒（Hepatitis Virus）v人类免疫缺陷病毒（人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus,HIV）v人乳头瘤状病毒（人乳头瘤状病毒（human papillomavirus , HPV ）vEB病毒（病毒（Ebstein-Barr Virus, EBV）vSARS冠状病毒冠状病毒(SARS-associated coronavirus, SARS-CoV)v甲型甲型H1N1流感病毒（流感病毒（Influenza A(H1N1) virus ）v手足口病病毒（手足口病病毒（Hand, foot and mouth disease Virus ）10肝炎病毒（肝炎病毒（Hepatitis Virus） 引起肝炎的病毒有多种类型，包括甲型肝炎病毒(Hepatitis A virus, HAV)、乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)、丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus, HCV)、丁型肝炎病毒(Hepatitis D virus, HDV)、戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus, HEV)等，分别能够引起甲型、乙型、丙型、丁型、戊型5种肝炎症状。近年又发现有己型肝炎（HFV引起）和庚型肝炎(HGV引起)出现。 11（一）（一） 乙型肝炎病毒乙型肝炎病毒结构和特点：HBsAg：是HBV感染的主要标志HBsAb：保护性抗体HBcAg：仅存于感染的肝细胞核内，一般不存在于血循环中HBcAb: 非保护性抗体，HBcAb-IgM提示HBV处于复制状态HBeAg：HBV复制及强感染性的指标HBeAb：有一定的保护作用，预后良好12 HBV感染的诊断vELISA方法，但只能提供血清中的HBV间接证据，无法证明是否具有传染性检测血清标本中的HBSAg，HbeAg，抗-Hbs，抗-HBc和抗-Hbe（两对半）：比较简单，而且敏感性较低。v内源性DNA聚合酶法和斑点杂交分析法：可直接确定临床标本中HBV DNA的存在。比较敏感，能检测到0.1pg的HBV DNA。v 荧光定量PCR方法：可检测到200copy/ml的HBV DNA。 可 检出杂交法测定阴性而具有不同HBV血清学标志的血清标本中的 HBV DNA。可检出HBs Ag阳性而Hbe Ag阴性携带者的HBV DNA。 可检出慢性HBV感染-干扰素治疗后转阴的患者血清中残存的HBV DNA。（一） 乙型肝炎病毒13应用核酸扩增技术应用核酸扩增技术(NAT)(NAT)是降低是降低HBVHBV残留危险性的重要策略残留危险性的重要策略14病毒特点： 1. 单正链RNA病毒 2. E1和E2区基因高度变异性（二）丙型肝炎病毒感染特点：1.HCV在血中含量极微 2.输血后肝炎主要致病因子3.免疫学标志仅有抗-HCV，非中和抗体，产生时间不一4.有一部分人感染HCV后，不产生抗-HCV 5.感染易于慢性化(50-85%)6.疫苗研制尚不成功单链RNA15HCVHCV的流行病学的流行病学v全世界的感染人群约有全世界的感染人群约有1.71.7亿亿v75% HCV75% HCV感染发展成慢性感染发展成慢性vHCVHCV感染发展成有症状的肝病需要十年以上感染发展成有症状的肝病需要十年以上v可引起慢性肝炎、肝硬化、肝细胞癌可引起慢性肝炎、肝硬化、肝细胞癌v通过输血、静脉用药传播通过输血、静脉用药传播v血清中出现血清中出现HCVHCV抗体在感染后抗体在感染后5454192192天天16 vELISA方法检测方法检测HCV抗体：筛查试验抗体：筛查试验 vRIBA：确证试验：确证试验v HCV RNA检测：确证试验检测：确证试验 HCV感染的诊断感染的诊断17 抗HCV筛查及确认试验结果的解释筛查试验结筛查试验结确认试验结确认试验结 果果结果报告结果报告 解解 释释阴阴 性性不需检测不需检测抗抗HCV阴性阴性未感染未感染HCV,除非怀疑是最近感染除非怀疑是最近感染,或有其它证据表明或有其它证据表明有有HCV感染感染阳性且阳性且S/CO 值高值高未检测未检测抗抗HCV阳性阳性提示既往或现症提示既往或现症HCV感染感染. 未进行确认验未进行确认验.S/CO值高值高的标本一般均为确认阳性的标本一般均为确认阳性(95%),但尚有但尚有5%的的标本可能为假阳性标本可能为假阳性,可在患者要求下进行确认试可在患者要求下进行确认试验验.阳性阳性阳性阳性抗抗HCV阳性阳性提示既往或现症提示既往或现症HCV感染感染阳性阳性阴性阴性抗抗HCV阴性阴性未感染未感染HCV,除非怀疑是最近感染除非怀疑是最近感染,或有其它证据表明或有其它证据表明有有HCV感染感染阳性阳性不确定不确定抗抗HCV不确定不确定不能确定抗不能确定抗HCV及及HCV感染状态感染状态,;应再采集另一份应再采集另一份标本重测抗标本重测抗HCV(1个月个月)或或HCV RNA阳性阳性HCV RNA阳性阳性抗抗HCV 阳性阳性HCV RNA阳性阳性提示活动性提示活动性HCV感染感染阳性阳性RIBA 阳性阳性HCV RNA阴性阴性抗抗HCV 阳性阳性HCV RNA阴性阴性抗抗HCV阳性提示既往或现症阳性提示既往或现症HCV感染感染.单个单个HCV RNA阴性结果不能排除活动性感染阴性结果不能排除活动性感染阳性阳性RIBA 阴性阴性HCV RNA阴性阴性抗抗HCV 阴性阴性HCV RNA阴性阴性未感染未感染HCV阳性阳性RIBA 不确定不确定HCV RNA阴性阴性抗抗HCV 不确定不确定HCV RNA阴性阴性抗抗HCV筛查结果可能为假阳性筛查结果可能为假阳性,此时此时,提示未感染提示未感染HCV18 HCV-RNA定量检测的临床意义定量检测的临床意义v 早期诊断：早期诊断： HCV感染感染1-3W，即可检出，即可检出HCV-RNA的存在。的存在。v HCV-RNA载量与抗载量与抗-HCV滴度、滴度、ALT水平之间的相关性：抗水平之间的相关性：抗-HCV滴滴 度和度和ALT异常率随着异常率随着HCV-RNA载量升高而增加。载量升高而增加。v HCV-RNA是评价抗病毒治疗效果的重要指标。是评价抗病毒治疗效果的重要指标。v 慢性丙型肝炎长期抗慢性丙型肝炎长期抗-HCV阳性，这时如果进行阳性，这时如果进行HCV-RNA 定量检测定量检测 可以鉴别活动性、复制程度。可以鉴别活动性、复制程度。1920人类免疫缺陷病毒人类免疫缺陷病毒(HIV)19821982年发现第年发现第1 1例经输血传播例经输血传播HIVHIV19851985年开始检测血液和血液制品年开始检测血液和血液制品还可通过母婴垂直传播和性接触传播还可通过母婴垂直传播和性接触传播可变的潜伏期可变的潜伏期普遍的症状包括夜汗、体重下降、普遍的症状包括夜汗、体重下降、 腹泻、鹅腹泻、鹅口疮、紫癜口疮、紫癜慢性感染，但多种药物治疗可降低病毒滴度慢性感染，但多种药物治疗可降低病毒滴度21人类免疫缺陷病毒(HIV)艾滋病有三个特性：艾滋病有三个特性：v 获得性获得性-艾滋病并非先天具有，而是后天获得。艾滋病并非先天具有，而是后天获得。v 免疫缺陷免疫缺陷-AIDS的发病机理在于，的发病机理在于，HIV通过造成人体免疫系通过造成人体免疫系 统的损伤，进而导致免疫系统防护功能的减低甚至丧失。统的损伤，进而导致免疫系统防护功能的减低甚至丧失。v 综合症综合症-在临床症状方面，由于免疫缺陷导致的各个系统的在临床症状方面，由于免疫缺陷导致的各个系统的 机会性感染、肿瘤而出现复杂的伴随症状群。机会性感染、肿瘤而出现复杂的伴随症状群。 22人类免疫缺陷病毒(HIV) HIV, the virus that causes AIDS, is shown budding out of a human immune cell.23人类免疫缺陷病毒(HIV)HIV病毒：多亚型和多变异HIV-1和HIV-2M组、O组和N组亚型：A-KCRF：基因重组亚型，主要是HIV-1型毒株亚型监测的意义 不同亚型与不同传播途径的关系：B主要通过男性同性性行为和静脉注射吸毒传播，C主要异性性接触传播 流行地理和传播线路的分析：东南亚区域的C亚型和B亚型 重组亚型传播效力变化及对流行的影响：东欧的B/A重组流行、泰国的A/E重组24 HIV在外界的抵抗力vHIV病毒一旦离开宿主细胞在外界环境中生存能力很快消失vHIV对环境中的物理因素和化学因素抵抗力均较弱，比乙型肝炎病毒（HBV）的抵抗力低得多v对HBV有效得消毒和灭活方法均适用于HIV人类免疫缺陷病毒(HIV)25HIV感染的三种结局v典型进展者：8-10年潜伏期后成为艾滋病人，80% -90%v快速进展者：CD4细胞2-5年内迅速下降，HIV病毒载量一直维持较高水平，而且分离的HIV有均一性。v长期存活者（又称长期不进展者）：维持15年以上，而且CD4计数维持正常，在所有感染者中比例一般在8%-10%。人类免疫缺陷病毒(HIV)26HIV感染的三种结局v典型进展者：8-10年潜伏期后成为艾滋病人，80% -90%v快速进展者：CD4细胞2-5年内迅速下降，HIV病毒载量一直维持较高水平，而且分离的HIV有均一性。v长期存活者（又称长期不进展者）：维持15年以上，而且CD4计数维持正常，在所有感染者中比例一般在8%-10%。人类免疫缺陷病毒(HIV)27vHIV抗体的检测抗体的检测vP24抗原的检测抗原的检测vHIV 核酸检测核酸检测HIV感染的实验室诊断感染的实验室诊断2829酶联免疫吸附试验(ELISA)明胶凝集试验各种快速诊断试剂检测亚型包括HIV-1、HIV-2和HIV-1型的O亚型，窗口期由10周缩短至34周。HIV抗体的检测抗体的检测30HIV抗体的检测抗体的检测 按按规规范范要要求求，我我国国采采供供血血机机构构进进行行血血液液筛筛查查和和各各医医疗疗卫卫生生机机构构常常规规筛筛查查检检测测宜宜采采用用ELISA法法。对对用用ELISA试试剂剂或或快快速速诊诊断断试试剂剂进进行行的的筛筛查查实实验验如如呈呈阴阴性性反反应应，即即报报告告HIV抗抗体体阴阴性性；对对呈呈阳阳性性反反应应的的标标本本，筛筛查查实实验验室室应应用用原原有有试试剂剂和和另另外外一一种种不不同同原原理理或或不不同同厂厂家家的的试试剂剂进进行行重重复复检检测测，如如两两种种试试剂剂复复测测均均呈呈阴阴性性反反应应，则则报报告告HIV抗抗体体阴阴性性；如如均均呈呈阳阳性性反反应应，或或一一阴阴一一阳阳，需需送送艾艾滋滋病病确确认认实实验验室室进进行行确确认认。筛筛查查试试剂剂必必须须是是HIV-1/2混混合合型型、经经国国家家药药品品监监督督管管理理局局(SDA)注注册册批批准准、批批检检合合格格、临临床床评评估估质质量量优优良良、在有效期内的试剂。在有效期内的试剂。 人类免疫缺陷病毒(HIV)31免疫印迹试验条带免疫试验免疫荧光试验HIV确认试验确认试验32ELISA双抗体夹心法双抗体夹心法 阳阳性性结结果果必必须须经经中中和和试试验验确确认认，该该结结果果才才可可作作为为HIV感感染染的的辅辅助助诊诊断断依依据据。HIV-1 P24抗抗原原检检测测阴阴性性，只只表表示示在在本本试验中无反应，不能排除试验中无反应，不能排除HIV感染。感染。 在在窗窗口口期期检检测测P24抗抗原原是是早早期期辅辅助助诊诊断断和和进进一一步步缩缩短短窗窗口口期期的的一一种种方方法法，还还可可用用于于HIV阳阳性性母母亲亲所所生生婴婴儿儿的的早早期期辅辅助鉴别诊断。助鉴别诊断。P24抗原抗原的检测的检测33检检测测HIV RNA通通常常使使用用PCR或或RT-PCR技技术术， 核核酸酸序序列列扩扩增增实实验验(NASBA)、分分支支DNA杂交实验等杂交实验等 注注意意： HIV核核酸酸定定性性检检测测阴阴性性，只只可可报报告告本本次次实实验验结结果果阴阴性性，但但不不能能排排除除HIV感感染染；HIV核核酸酸检检测测阳阳性性，可可作作为为诊诊断断HIV感感染染的的辅辅助助指指标标，不不能能单单独独用用于于HIV感感染染的的诊诊断断，报报告告定定性性检检测测结结果果时时还还应应注注明明反反应应条条件件和和所所使使用用的的引引物物序序列列。报报告告HIV核核酸酸定定量量检检测测结结果果时时应应按按照照仪仪器器读读数数报报告告结结果果，注注明明使使用用的的试试验验方方法法、样样品品种种类类和和样样品品量量，当当测测定定结结果果小小于于最最低低检检测测限限时时，应应注注明明最最低低检测限水平，低于最低检测限的结果不能排除检测限水平，低于最低检测限的结果不能排除HIV感染。感染。HIV核酸检测核酸检测34vCD4+T淋巴细胞计数淋巴细胞计数v血浆血浆HIV RNA水平水平(病毒载量病毒载量) 这这两两项项实实验验可可以以为为临临床床医医生生提提供供病病人人病病毒毒水水平平、免免疫疫状状态态的的相相关关资资料料，是是预预测测疾疾病病进进程程的的可可靠靠指指标标，还还可可独立预测艾滋病临床过程和生存期。独立预测艾滋病临床过程和生存期。HIV感染的实验室监测感染的实验室监测35 流流式式细细胞胞仪仪是是检检测测CD4+T淋淋巴巴细细胞胞计计数数的的标标准准方方法法，可可以以得得出出CD4+T细细胞胞占占淋淋巴巴细细胞胞的的比比值值及及绝绝对对值值。CD4+T细胞计数是艾滋病诊断、疾病分期的实验室标准指标。细胞计数是艾滋病诊断、疾病分期的实验室标准指标。CD4+T淋巴细胞计数淋巴细胞计数36 HIV病毒耐药分为原发性病毒耐药分为原发性(Primary)及继发性及继发性(Secondary) v原发性原发性HIV病毒耐药：指那些直接影响抗病毒药物作用靶点的变病毒耐药：指那些直接影响抗病毒药物作用靶点的变异，具有药物特异性，可降低抗病毒药物敏感性异，具有药物特异性，可降低抗病毒药物敏感性v 继发性变异又称为补偿变异：常出现于原发性变异已存在的病毒继发性变异又称为补偿变异：常出现于原发性变异已存在的病毒基因组中，原发性变异可造成复制关键酶的改变，导致病毒动力基因组中，原发性变异可造成复制关键酶的改变，导致病毒动力学的不利，继发性变异可纠正由原发性变异导致的不利，提高病学的不利，继发性变异可纠正由原发性变异导致的不利，提高病毒的耐药性，对原发性变异起到保护和促进作用毒的耐药性，对原发性变异起到保护和促进作用HIV抗病毒治疗的耐药监测抗病毒治疗的耐药监测37 耐药性检测有两种方法耐药性检测有两种方法 v表型检测：通过用药期间的病毒培养进行表型检测：通过用药期间的病毒培养进行v基因型检测：通过分子生物学方法检测与耐药性相关的病毒基因突变基因型检测：通过分子生物学方法检测与耐药性相关的病毒基因突变v基因型检测的费用较低，较容易，可在样品收集后基因型检测的费用较低，较容易，可在样品收集后12周得到结果，但周得到结果，但分析基因型耐药检测时，需要掌握大量相关知识，如突变与抗病毒药物分析基因型耐药检测时，需要掌握大量相关知识，如突变与抗病毒药物及其它药物的交叉耐药等，才能对结果进行正确的分析。表型检测可以及其它药物的交叉耐药等，才能对结果进行正确的分析。表型检测可以直接检测病毒的耐药性，但操作复杂、耗时，技术要求高，且非常昂贵，直接检测病毒的耐药性，但操作复杂、耗时，技术要求高，且非常昂贵，因此目前国际上广泛应用于临床的是基因型耐药检测。因此目前国际上广泛应用于临床的是基因型耐药检测。38人乳头瘤状病毒人乳头瘤状病毒（human papillomavirus, HPV ）vHPV具有宿主和组织特异性，只能感染人的皮肤和黏膜上皮细胞，人是HPV的惟一宿主。v有100多个型v低危型：HPV 6、11引起良性病变 (尖锐湿疣、喉乳头瘤等)v高危型：HPV 16、18引起恶性肿瘤 (宫颈癌、肛门癌、口腔癌等)v新生儿产道感染。v免疫原性低，易形成持续性感染。 39 v高危型高危型 16.18.31.33.35.39.45.51.52.56.58.59. 68.73.82.亚型亚型CP8304 v可能高危型可能高危型 26.66.53v低危型低危型 6.11.40.42.43.44.54.61.70.72.81.cp6108 HPV型别型别4041HPVHPV中国型别分布中国型别分布HPV16(24.5%)HPV52(16.2%)HPV58(16.0%)HPV56HPV31乌兰娜乌兰娜, ,吴瑞芳等，人乳头瘤病毒基因亚型与宫颈病变的关系吴瑞芳等，人乳头瘤病毒基因亚型与宫颈病变的关系, ,中国妇产科临床杂志中国妇产科临床杂志 HPV16(32.9%)HPV58(18.8%)HPV52(16.9%)HPV18HPV3342Major capsid proteinMajor capsid proteinTransforming genes/growth stimulationTransforming genes/growth stimulationMinor capsid proteinMinor capsid proteinRegulation ofRegulation of viral replication viral replicationRegulation of viral transcriptionRegulation of viral transcription & replication & replicationURR43HPV442001年在欧洲由德国、法国和英国联合对二代杂交捕获HC2 HPV检测在宫颈癌筛查中的作用进行了大规模的研究和评估K.U. Petry, C. Clavel, A. Szarewski, T.Iftner, P.Birembaut, J.Cuzick23,890 (筛查人数）筛查人数）21,409HPV-细胞学细胞学-488HPV-细胞学细胞学+1370HPV+细胞学细胞学-523阴道镜检查阴道镜检查533无病例无病例 发现发现只发现只发现3个病例个病例发现发现59个病例个病例发现发现144个病例个病例HPV+细胞学细胞学+45HC2 与巴氏涂片对检测与巴氏涂片对检测CIN2或以上的病变或以上的病变的敏感度比较的敏感度比较法国法国英国英国德国德国总数总数HC2100%97.7%97.8%98.6%巴氏涂片巴氏涂片68.1 87.9%83.1%43.5%71.4%HC2+巴氏巴氏涂片涂片100%100%100%100%46各地区细胞学与各地区细胞学与HPV敏感度结果比较筛查敏感度结果比较筛查PapHPVPap+HPV47 “HPV相比其它所有的宫颈癌筛查方法重复性更好，是值得信赖的、可靠的宫颈癌初筛新方法。”4849HPV-DNA分型检测的意义分型检测的意义 ：v监测子宫颈上皮内高度病变监测子宫颈上皮内高度病变v区分患者患宫颈癌的危险度区分患者患宫颈癌的危险度v筛查宫颈细胞低度病变（筛查宫颈细胞低度病变（ASCUS或或CINI）中潜在的宫）中潜在的宫颈癌颈癌v高危患者高危患者v用于手术后追踪以确定是否将病灶清除干净用于手术后追踪以确定是否将病灶清除干净v用于治疗后的随访用于治疗后的随访v指导指导HPV疫苗的研究及使用疫苗的研究及使用v评估治疗疗效评估治疗疗效 50EBEB病毒病毒v19641964年名年名Esptein-Barr Esptein-Barr 首先发现、命名首先发现、命名v19661966年年OldOld等首先证实等首先证实EBEB病毒和鼻咽癌的血清病毒和鼻咽癌的血清学关系学关系v19681968年年HenleHenle等证明该病毒是传染性单核细胞等证明该病毒是传染性单核细胞增多症的病原体增多症的病原体51EBEB病毒特异性抗原病毒特异性抗原v病毒潜伏感染时表达的抗原：病毒潜伏感染时表达的抗原： EBEB病毒核抗原（病毒核抗原（EBNAEBNA） EBEB病毒潜伏感染膜抗原（病毒潜伏感染膜抗原（EBLMPEBLMP）v病毒增殖感染相关抗原：病毒增殖感染相关抗原： EBEB病毒特异性抗原病毒特异性抗原EBEB病毒早期抗原（病毒早期抗原（EAEA） EBEB病毒衣壳抗原（病毒衣壳抗原（VCAVCA） EBEB病毒膜抗原（病毒膜抗原（MAMA）5253EBVEBV感染时主要抗病毒抗体产生的模式感染时主要抗病毒抗体产生的模式54SARSSARS冠状病毒冠状病毒v一种新的烈性呼吸道传染病。一种新的烈性呼吸道传染病。v疾病的病原体（疾病的病原体（SARSSARS冠状病毒；冠状病毒；SARA-CoVSARA-CoV）。）。vSARSSARS为全身损伤性疾病，尤以肺组织、免疫为全身损伤性疾病，尤以肺组织、免疫组织及小静脉为主。组织及小静脉为主。vSARSSARS的临床诊断标准明确，实验室的辅助手的临床诊断标准明确，实验室的辅助手段是抗段是抗-SARA-CoV IgM-SARA-CoV IgM的检测和病毒的核酸分的检测和病毒的核酸分析。析。555657甲型甲型H1N1流感病毒流感病毒 甲型流感病毒根据其表面甲型流感病毒根据其表面(H和和N)结构及结构及其基因特性的不同又可分成许多亚型，其基因特性的不同又可分成许多亚型，至今甲型流感病毒已发现的血凝素有至今甲型流感病毒已发现的血凝素有16个亚型个亚型(H1-H16)，神经氨酸酶，神经氨酸酶9个亚型个亚型(N1-N9)。58 世界卫生组织2009年4月30日宣布，从当日起，该组织不再使用“猪流感”一词，而开始使用“A（H1N1）型流感”一词。与之相对应，我国的官方文件从5月1日起相继用“甲型H1N1流感”代替原来的“人感染猪流感”。甲型甲型H1N1流感流感59 甲型H1N1流感病毒属于正粘病毒科，典型病毒颗粒呈球状，直径为80 nm120 nm，有囊膜。囊膜上有许多放射状排列的突起糖蛋白，分别是血凝素HA、神经氨酸酶NA 和M2蛋白。病毒颗粒内为核衣壳, 呈螺旋状对称, 直径为10nm。甲型H1N1流感病毒为单股负链RNA 病毒，基因组约为13.6 kb，由大小不等的8 个独立片段组成。 甲型H1N1流感60甲型H1N1流感61流行病病学特点传染源 主要为病猪和携带病毒的猪，感染猪流感病毒的人也被证实可以传播病毒。感染这种病毒的动物均可传播。传播途径 主要为呼吸道传播，也可通过接触感染的猪或其粪便、周围污染的环境或气溶胶等途径传播。某些毒株如H1N1可在人与人之间传播，其传染途径与流感类似，通常是通过感染者咳嗽或打喷嚏等。易感人群 普遍易感。患者多数年龄在25岁至45岁之间，目前报道以青壮年为主，应注意老人和儿童。甲型H1N1流感62实验室检查v外周血象：白细胞总数一般不高或降低。重症患者多有白细胞总数及淋巴细胞减少，并有血小板降低；v血清学诊断：可使用间接ELISA、抗原捕捉ELISA、荧光免疫法等；v反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）：由于PCR技术具有简便、快速、灵敏、特异性强等特点，已用于猪流感病毒基因的检测和分子流行病学调查等；v病毒分离：从患者呼吸道标本中（咽拭子、口腔含漱液、鼻咽或气管吸出物、痰或肺组织）分离甲型H1N1流感病毒。常用的方法有鸡胚接种法和细胞培养法。现有的诊断方法中，病毒分离法是较敏感的，但需要2-3周时间。甲型H1N1流感63v1957年在加拿大首次报告，新西兰年在加拿大首次报告，新西兰Seddon于于1957年最早加以描述，年最早加以描述，1958年加拿大年加拿大Robinson从患者粪便和咽拭中分离出从患者粪便和咽拭中分离出CoxA16，同时，同时患者血清抗体有四倍增长患者血清抗体有四倍增长,初步查明初步查明CoxA16为本病病原；为本病病原；v1959年提出年提出HFMD命名，命名，HFMD在全球广泛流行，无明显的地域分布。在全球广泛流行，无明显的地域分布。v之后世界各地均经常发生由各型柯萨奇、埃可病毒和之后世界各地均经常发生由各型柯萨奇、埃可病毒和EV 71引起的手引起的手足口病流行。足口病流行。v发热, 不适不适, 咽喉咽喉肿痛痛, 口腔、手、脚侧面及掌心、屁股出现小泡口腔、手、脚侧面及掌心、屁股出现小泡v传染性极高传染性极高v病程约病程约1周周手足口病病毒手足口病病毒（Hand, foot and mouth disease Virus ）64v手足口病可由多种手足口病可由多种肠道病毒所引起，其中包括道病毒所引起，其中包括 CoxA5,A10, A16, A19, EV71,以及部分埃可病毒和柯以及部分埃可病毒和柯萨奇奇B组病毒病毒, 以以CoxA16 和和 EV71最最为常常见 v传播途径播途径: 粪-口途径口途径传播播: 唾液与唾液与粪便便; 呼吸道呼吸道传播播: 空气空气飞沫沫; 接触接触传播播v 疱疹液中含大量病毒，疱疹破疱疹液中含大量病毒，疱疹破溃后病毒排出。后病毒排出。v HFMD为全球性全球性传染病，在全球广泛分布，无明染病，在全球广泛分布，无明显的地域分布的地域分布, 但但 近近年年EV71在在东南南亚一一带流行流行, 引起引起较多的重症和死亡病例。多的重症和死亡病例。v在在80年代和年代和90年代，中国手足口病的流行主要以年代，中国手足口病的流行主要以 CoxA16为主，主， 2008年，年，CoxA16 和和EV71 共循共循环引起手足口病爆引起手足口病爆发, EV71在大部分在大部分省市省市为优势病毒。病毒。 65手足口病病毒（Hand, foot and mouth disease Virus ）6667患者年龄分布手足口病病毒（Hand, foot and mouth disease Virus ）67人肠道病毒感染的一般致病机制进入途径进入途径口腔口腔/ /呼吸道呼吸道咽喉及下肠胃道咽喉及下肠胃道传播传播扁桃体扁桃体、深层淋巴结深层淋巴结、肠道淋巴结肠道淋巴结微病毒血症微病毒血症先天性感染先天性感染神经系统神经系统心心脏脏肝脏肝脏、胰脏、胰脏、肾上腺肾上腺呼吸系统呼吸系统皮肤及黏膜皮肤及黏膜病毒血症病毒血症神经系统神经系统抗体产生抗体产生、病毒血症消失病毒血症消失，病毒感染症状改善病毒感染症状改善飞沫、接触、饮食飞沫、接触、饮食肌肉肌肉68致病特点致病特点v隐性感染多见，很少引起腹泻，婴幼儿、免疫力低下的成人隐性感染多见，很少引起腹泻，婴幼儿、免疫力低下的成人易感。易感。 v病毒在机体肠道中增殖，很少引起肠道症状，是以消化道为病毒在机体肠道中增殖，很少引起肠道症状，是以消化道为原发灶的全身感染。原发灶的全身感染。v不同人肠道病毒可引起相同症状，同一种人肠道病毒可引起不同人肠道病毒可引起相同症状，同一种人肠道病毒可引起不同临床表现。不同临床表现。v感染过程中形成病毒血症。感染过程中形成病毒血症。69中国中国HFMD的流行的流行1981年，我国在上海首次年，我国在上海首次报道了道了HFMD病例病例1987年在中国分离到年在中国分离到CVA161995年以来，我国年以来，我国陆续在武在武汉、深圳、上海、重、深圳、上海、重庆、山、山东和安徽等地的和安徽等地的HFMD患患者中分离到者中分离到EV71病毒。病毒。 2007年，山年，山东发生了手足口病爆发流行发生了手足口病爆发流行，累，累计报告报告HFMD病例病例39，606例，其中例，其中14例病例死亡。例病例死亡。实验室室检测发现EV71是引起山是引起山东临沂沂HFMD的主要病原，同的主要病原，同时还检测到到Echo3 和和/或或 CVA16。 2008年全国出年全国出现HFMD爆爆发流行流行,以以HEV71为优势,CVA16还有其它有其它EV共循共循环引引 起起70重症患者肠病毒的血清型96.6%92.5%84.2%94.7%65.3%100%85.7%96.6%712009年手足口病疫情部分统计感染近100万，手足口病仍然在摧残者祖国花朵的健康，预防治疗刻不容缓！72v1999-2008 五月间共有五月间共有1232 EV病例为重症病例，平均死病例为重症病例，平均死亡率为亡率为 13.96%。vEV71为重症病例中分离频率最高的血清型。为重症病例中分离频率最高的血清型。CB3次之。次之。vCA16/EV71/CA4/CA10/CB3/CA6是最常见的血清型。是最常见的血清型。v主要流行高峰在主要流行高峰在5-7月，在月，在9-11月可能会出现第二个流行高月可能会出现第二个流行高峰。峰。v在所有的病例中，在所有的病例中，1-5岁的患者占到了岁的患者占到了70%左右。左右。 73手足口病的实验室检测手足口病的实验室检测v手足口病的诊断一般是通过采集适当的临床标本后进行基因检手足口病的诊断一般是通过采集适当的临床标本后进行基因检测、抗原检测、血清学抗体检测、病毒分离和病毒鉴定，如果测、抗原检测、血清学抗体检测、病毒分离和病毒鉴定，如果没有采到合格的临床标本，或无法进行实验室检测。没有采到合格的临床标本，或无法进行实验室检测。v很多血清型的肠道病毒能引起手足口病，不同细胞系对不同病很多血清型的肠道病毒能引起手足口病，不同细胞系对不同病毒的敏感性是有所不同的，而不同时期肠道病毒的流行株也不毒的敏感性是有所不同的，而不同时期肠道病毒的流行株也不同。同。v通常用于肠道病毒分离的细胞系为通常用于肠道病毒分离的细胞系为RD、HEp-2、Vero等，联等，联合使用上述的两种或更多细胞有助于分离到更多的肠道病毒。合使用上述的两种或更多细胞有助于分离到更多的肠道病毒。74谢谢谢谢75