艾滋病检测技术艾滋病检测技术1检测的重要性n任何错误的诊断，包括假阳性或假阴性，都会对被检者甚至对家庭和社会都产生十分重要的影响 n艾滋病诊断的一项重要指标，也是控制HIV传播和控制艾滋病流行的重要手段 2检测的目的检测的目的 n诊诊断断 为确定个体HIV感染状况，包括临床检测和自愿咨询检测、术前检测、根据特殊需要进行的体检等。n监监测测 为了解不同人群HIV感染率及其变化趋势，检测的人群包括各类高危人群和一般人群n血血液液筛筛查查 为防止输血传播HIV而进行的检测，包括献血员筛查和原料血浆筛查。n临床治疗和预后的判断临床治疗和预后的判断 疗效观察和耐药性监测 3HIVHIV感染的实验室检测感染的实验室检测n常用常用HIVHIV病原学检测方法病原学检测方法: :n 病毒分离病毒分离n 抗原检测抗原检测n 核酸检测（核酸检测（ HIV核酸定性检测、HIV- RNA定量测定）n常用常用HIV抗体检测方法（均未能检测抗体检测方法（均未能检测N型）型）n 筛查实验方法筛查实验方法 ELISA，胶体金（硒），胶体金（硒）， PA 法，法，斑点斑点EIA ，唾液、尿液检测卡唾液、尿液检测卡 ，化学发光免疫分析化学发光免疫分析 确认实验方法确认实验方法 免疫印迹法，条带免疫法，免疫印迹法，条带免疫法， 放免法放免法,间接免疫荧光试验n其他其他 CD4+/CD8+ T cell 计数等计数等4病毒感染后病毒RNA和血清标记水平1020304050607080900病毒病毒RNA,抗原或抗体水平抗原或抗体水平HIV-1RNAAb to HIV-1p24 Ag5HIV HIV 抗抗 体体 检检 测测 方方 法法 酶联免疫吸附法酶联免疫吸附法 （ELISAELISA）最早出现、发展最快、至今仍普遍使用最早出现、发展最快、至今仍普遍使用 很高的灵敏度和特异性很高的灵敏度和特异性 适合对大量样品的检测适合对大量样品的检测 可以进行很方便的质控工作，因此是目前临床最常用的筛查可以进行很方便的质控工作，因此是目前临床最常用的筛查检测方法检测方法 6酶联免疫吸附试验（酶联免疫吸附试验（ELISAELISA） 目前主要使用第三代抗HIV抗体1/2试剂（即双抗原夹心法） 第四代ELISA试剂可同时检测P24抗原和抗HIV-1/2抗体。与第三代抗HIV-1/2试剂相比，检出时间提前了49d。7HIV ELISAHIV ELISA试剂的发展过程试剂的发展过程8第四代ELISA试剂n优点：缩短了窗口期n缺点：同时把抗原和抗体包被在反应板上，存在互相干扰的可能，检测的敏感性和特异性可能都会受到影响。第四代试剂检测p24抗原的敏感度(20100pg/m1)，单独检测p24抗原试剂的敏感度 (3.510pg/m1)。9HIV感染窗口期1st-2nd 代代3rd 代代=Detection limit2%。另外，文献报道大约4%20%的样品经过HIV初筛复检阳性后，WB结果为“不确定”。nWB不确定结果的出现确实给临床诊断带来困难，需要更多的时间和实验进一步确认，也会对受试者造成额外的心理负担。从另一方面而言，WB不确定结果确是受试者真实的血清学反应。39HIV抗体不确定n对于符合HIV抗体不确定判断标准，报告“HIV抗体不确定（）”，在备注中应注明“3个月后复检”，同时进行以下处理：n(1) 随访复检：每3个月随访复检1次，连续2次，共6个月。如果检测时暴露时间已超过3个月，则在3个月后随访1次即可。将前后2份样品同时检测，仍呈不确定或阴性则报告HIV抗体阴性，如果在随访期间发生带型进展，符合HIV抗体阳性判定标准则报告HIV-1或HIV-2抗体阳性。n(2) 必要时可做HIV-1 P24抗原或HIV核酸测定，但检测结果只能作为辅助诊断依据，确认报告要依据血清学随访结果。40HIV抗体不确定n当出现任何HIV病毒特异条带，但不足以被判断为阳性则判定为不确定结果。不仅初筛阳性的标本可以出现不确定的结果，初筛阴性的标本经WB检测也有大约15%出现针对一个或几个抗原的不确定结果。WB不确定结果中p24条带最常出现（60%91.6%），gp120/gp160出现的频率其次。WB不确定结果出现原因比较复杂，与检测对象、检测试剂和实验操作有关，详见下表。41WB不确定出现的原因不确定出现的原因 nHIV及相关感染 ：早期血清学转换 、AIDS晚期 、早产感染 、HIV缺失株感染 、免疫静止型AIDS 、HIV-2感染 、散发 HIV/SIV(猴免疫缺陷病毒) 。n其它逆转录病毒感染 ：山羊关节炎-脑炎病毒n其它临床状态 ：自身免疫疾病（系统性红斑狼疮，原发性干燥综合征）、麻风病、恶性肿瘤、高胆红素、高核蛋白、高类风湿因子n无感染 ：HIV阳性母亲所生的正常婴儿、未筛查血液制品的接受者、疫苗试验志愿者、保持WB结果不变的供者42WB不确定出现的原因不确定出现的原因n检测试剂 ：宿主细胞蛋白残留、判断准则、试剂盒的条件优化/稳定性n实验操作 ：交叉污染、试验程序、仪器设备、样本处理及溶血43其它确认试验其它确认试验线性免疫试验：线性免疫试验：将HIV的重组和合成多肽抗原包被在硝酸纤维素膜条上，用于检测样本中的HIV-1和（或）HIV-2抗体。该法可降低来自细胞培养的杂质蛋白污染而引起非特异反应，在欧洲应用广泛，大量研究报道称它的准确性与免疫印迹法相当。44其它确认试验其它确认试验n放射免疫沉淀试验：n用同位素标记的HIV蛋白与待检血清反应，若血清中含有HIV抗体即可与HIV蛋白抗原结合，再加入葡萄球菌蛋白A，经低速离心，然后将沉淀复合物分离后电泳，放射自显影观察同位素标记蛋白带即可判定。本法灵敏度和特异度均好，但因试剂制备复杂，成本高，且同位素操作需要严格防护而限制其应用。45其它确认试验其它确认试验n间接免疫荧光试验：n将HIV感染的细胞作为抗原固定在玻片上，再在其上滴加待检血清，若含有HIV 抗体，则与细胞膜上的病毒抗原结合，清洗后加荧光标记的抗人IgG，洗去未结合的荧光抗体，在荧光显微镜下观察结果，胞浆内出现特异性荧光，而对照孔没有特异性荧光，就可诊断为HIV抗体阳性。此法操作简便，敏感性及特异性均较ELISA法高，但存在对某些血清非特异性荧光难以去除，结果判断需要荧光显微镜，需要受过良好训练的技术人员，对结果的观察和解释易受主观因素的影响，结果也不宜长期保存。46HIV抗原的检测抗原的检测 n窗口期 ：HIV 感染人体后有一段窗口期，在这段时期病毒抗体不能被检出，但可以检测到病毒相关抗原或分离病毒。HIV-1感染机体后, 感染者血液中最早出现的是病毒gag基因表达产物p24抗原, 然后才出现相应的特异性抗HIV抗体, 以后随抗体滴度的升高p24抗原含量呈逐渐下降的趋势以至检测不出。在病情发展到AIDS期，病毒大量复制，机体免疫力下降，所产生的抗体不足以中和病毒抗原时，p24抗原在血中又可检测出。 47HIV抗原的检测抗原的检测n阳性母亲所生育婴儿检测：HIV阳性母亲所生育的婴儿30%可能已受到感染，但由于婴儿体内母源性抗HIV抗体可持续18个月之久，常规检测抗HIV抗体须要在婴儿18个月以后才能确定婴儿体内的HIV抗体是来自母体，还是自身产生，而HIV抗原的检测则可弥补这一不足。 48HIV抗原的检测抗原的检测nHIV-1抗体不确定n第四代HIV-1抗原/抗体ELISA试剂检测呈阳性反应，但HIV-1抗体确认阴性者的辅助诊断。n监测病程进展和抗病毒治疗效果n针对HIV抗体产生前的血液产品进行筛查 n对HIV病毒暴露但血清学阴性的个人进行早期感染的检测 49HIV抗原的检测抗原的检测n联免疫分析（ELISA）n放射免疫分析（RIA）n免疫荧光技术（IFA）n免疫吸附电镜法（Immunosorbent Electron Microscopical method，ISEM） 50ELISA检测P24抗原技术 n检测HIV感染敏感的常规方法 n双夹心抗体法（原理同双夹心抗原法）n假阳性高需用中和试验加以鉴别 51ELISA检测P24抗原改进技术n超敏感酶免疫测定法(Ultrasensitive enzyme immunoassay，UEI)又称双位点免疫复合物转移酶免疫测定，基本技术路线是利用高亲和力抗体浓缩富集血清中的P24抗原，然后进检测。该法可将下限延伸至0.2pgmln线性免疫酶测定(1ineal immunoenzymatic assy，LIA)和Cobas Core HIVCombi EIA是新近发展起来的第四代HIV检测技术。目前最敏感的抗原试剂盒的检测阀值为0.01pgml。 52HIV抗原检测局限性 p24蛋白只是个临时标志，急性感染期之后就很快降低到无法检测的水平，只有在病人的AIDS阶段才重新出现 HIV-1 P24 抗原的阳性结果必须经过中和试验确认，该结果仅作为 HIV 感染的辅助诊断依据，不能据此确诊 HIV-1 P24 抗原检测阴性只表示在本试验中无反应，不能排除HIV感染 53HIV核酸测定HIV核酸定性检测：是否存在病毒核酸HIV核酸定量检测：血液中病毒复制水平54HIV核酸定性检测 血浆、血清或全血中 HIV-1 RNA & DNA PCR & RT-PCR 方法55HIVPCR检测的主要用途婴儿HIV感染的诊断检测HIV前病毒DNA是婴儿HIV感染诊断首选的方法，与病毒培养和随访的符合率达到95-100%。HIV感染的早期诊断感染以后1-2周就可用PCR方法检测出HIV基因，比抗体出现的时间提前，使窗口期大大缩短，有利于早期诊断。HIV抗体检测不确定结果的诊断有助于及时阐明HIV抗体的不确定结果是早期HIV感染还是非特异性反应，在迫切需要诊断结果的时候很有用处。56HIVDNAPCR实验是婴儿HIV感染诊断首选的方法 HIVDNAPCR方法是在新生儿期诊断HIV感染的一种敏感的方法 38感染的孩子在出生后48小时HIVDNAPCR就可呈现阳性 在出生后第二周，检测的敏感性大幅度上升，14天时阳性率达到93 28天时阳性率是96，并且具有很高的特异性（大约99） 一次检测呈阳性提示可能存在HIV感染，应采集第二份标本重复病毒学实验以便进行确认。两次不同时间采集的标本HIV病毒学实验均为阳性即可得出HIV阳性的诊断 57对HIV阳性母亲所生新生儿的检测程序是： 出生后48小时进行第一次检测，大约38感染的婴儿可以在这个时期得出诊断 出生时检测为阴性的婴儿应在14天进行一次重复检测，因为病毒学实验检测的敏感性在2周时大幅度增加了 仍然阴性的婴儿应该在12个月时进行重复检测 出生时和12个月时病毒学检测为阴性的孩子应该在36个月时再次进行检测58HIV核酸定量测定n辅助诊断:n在一般情况下，HIV抗体检测足以对HIV感染与否做出正确诊断，但在特殊情况下，单纯抗体检测不足以完成明确的判定，如出现某些非典型的抗体反应形式，特别是不确定反应时，RNA的测定可提供非常有用的证据。虽然单纯使用RNA测定不能完全确定感染与否，但当RNA测定出现较高拷贝数的阳性结果时（3，000c/ml），感染发生的可能性非常大。n每一种RNA定量系统都有其最低检测限，即可以测出的最低拷贝数，通常在50100c/ml以上，RNA定量检测时未测出不等于样品中不含有病毒RNA。另外，许多AIDS病人/HIV感染者在接受抗病毒治疗后其病毒载量可降至非常低的水平，还有少数HIV感染者在感染后长期处于病毒水平非常低的状态，进行RNA测定时往往测不出来。因此，使用此指标应综合其它检测数据和样品背景情况进行综合判断。59HIV核酸定量测定n早期诊断n在HIV感染的窗口期无法使用抗体检测进行诊断。而在感染早期，在抗原峰出现前后通常出现一个病毒载量的高峰，此高峰通常高于发病时的血浆病毒水平，并且有证据表明这个时期的病毒具有很高的感染能力。这个高峰在免疫系统产生反应后，尤其是在细胞免疫出现后开始下降。因此早期病毒RNA测定具有特殊的意义。该方法也可用于HIV感染孕妇所生婴儿的早期辅助诊断。n目前国际上正在尝试使用这种检测对采供血样品进行多个样品混合后的RNA检测以减少窗口期危险（降低“残余危险度”）。60HIV核酸定量测定n病程监控n根据HIV感染发生后病毒载量具有一定的变化规律，并且这种变化与疾病的进程有着密切的相关性。因此定期进行病毒载量的检测有助于确定疾病发展的阶段，以确定相应的治疗方案。n通常在HIV感染后无症状期内发生的感染或其它临床症状很难与AIDS发病时的症状区别，为确定一个刚发生的症状是否与HIV的感染有关，医生往往需要观察病人的实验室指标，病毒载量就是一个非常重要的指标。61HIV核酸定量测定n指导治疗方案及疗效判定n临床实践证明，并非在任何情况下HIV感染者都应该进行抗病毒治疗。这不单是经济上的原因，更重要的是由于抗病毒药物的副作用和疗效原因。通常在病毒载量达到一定水平后（如35，00050，000c/ml）抗病毒治疗才具有良好的效果。在进行治疗后，通过病毒水平的检测才能确定治疗是否有效，通常在治疗前后病毒水平降低0.5 log以上才被认为临床有效。62HIV核酸定量测定n预测疾病进程nHIV感染后疾病进程与病毒载量的关系十分密切，观察HIV感染者病毒RNA水平可大致预测其发病的可能。病毒载量与6年发病率的关系为：30，000c/ml时则为80%。当HIV感染者CD4+T细胞计数200/l时，病毒载量与36个月发展至AIDS的危险为：10，000c/ml为4.9%;10，00029，999c/ml为12.7%;30，00099，990c/ml为17.7%;100，000c/ml为22.4%。在CD4+ 细胞数相同的情况下，年纪大的比年轻患者发展至AIDS的危险更大（AIDS 2004；18：51-58.）。63HIV核酸定量测定 常用的常用的HIV RNAHIV RNA定量测定方法定量测定方法 核酸序列扩增试验（NASBA） 逆转录PCR试验（RT-PCR） 分支DNA杂交试验（bDNA） 荧光定量PCR试验64核酸测定注意事项n标本类型 n血浆和血清标本都可用来测定病毒载量，用三种测定方法进行比较都发现血清和血浆测定的结果有高度相关性。但是血清的检测结果大约是血浆的50%（30-80%），可能是因为血液凝固的过程中HIV颗粒被包裹在纤维蛋白网络中，导致血清中病毒的浓度下降。因此，测定病毒载量应该首选血浆标本，血浆也是临床使用的唯一标本。血清标本对于研究也是可以接受的，重要的是每位病人使用的标本类型应始终保持一致。 65核酸测定注意事项n抗凝剂 n抗凝剂能够显著影响测定的结果。肝素钠处理的血浆不适合做Amplicor HIV-1 Monitor试验，因为肝素是PCR反应的一个潜在的抑制剂。如果必须用RT-PCR方法测量肝素处理的血浆，可以向标本中加入肝素酶以分解肝素。另外，肝素处理的血浆中病毒颗粒降解的速率显著高于EDTA钠盐和枸橼酸钠处理的血浆，一般情况下不同抗凝剂处理的血液6小时之内HIV RNA的降解速率分别是1.8%/小时（EDTA）、3.3%/小时（枸橼酸钠）和5.0%/小时（肝素）。在血液处理方法相同的条件下，用EDTA钠盐抗凝的血浆结果显著优于枸橼酸钠和肝素，因此EDTA钠盐是首选的抗凝剂。 66核酸测定注意事项n标本处理时间和温度 nHIV-1在体内进行快速转换，平均半衰期是大约6个小时。HIV-1在体外未处理的全血中也快速降解，全血中HIV RNA的降解速率在6小时之内平均是9%（0.04log）,最大的降解速率是在采血以后6-8小时，采血以后30小时内可能减少0.5log。因此为了减少病毒颗粒降解对检测的影响，应该在采血以后6小时之内分离血球和血浆，如果做不到就应该使用血浆分离管，立即离心4存放，需要保存30小时以上就应该放在-70。 n温度对HIV RNA的影响不显著。-70室温反复冻融3次，HIV RNA变化的幅度小于0.2log。-70保存5个月，HIV RNA减少0.3-0.5log，-70保存12个月，HIV RNA减少一般不超过0.4log。血浆在室温或4 保存3天，HIV RNA减少不超过0.5log。 67CD4细胞检测细胞检测CD4+T淋巴细胞计数测定的主要意义 用于HIV感染者的疾病分期： CD4+T淋巴细胞0/mm3 艾滋病期判断HIV感染者的临床合并症 各种机会性感染与CD4+T淋巴细胞的相关性。 帮助确定抗HIV药物治疗及机会性感染预防性治疗 的适应症 抗HIV药物疗效的重要判断指标。（周后上升）68与艾滋病相关的免疫细胞检测与艾滋病相关的免疫细胞检测n艾滋病又称获得性免疫缺陷综合症，主要表现为患者免疫功能低下。对HIV感染者与艾滋病患者进行免疫学功能检测感染者免疫状况，有助于预测判断疾病进程、评价抗病毒药物治疗效果和估测预后。与艾滋病相关的免疫细胞检测指标主要CD4+ T淋巴细胞数目、CD8+ T淋巴细胞数目以及CD4+/CD8+的比例，更为精细的指标还包括NK细胞、B淋巴细胞、HIV特异性T细胞等。其中最重要的指标为CD4+ T淋巴细胞数目。nAIDS是由HIV引起的一组综合征，HIV主要侵犯人CD4+ T淋巴细胞，导致其数量上的减少和功能缺陷，使机体免疫平衡被打破造成免疫功能低下，最终导致各种机会感染和肿瘤。因而，对HIV感染者和AIDS病人定期进行CD4+、CD8+T淋巴细胞 检测具有十分重要的意义。 69CD4+、CD8+T淋巴细胞检测意义 n了解机体的免疫状态以进行疾病分期，以如美国CDC就是以此为基础制订了HIV感染者/AIDS病人的诊断和分类标准（见表1），目前国内外仍被采纳应用。我国国家免费艾滋病抗病毒药物治疗手册中将CD4+T淋巴细胞CD4350/ l作为开始抗病毒治疗的标准。70CD4+、CD8+T淋巴细胞检测意义n长期监测CD4+ T淋巴细胞绝对数的变化，有助于了解患者的病情发展，决定正确的治疗方案，并观察对治疗的反应。如判断HIV感染者的临床合并症（如当CD4+ T淋巴细胞细胞200/l时，很容易发生卡氏肺孢子虫肺炎）。71CD4+、CD8+T淋巴细胞检测意义n帮助确定抗HIV药物治疗及预防机会性感染治疗的适应症，如当CD4+ T淋巴细胞200/l时，应给予抗卡氏肺孢子虫肺炎的预防性治疗。72CD4+、CD8+T淋巴细胞检测意义n是用来评价一些新的、针对HIV的治疗方法和治疗药物疗效的重要指标。（周后上升）73CD4检测注意事项n抗凝管 ：K3EDTA n采血时间：某个相同的时段。如：每次采样时间均在上午或均在下午。n温度：18-25保存和运输样品n运送时间：样品应在48小时之内送达检测实验室 74 HIVHIV诊断试剂临床质量评估方案诊断试剂临床质量评估方案75评估目的评估目的 对国内市场销售的国产和进口的HIV诊断试剂的敏感性、特异性、批间差异和适用性进行综合质量评估，及时发现和解决试剂质量问题； 为中央和地方卫生行政部门提供有关的决策依据，并作为艾滋病实验室选择试剂的依据。 76评估组织形式评估组织形式 国家级评估国家级评估 国家艾滋病参比实验室（简称参比实验室）负责组织全国的HIV诊断试剂临床质量评估，选择部分具备资质的艾滋病确认中心实验室和确认实验室参与评估。每年至少组织1次。77评估组织形式评估组织形式 省级评估省级评估 省艾滋病确认中心实验室为各省HIV诊断试剂临床评估的主要职能单位。由省艾滋病确认中心实验室组织评估本省使用的HIV诊断试剂质量，选择省内艾滋病确认实验室或具备资质的艾滋病筛查中心实验室参与评估，每年至少组织1次。78评估程序评估程序 样品的组成和采集样品的组成和采集 目前常用的是200份 包括已知样品和未知样品各100份。 79评估程序评估程序样品的组成和采集样品的组成和采集 已知样品系经WB确认的血清（浆），其中包括HIV抗体阴性（含筛查假阳性样品）、阳性和弱阳性样品。由参比实验室提供50份，参评实验室提供50份。一般阳性样品的比例为10%-40%。80评估程序评估程序样品的组成和采集样品的组成和采集 100份未知样品，由参评实验室在本地区具有一定比例HIV阳性者的高危人群中采集。或由HIV感染率高的地区向HIV感染率低的实验室提供部分样品。 81评估程序评估程序样品质量样品质量 考核样品必须清亮、无溶血、无微生物污染，也无过多脂质，避免反复冻融。82试剂的品种及抽检试剂的品种及抽检 试剂种种类 应尽可能覆盖临床使用的所有品种 83试剂的品种及抽检试剂的品种及抽检 避免偏性避免偏性 受评估试剂应由参评实验室从市场上或从筛查实验室进行随机抽检，保证其真实性。实行双盲检验，即操作者不知设计安排者选用样品的真实情况。 84试剂的品种及抽检试剂的品种及抽检 参比试剂参比试剂 可以选用一种或一种以上高质量的HIV诊断试剂。 85质评样品的检测质评样品的检测 最佳条件下进行比较实验最佳条件下进行比较实验 即在同一实验室采用统一的技术方法、仪器设备、由同一批检测人员严格按照各试剂操作要求进行评估。 86评估结果的分析及统计处理评估结果的分析及统计处理 统计指指标敏感性敏感性：真阳性/（真阳性+假阴性）100%特异性特异性：真阴性/（真阴性+假阳性）100%假阳性率假阳性率：假阳性/（真阴性+假阳性）100%假阴性率假阴性率：假阴性/（真阳性+假阴性）100%功效率功效率：（真阳性+真阴性）/（真阳性+假阳性+真阴性+假阴性） _ 100%变异系数（变异系数（cvcv）：cv=( s/ x ) 100 % PPVPPV=真阳性/（真阳性+假阳性）100%NPVNPV=真阴性/（真阴性+假阴性） 100% 87评估结果的收集、分析、上报和反馈评估结果的收集、分析、上报和反馈 88thanksthanks89