第八章第八章 高效液相色谱法高效液相色谱法High Performance Liquid Chromatography (HPLC)1高效液相色谱法(20)课件8.1 概述概述 第八章第八章 高效液相色谱法高效液相色谱法8.2 高效液相色谱仪高效液相色谱仪 8.3 主要分离类型和原理主要分离类型和原理8.4 高效液相色谱固定相高效液相色谱固定相8.5 高效液相色谱流动相高效液相色谱流动相 8.6 影响分离的因素影响分离的因素8.7 分离类型的选择分离类型的选择 2高效液相色谱法(20)课件8.1 概述概述1. 1. 高效液相色谱法高效液相色谱法 在经典液相色谱基础上，引入气相色谱的理在经典液相色谱基础上，引入气相色谱的理论而发展起来的，以论而发展起来的，以液体为流动相液体为流动相的现代的现代柱色柱色谱谱分离分析方法。分离分析方法。HPLC:HPLC:采采采采用用用用高高高高压压压压输输输输液液液液泵泵泵泵，高高高高效效效效微微微微粒粒粒粒固固固固定定定定相相相相和和和和高高高高灵敏度检测器。灵敏度检测器。灵敏度检测器。灵敏度检测器。 3高效液相色谱法(20)课件 经典经典经典经典LCLCHPLCHPLC柱之内径柱之内径柱之内径柱之内径15cm15cm0.4cm0.4cm长度长度长度长度50100cm50100cm1550cm1550cm填充材料粒度填充材料粒度填充材料粒度填充材料粒度150150 m200m200 m m 4 4 m10m10 mm使用压力使用压力使用压力使用压力110atm110atm50200atm50200atm分离时间分离时间分离时间分离时间0.5h0.5h天天天天0.051h0.051h2. 2. 高效液相色谱和经典液相色谱的比较高效液相色谱和经典液相色谱的比较8.1 概述概述4高效液相色谱法(20)课件8.1 概述概述3. 高效液相色谱和气相色谱的比较高效液相色谱和气相色谱的比较分析对象及范围：分析对象及范围：GC气体和低沸点的稳定化合物气体和低沸点的稳定化合物 只只占有机物总数的占有机物总数的20%；HPLC高沸点、高分子量的稳定或不稳高沸点、高分子量的稳定或不稳定化合物定化合物占有机物总数的占有机物总数的80%。5高效液相色谱法(20)课件8.1 概述概述流动相的选择：流动相的选择：GC有限的几种有限的几种“惰性惰性”气体，只起气体，只起运载运载作用，作用，对组分作用小；对组分作用小； HPLC液体或各种液体的混合液体或各种液体的混合除了起除了起运载运载作作用外，还可用外，还可与组分作用与组分作用，并与固定相对组分的作用产，并与固定相对组分的作用产生竞争，即流动相生竞争，即流动相对分离的贡献很大，可通过溶剂来对分离的贡献很大，可通过溶剂来控制和改进分控制和改进分离。离。操作温度：操作温度：GC需高温；需高温；HPLC通常在通常在室温室温下进行。下进行。6高效液相色谱法(20)课件8.1 概述概述4. 4. 高效液相色谱法的特点高效液相色谱法的特点 高柱效高柱效优点优点：“三高三高” “” “一快一快” “” “一广一广” 高灵敏度高灵敏度 高选择性高选择性 分析速度快分析速度快 应用范围广泛（可分析应用范围广泛（可分析80%80%有机化合物）有机化合物）缺点：缺点：仪器设备费用昂贵，操作严格仪器设备费用昂贵，操作严格7高效液相色谱法(20)课件8.1 概述概述5. 5. 高效液相色谱法的适用对象高效液相色谱法的适用对象 高效液相色谱适用于分析高沸点不易挥发的、高效液相色谱适用于分析高沸点不易挥发的、受热不稳定易分解的、分子量大、不同极性的有受热不稳定易分解的、分子量大、不同极性的有机化合物；机化合物； 生物活性物质和天然产物；生物活性物质和天然产物； 合成和高分子化合物，以及无机和有机离子型合成和高分子化合物，以及无机和有机离子型化合物。化合物。8高效液相色谱法(20)课件8.1 概述概述6. 高效液相色谱法的应用高效液相色谱法的应用 生命科学：生命科学：氨基酸、多肽、蛋白质，核碱、核氨基酸、多肽、蛋白质，核碱、核苷、核苷酸、核酸（苷、核苷酸、核酸（RNA、DNA）等生命物质）等生命物质的纯化和分析；的纯化和分析； 药物分析：药物分析：合成药物的纯化及质量控制，中草合成药物的纯化及质量控制，中草药有效成分的分离、制备及纯度测定以及临床医药有效成分的分离、制备及纯度测定以及临床医学的药代动力学研究中的分离分析。学的药代动力学研究中的分离分析。9高效液相色谱法(20)课件8.1 概述概述食品分析：食品分析： 食品本身组成食品本身组成, 特别是营养成分，如糖、有机特别是营养成分，如糖、有机酸、维生素、蛋白质、氨基酸、脂肪的分析；酸、维生素、蛋白质、氨基酸、脂肪的分析； 食品添加剂，如防腐剂、抗氧化剂、合成色食品添加剂，如防腐剂、抗氧化剂、合成色素、甜味剂和保鲜化学物质的分析；素、甜味剂和保鲜化学物质的分析； 食品污染物，如农药残余和黄曲霉素等的分食品污染物，如农药残余和黄曲霉素等的分析。析。10高效液相色谱法(20)课件8.1 概述概述环境监测：环境监测： 用于分子量大用于分子量大, 挥发性低、热稳定性差的有挥发性低、热稳定性差的有机污染物的分离和分析。机污染物的分离和分析。 如多环芳烃、酚类、多氯联苯、邻苯二甲如多环芳烃、酚类、多氯联苯、邻苯二甲酸酯类、联苯胺类、阴离子和非离子表面活性酸酯类、联苯胺类、阴离子和非离子表面活性剂、有机农药等。剂、有机农药等。 11高效液相色谱法(20)课件8.1 概述概述 精细化工：精细化工：具有较高分子量和较高沸点的有具有较高分子量和较高沸点的有机化合物，如高碳数脂肪族或芳香族的醇、醛机化合物，如高碳数脂肪族或芳香族的醇、醛和酮、醚、酸、酯等化工原料，以及各种表面和酮、醚、酸、酯等化工原料，以及各种表面活性剂、药物、农药、染料、炸药等化工产品活性剂、药物、农药、染料、炸药等化工产品的分析。的分析。 制备分离制备分离: : 在许多科学研究和生产领域，往在许多科学研究和生产领域，往往需要制备或提取一些高纯化合物。往需要制备或提取一些高纯化合物。12高效液相色谱法(20)课件8.2.1 示例示例 8.2.2 结构结构 8.2.3 主要部件主要部件8.2 高效液相色谱仪高效液相色谱仪13高效液相色谱法(20)课件8.2.1 示例示例14高效液相色谱法(20)课件8.2.1 示例示例15高效液相色谱法(20)课件8.2.1 示例示例16高效液相色谱法(20)课件8.2.2 结构结构17高效液相色谱法(20)课件色谱柱色谱柱进样器进样器泵及控制器泵及控制器数据处理及控制数据处理及控制在线脱气机在线脱气机检测器检测器8.2.3 主要部件主要部件18高效液相色谱法(20)课件8.2.3 主要部件主要部件1. 1. 高压输液系统高压输液系统 由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细，因由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细，因此对流动相阻力很大，为使流动相较快流动，此对流动相阻力很大，为使流动相较快流动，必须配备有高压输液系统。必须配备有高压输液系统。 它是高效液相色谱仪最重要的部件，一般它是高效液相色谱仪最重要的部件，一般由由储液罐储液罐、高压输液泵高压输液泵、过滤器过滤器、压力脉动阻压力脉动阻力器力器等组成，其中等组成，其中高压输液泵高压输液泵是核心部件。是核心部件。 19高效液相色谱法(20)课件机械注射泵机械注射泵机械往复泵机械往复泵多多用用于于流流量量要要求求在在1-50 L/min范范围围的的微微型型HPLC或或 毛毛 细细 管管 柱柱HPLC中中活塞泵活塞泵活塞泵活塞泵隔膜泵隔膜泵隔膜泵隔膜泵8.2.3 主要部件主要部件高压输液泵高压输液泵要求：密封性好，输出流量恒定，要求：密封性好，输出流量恒定，压力平稳，可调流量范围宽，耐腐蚀。压力平稳，可调流量范围宽，耐腐蚀。分类：分类： 恒流泵恒流泵（机械泵）（机械泵） 恒压泵恒压泵20高效液相色谱法(20)课件n在分离过程中使用在分离过程中使用两种或两种以上不同极性的两种或两种以上不同极性的溶剂溶剂按一定程序连续改变它们之间的比例按一定程序连续改变它们之间的比例，使，使流动相的强度、极性、流动相的强度、极性、pHpH或离子强度发生变化，或离子强度发生变化，从而从而改变被测组分的相对保留值改变被测组分的相对保留值，提高分离效，提高分离效率。率。n作用类似于作用类似于气相色谱中的程序升温气相色谱中的程序升温。8.2.3 主要部件主要部件2. 2. 梯度淋洗装置梯度淋洗装置22高效液相色谱法(20)课件外梯度（高压梯度）外梯度（高压梯度）: : 利用两台高压输液泵，将利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。室，混合后进入色谱柱。8.2.3 主要部件主要部件8.2.3 主要部件主要部件23高效液相色谱法(20)课件内梯度（低压梯度）内梯度（低压梯度）: : 一台高压泵一台高压泵, , 通过比例通过比例调节阀调节阀, ,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。比例抽入高压泵中混合。8.2.3 主要部件主要部件8.2.3 主要部件主要部件24高效液相色谱法(20)课件3. 进样系统进样系统8.2.3 主要部件主要部件 直接注射进样：直接注射进样：操作方便，可获得高的柱效，操作方便，可获得高的柱效，但不能承受高压；但不能承受高压；进样方式进样方式 停留进样：停留进样：高压泵停止供液，体系压力下降时，高压泵停止供液，体系压力下降时，将样品直接加入到柱头。此法操作不便，重现性将样品直接加入到柱头。此法操作不便，重现性差，不得已才用；差，不得已才用； 高压六通阀进样：高压六通阀进样：进样量的可变范围大，耐高压，进样量的可变范围大，耐高压，易于自动化。但容易造成色谱峰柱前扩宽。它是易于自动化。但容易造成色谱峰柱前扩宽。它是目前普遍采用的进样方式。目前普遍采用的进样方式。25高效液相色谱法(20)课件8.2.3 主要部件主要部件高压六通阀进样高压六通阀进样26高效液相色谱法(20)课件8.2.3 主要部件主要部件 柱体为直型不锈钢管，内径柱体为直型不锈钢管，内径16 mm，柱长，柱长540 cm。 发展趋势是发展趋势是减小填料粒度减小填料粒度和和柱径柱径以提高柱效。以提高柱效。4. 色谱柱色谱柱27高效液相色谱法(20)课件8.2.3 主要部件主要部件（1 1）紫外检测器）紫外检测器5. 5. 检测器检测器 应用最广，对大部分有机化合物有响应。应用最广，对大部分有机化合物有响应。 对流动相的流速和温度变化不敏感；对流动相的流速和温度变化不敏感； 流通池可做的很小（流通池可做的很小（1 mm 10 mm ，容积，容积8 L）；）； 线形范围宽；线形范围宽； 灵敏度高；灵敏度高； 波长可选，易于操作；波长可选，易于操作； 可用于梯度洗脱。可用于梯度洗脱。28高效液相色谱法(20)课件8.2.3 主要部件主要部件（1 1）紫外检测器）紫外检测器29高效液相色谱法(20)课件8.2.3 主要部件主要部件（2 2）光电二极管阵列检测器）光电二极管阵列检测器 1024 1024个二极管阵列，分别检测特定波长，个二极管阵列，分别检测特定波长，经计算机快速处理，得到三维立体谱图经计算机快速处理，得到三维立体谱图紫外检测器的重要进展紫外检测器的重要进展30高效液相色谱法(20)课件8.2.3 主要部件主要部件31高效液相色谱法(20)课件8.2.3 主要部件主要部件（3）示差折光检测器）示差折光检测器 除紫外检测器之外应用最多的检测器；是一种通除紫外检测器之外应用最多的检测器；是一种通用型检测器（用型检测器（每种物质具有不同的折光指数每种物质具有不同的折光指数）；）； 可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与指数差值。差值与浓度浓度呈正比；呈正比； 灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱；灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱； 有有偏转式、反射式和干涉型三种；偏转式、反射式和干涉型三种；32高效液相色谱法(20)课件光源光源调零调零光学零光学零参比参比样品样品平面镜平面镜透镜透镜光电转换光电转换记录仪记录仪放大器放大器遮光板遮光板原理：原理：利用两束相同角度的光照射溶剂相和样品利用两束相同角度的光照射溶剂相和样品+ +溶剂相，溶剂相，利用二者对光的折射率不同，其中一束（通常是通过样品利用二者对光的折射率不同，其中一束（通常是通过样品+ +溶剂相）光因为发生偏转造成两束光的强度差发生变化，溶剂相）光因为发生偏转造成两束光的强度差发生变化，将此差示信号放大并记录，该信号代表将此差示信号放大并记录，该信号代表样品的浓度样品的浓度。33高效液相色谱法(20)课件8.2.3 主要部件主要部件 高灵敏度、高选择性；高灵敏度、高选择性； 对多环芳烃，维生素对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响酸、甾类化合物等有响应；应；（4）荧光检测器）荧光检测器34高效液相色谱法(20)课件8.3 主要分离类型和原理主要分离类型和原理8.3.1 液液-固吸附色谱固吸附色谱8.3.2 液液-液分配色谱液分配色谱8.3.3 离子交换色谱和离子色谱离子交换色谱和离子色谱8.3.4 尺寸排阻色谱尺寸排阻色谱8.3.5 亲和色谱亲和色谱35高效液相色谱法(20)课件8.3.1 液固吸附色谱液固吸附色谱 基本原理：基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸 适用对象：适用对象：分离分离相对分子质量中等相对分子质量中等的的油溶性试样油溶性试样，对对具有官能团的化合物具有官能团的化合物和和异构体异构体有较高选择性；有较高选择性；36高效液相色谱法(20)课件（1）. 类类 型型 硅胶硅胶 氧化铝氧化铝 分子筛分子筛 聚酰胺聚酰胺（2）. 结结 构构 全多孔型全多孔型 薄壳型薄壳型510 m（3）. 粒粒 度度 固定相：固定相：固体吸附剂，较常使用的是固体吸附剂，较常使用的是510m的的硅胶吸附剂；硅胶吸附剂；37高效液相色谱法(20)课件8.3.1 液固吸附色谱液固吸附色谱 液固吸附色谱的流动相：液固吸附色谱的流动相：各种不同极性的一元或各种不同极性的一元或多元溶剂。多元溶剂。 缺点：缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾非线形等温吸附常引起峰的拖尾 流动相流动相：液相色谱的流动相又称为：淋洗液，液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。洗脱剂。流动相的流动相的组成、极性改变组成、极性改变，可显著改变，可显著改变组分分离状况组分分离状况。选择原则：极性大试样选择原则：极性大试样极性较强溶剂；极性较强溶剂； 极性小试样极性小试样弱极性溶剂。弱极性溶剂。38高效液相色谱法(20)课件l 基本原理：基本原理：组分在固定相和流动相上的分配。组分在固定相和流动相上的分配。 (相对溶解度的差异相对溶解度的差异)l 流流动动相相： 亲亲水水性性固固定定液液，采采用用疏疏水水性性流流动动相相，即即流流动动相相的的极极性性小小于于固固定定液液的的极极性性(正正相相 normal phase)，反反之之流流动动相相的的极极性性大大于于固固定定液液的的极极性性(反相反相 reverse phase)。 正相与反相的出峰顺序相反。正相与反相的出峰顺序相反。8.3.2 液液分配色液液分配色谱谱39高效液相色谱法(20)课件正、反相色谱中极性和保留时间的关系正、反相色谱中极性和保留时间的关系待测物极性：待测物极性：ABC8.3.2 液液分配色液液分配色谱谱40高效液相色谱法(20)课件（1）. 全多孔型担体全多孔型担体 由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；球体； 早期采用早期采用100m的大颗粒，表面涂渍固定的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见；液，性能不佳已不多见； 现采用现采用10m以下的小颗粒，化学键合制备以下的小颗粒，化学键合制备柱填料；柱填料；l 固定相固定相8.3.2 液液分配色液液分配色谱谱41高效液相色谱法(20)课件 （2）. 表面多孔型担体表面多孔型担体（薄壳型微珠担体）（薄壳型微珠担体） 3040m的的玻玻璃璃微微球球，表表面面附附着着一一层层厚厚度度为为1 2m的多孔硅胶。的多孔硅胶。 表面积小，柱容量低。表面积小，柱容量低。8.3.2 液液分配色液液分配色谱谱42高效液相色谱法(20)课件（3 3）. . 化学键合固定相化学键合固定相 硅氧碳键型：硅氧碳键型：SiOC 硅氧硅碳键型：硅氧硅碳键型：SiOSi C 硅碳键型：硅碳键型：SiC 硅氮键型：硅氮键型：SiNu 类型：类型：8.3.2 液液分配色液液分配色谱谱43高效液相色谱法(20)课件 传质快，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快；传质快； 寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击；耐水、耐光、耐有机溶剂，稳定；相冲击；耐水、耐光、耐有机溶剂，稳定； 选择性好，可键合不同官能团，提高选择性；选择性好，可键合不同官能团，提高选择性； 有利于梯度洗脱；有利于梯度洗脱；u 特点：特点：8.3.2 液液分配色液液分配色谱谱44高效液相色谱法(20)课件u 分离机制（由键合基团的覆盖率决定）分离机制（由键合基团的覆盖率决定） 高覆盖率：分配为主；高覆盖率：分配为主； 低覆盖率：吸附为主；低覆盖率：吸附为主；8.3.2 液液分配色液液分配色谱谱l 适用对象：适用对象： 正相色谱法正相色谱法适用于适用于极性化合物极性化合物的分离；的分离；反相色谱法反相色谱法适用于适用于非极性化合物非极性化合物的分离。的分离。 45高效液相色谱法(20)课件8.3.3 离子交换色谱离子交换色谱 基本原理：基本原理： 组分在固定相上发生组分在固定相上发生反复离子交换反应反复离子交换反应；组分；组分与离子交换剂之间与离子交换剂之间亲和力的大小亲和力的大小与与离子半径、电荷、离子半径、电荷、存在形式存在形式等有关。亲和力大，保留时间长；等有关。亲和力大，保留时间长； 阳离子交换：阳离子交换：RSO3H +M+ = RSO3M + H+； 阴离子交换：阴离子交换：RNR4OH +X-= RNR4 X + OH-46高效液相色谱法(20)课件8.3.3 离子交换色谱离子交换色谱 流动相：流动相： 阴离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；阴离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液； 阳离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液；阳离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液； 应用：应用： 离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等。离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等。 47高效液相色谱法(20)课件8.3.3 离子交换色谱离子交换色谱l 结构类别结构类别薄壳型离子交换树脂：薄壳型离子交换树脂：薄壳玻璃珠为担体，表薄壳玻璃珠为担体，表面涂约面涂约1%的离子交换树脂的离子交换树脂离子交换键合固定相：离子交换键合固定相：薄壳键合型；薄壳键合型；全多孔微全多孔微粒硅胶键合型粒硅胶键合型（键合离子交换基团）（键合离子交换基团） 固定相：固定相：阴离子交换树脂阴离子交换树脂（碱性）（碱性） 或阳离子交换树脂或阳离子交换树脂（酸性）（酸性）48高效液相色谱法(20)课件 由离子交换色谱法派生出来。由离子交换色谱法派生出来。与离子交换色谱的区别：与离子交换色谱的区别： 8.3.4 离子色谱法离子色谱法 采用了采用了特制的、具有特制的、具有极低交换容量极低交换容量的离子交换的离子交换树脂作为树脂作为柱填料柱填料，并采用，并采用淋洗液抑制技术淋洗液抑制技术和和电导检电导检测器测器，是，是测定混合阴离子测定混合阴离子的有效方法。的有效方法。49高效液相色谱法(20)课件8.3.4 离子色谱法离子色谱法p在离子交换分离柱后加一根抑制柱，在离子交换分离柱后加一根抑制柱，降低流动降低流动相的电导相的电导 -抑制型离子色谱或双柱离子色谱抑制型离子色谱或双柱离子色谱p采用采用电导率极低电导率极低的溶液作流动相的溶液作流动相 - - 非抑制型离子色谱或单柱离子色谱非抑制型离子色谱或单柱离子色谱50高效液相色谱法(20)课件8.3.5 离子对色谱离子对色谱 原理：原理： 将一种（或多种）将一种（或多种）与溶质离子电荷相反与溶质离子电荷相反的离的离子加到流动相中，与溶质离子结合，形成子加到流动相中，与溶质离子结合，形成疏水性疏水性离子对化合物离子对化合物，根据其，根据其吸附作用的不同吸附作用的不同在两相之在两相之间进行分配；间进行分配； 改变改变离子对试剂的浓度离子对试剂的浓度，可改变分离的选择，可改变分离的选择性。性。l 应用：应用：离子型离子型或或可离子化可离子化的化合物的化合物51高效液相色谱法(20)课件8.3.5 离子对色谱离子对色谱 阴离子分离：阴离子分离：常采用常采用烷基铵类烷基铵类，如氢氧化四丁，如氢氧化四丁基铵或氢氧化十六烷基三甲铵作为对离子；基铵或氢氧化十六烷基三甲铵作为对离子； 阳离子分离：阳离子分离：常采用常采用烷基磺酸类烷基磺酸类，如己烷磺酸，如己烷磺酸钠作为对离子；钠作为对离子； 反相离子对色谱：反相离子对色谱：非极性的疏水固定相非极性的疏水固定相(C-18柱柱)，含有对离子，含有对离子Y+的甲醇的甲醇-水或乙腈水或乙腈-水作为流动相，水作为流动相，试样离子试样离子X-进入流动相后，生成疏水性离子对进入流动相后，生成疏水性离子对Y+X-后；在两相间分配。后；在两相间分配。52高效液相色谱法(20)课件8.3.5 尺寸排阻色谱尺寸排阻色谱l 原理：原理：按分子大小分离。按分子大小分离。小分子小分子可以扩散到凝胶空隙，由可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；其中通过，出峰最慢；中等分子中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通只能通过部分凝胶空隙，中速通过；过；大分子大分子被排斥在外，出峰最被排斥在外，出峰最快；快；溶剂溶剂分子小，故在最后出峰。分子小，故在最后出峰。全部在死体积前出峰全部在死体积前出峰；l 应用：应用： 高聚物的分子量分高聚物的分子量分布布53高效液相色谱法(20)课件8.3.5 尺寸排阻色谱尺寸排阻色谱 固定相：固定相： 凝胶凝胶( (具有一定大小孔隙分布具有一定大小孔隙分布) )因此也称为因此也称为凝胶色谱凝胶色谱(1). (1). 软质凝胶软质凝胶葡聚糖凝胶、琼脂凝胶葡聚糖凝胶、琼脂凝胶等多孔网状结构；水为等多孔网状结构；水为流动相。适用于流动相。适用于常压排常压排阻分离阻分离。54高效液相色谱法(20)课件2. 2. 半硬质凝胶半硬质凝胶苯乙烯苯乙烯- -二乙烯基苯交联共聚物，有机凝胶；非二乙烯基苯交联共聚物，有机凝胶；非极性有机溶剂为流动相，不能用丙酮、乙醇等极极性有机溶剂为流动相，不能用丙酮、乙醇等极性溶剂。性溶剂。3. 3. 硬质凝胶硬质凝胶多孔硅胶、多孔玻珠等；孔径可控，具有恒定孔径多孔硅胶、多孔玻珠等；孔径可控，具有恒定孔径和窄粒度分布。化学稳定性、热稳定性好、机械强和窄粒度分布。化学稳定性、热稳定性好、机械强度大，流动相性质影响小，可在较高流速下使用。度大，流动相性质影响小，可在较高流速下使用。8.3.5 尺寸排阻色谱尺寸排阻色谱55高效液相色谱法(20)课件8.3.6 亲和色谱亲和色谱 原理：原理：利用利用生物生物大分子大分子和和固定相表固定相表面面存在的存在的某种特异某种特异性亲和力性亲和力，进行选，进行选择性分离。择性分离。间隔基：间隔基： 环氧、联胺等；环氧、联胺等； 配基：配基：酶、抗原等；酶、抗原等； 56高效液相色谱法(20)课件8.3.6 亲和色谱亲和色谱这这种种固固载载化化的的配配基基将将只只能能和和具具有有亲亲和和力力特特性性吸吸附附的的生生物物大大分分子子作作用用而而被保留。被保留。 改变淋洗液后洗脱。改变淋洗液后洗脱。l应用：应用： 具有具有特殊亲和力特殊亲和力的的生物分子生物分子57高效液相色谱法(20)课件类类 型型 主要分离机理主要分离机理 主要分析对象或应用领域主要分析对象或应用领域吸附色谱吸附色谱 吸附能，氢键吸附能，氢键 异构体分离、族分离，制备异构体分离、族分离，制备 分配色谱分配色谱 疏水分配作用疏水分配作用 各种有机化合物的分离、分析与制备各种有机化合物的分离、分析与制备尺寸排阻色谱尺寸排阻色谱 溶质分子大小溶质分子大小 高分子分离，分子量及其分布的测定高分子分离，分子量及其分布的测定离子交换色谱离子交换色谱 库仑力库仑力 无机离子、有机离子分析无机离子、有机离子分析离子排斥色谱离子排斥色谱 DonnanDonnan膜平衡膜平衡 有机酸、氨基酸、醇、醛分析有机酸、氨基酸、醇、醛分析离子对色谱离子对色谱 疏水分配作用疏水分配作用 离子性物质分析离子性物质分析疏水作用色谱疏水作用色谱 疏水分配作用疏水分配作用 蛋白质分离与纯化蛋白质分离与纯化手性色谱手性色谱 立体效应立体效应 手性异构体分离，药物纯化手性异构体分离，药物纯化亲和色谱亲和色谱 生化特异亲和力生化特异亲和力 蛋白、酶、抗体分离，生物和医药分析蛋白、酶、抗体分离，生物和医药分析HPLC按分离机理的分类按分离机理的分类58高效液相色谱法(20)课件8.4 高效液相色谱流动相高效液相色谱流动相1. 1. 流动相类别流动相类别 按流动相组成分：按流动相组成分：单组分和多组分；单组分和多组分； 按极性分：按极性分：极性、弱极性、非极性；极性、弱极性、非极性； 按使用方式分：按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。固定组成淋洗和梯度淋洗。 常用溶剂：常用溶剂：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。酯、乙醇、乙腈、水。59高效液相色谱法(20)课件8.4 高效液相色谱流动相高效液相色谱流动相3. 3. 流动相选择流动相选择在选择溶剂时，在选择溶剂时，溶剂的极性溶剂的极性是选择的重要依是选择的重要依据；据； 采用正相液采用正相液- -液分配分离时：液分配分离时：首先选择首先选择中中等极性等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加；也可在低极性溶剂中，逐剂极性，反之增加；也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短。渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短。60高效液相色谱法(20)课件8.4 高效液相色谱流动相高效液相色谱流动相 常用溶剂的极性顺序：常用溶剂的极性顺序：水水( (最大最大) ) 甲酰胺甲酰胺 乙腈乙腈 甲醇甲醇 乙醇乙醇 丙醇丙醇 丙酮丙酮 二氧六环二氧六环 四氢呋喃四氢呋喃 甲乙酮甲乙酮 正丁醇正丁醇 乙酸乙酯乙酸乙酯 乙醚乙醚 异丙醚异丙醚 二氯甲烷二氯甲烷 氯仿氯仿 溴乙烷溴乙烷 苯苯 四氯化碳四氯化碳 二硫化碳二硫化碳 环己烷环己烷 己烷己烷 煤油煤油( (最小最小) )61高效液相色谱法(20)课件8.4 高效液相色谱流动相高效液相色谱流动相 采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。进分离或调整出峰时间。 梯度淋洗梯度淋洗62高效液相色谱法(20)课件8.4 高效液相色谱流动相高效液相色谱流动相4. 4. 选择流动相时应注意的几个问题选择流动相时应注意的几个问题 尽量使用尽量使用高纯度试剂高纯度试剂作流动相，防止微量杂质作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。 化学惰性好，化学惰性好，不与固定相发生作用不与固定相发生作用而使柱效下而使柱效下降或损坏柱。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破降或损坏柱。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。坏氧化铝固定相等。63高效液相色谱法(20)课件8.4 高效液相色谱流动相高效液相色谱流动相 试样在流动相中应有适宜的溶解度试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生，防止产生沉淀并在柱中沉积。沉淀并在柱中沉积。 低黏度低黏度。黏度太大会降低样品组分的扩散系数，。黏度太大会降低样品组分的扩散系数，造成传质减慢，柱效下降，同时引起柱压升高。造成传质减慢，柱效下降，同时引起柱压升高。 流动相同时还应流动相同时还应满足检测器的要求满足检测器的要求。如当使用。如当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。64高效液相色谱法(20)课件8.5 影响分离的因素影响分离的因素1. 提高柱效的途径提高柱效的途径在高效液相色谱中，液体的扩散系数仅为气体在高效液相色谱中，液体的扩散系数仅为气体的万分之一，则速率方程中的分子扩散项的万分之一，则速率方程中的分子扩散项B/u 较较小，可以忽略不计，即：小，可以忽略不计，即：液相色谱液相色谱H-u曲线与曲线与气相色谱的形状不气相色谱的形状不同，如图所示：同，如图所示：H = A + C u65高效液相色谱法(20)课件 液体的粘度比气体大一百倍，密度为气体的一液体的粘度比气体大一百倍，密度为气体的一千倍，故千倍，故降低传质阻力是提高柱效主要途径降低传质阻力是提高柱效主要途径。 由速率方程，由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效降低固定相粒度可提高柱效。 液相色谱中，不可能通过增加柱温来改善传液相色谱中，不可能通过增加柱温来改善传质。一般采用恒温。质。一般采用恒温。 改变淋洗液组成、极性是改善分离的最直接改变淋洗液组成、极性是改善分离的最直接的因素的因素。 P282-284P282-2848.5 影响分离的因素影响分离的因素66高效液相色谱法(20)课件8.5 影响分离的因素影响分离的因素2. 流速对分离的影响流速对分离的影响但在实际操作中，流量但在实际操作中，流量仍是一个仍是一个调整分离度调整分离度和和出峰时间出峰时间的重要可选择的重要可选择参数。参数。流速大于流速大于0.5 cm/s时时, Hu曲线是一段斜率不曲线是一段斜率不大的直线。大的直线。降低流速，柱效提高不是很大降低流速，柱效提高不是很大。67高效液相色谱法(20)课件8.5 影响分离的因素影响分离的因素3. 3. 固定相和色谱柱的影响固定相和色谱柱的影响 气相色谱中的固定液原则上都可以用于液气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱，其选用原则与气相色谱一样。相色谱，其选用原则与气相色谱一样。 但在高效液相色谱中，分离柱的制备是一但在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非常高的工作，一般项技术要求非常高的工作，一般很少自行制备很少自行制备。68高效液相色谱法(20)课件8.6 分离类型的选择分离类型的选择1. 根据相对分子质量选择根据相对分子质量选择 相对分子质量非常低相对分子质量非常低的样品，其挥发性好，适的样品，其挥发性好，适用于用于气相色谱气相色谱。 标准液相色谱类型标准液相色谱类型（液（液-固、液固、液-液、及离子交换液、及离子交换色谱）最适合的相对分子质量范围是色谱）最适合的相对分子质量范围是200-2000。 对于相对分子质量对于相对分子质量大于大于2000的样品，则用的样品，则用尺寸尺寸排阻法排阻法为最佳。为最佳。 69高效液相色谱法(20)课件2. 2. 根据溶解度选择根据溶解度选择 弄清样品在弄清样品在水水、异辛烷异辛烷、苯苯、四氯化碳四氯化碳、异异丙醇丙醇中的溶解度是很有用的。中的溶解度是很有用的。8.6 分离类型的选择分离类型的选择 如果样品如果样品可溶于水并属于能离解物质可溶于水并属于能离解物质，以采，以采用用离子交换色谱离子交换色谱为佳；为佳； 如样品如样品可溶于烃类可溶于烃类（如苯或异辛烷），则可（如苯或异辛烷），则可采用采用液液- -固吸附色谱固吸附色谱；70高效液相色谱法(20)课件2. 2. 根据溶解度选择根据溶解度选择8.6 分离类型的选择分离类型的选择 如样品溶解于如样品溶解于四氯化碳四氯化碳，则多采用，则多采用常规的分常规的分配和吸附色谱配和吸附色谱分离；分离； 如样品如样品既溶于水又溶于异丙醇既溶于水又溶于异丙醇时，常用水和时，常用水和异丙醇的混合液作异丙醇的混合液作液液- -液分配色谱液分配色谱的流动相，的流动相，以憎水性化合物作固定相。以憎水性化合物作固定相。 71高效液相色谱法(20)课件8.6 分离类型的选择分离类型的选择3. 3. 根据分子结构选择根据分子结构选择 用用红外光谱法红外光谱法预先简单地判断样品中存在什么预先简单地判断样品中存在什么官能官能团团。然后确定采用什么方法合适。然后确定采用什么方法合适。 酸、碱化合物酸、碱化合物用用离子交换色谱离子交换色谱； 脂肪或芳香族脂肪或芳香族用用液液- -液分配色谱液分配色谱、液一固吸附色谱液一固吸附色谱； 异构体异构体用用液液- -固吸附色谱固吸附色谱； 同系物不同官能团及强氢键同系物不同官能团及强氢键的用的用液液- -液分配色谱。液分配色谱。72高效液相色谱法(20)课件8.6 分离类型的选择分离类型的选择73高效液相色谱法(20)课件 获得高纯物质（色谱纯）的有效方法。获得高纯物质（色谱纯）的有效方法。 分析色谱柱分析色谱柱：内径：内径16 mm，柱长，柱长540 cm。 半制备柱：半制备柱：内径内径8 mm，长度，长度15 30 cm，一次，一次制备量制备量0.1mg。8.7 制备液相色谱制备液相色谱制备柱：制备柱：内径内径2050 mm，柱长，柱长50 cm。74高效液相色谱法(20)课件1.1.色谱柱的柱容量（柱负荷）色谱柱的柱容量（柱负荷）对分析柱：不影响对分析柱：不影响柱效柱效时的最大进样量；时的最大进样量； 对制备柱：不影响对制备柱：不影响收集物纯度收集物纯度时的最大进样量；时的最大进样量； 超载：进样量超过柱容量。柱效迅速下降，峰变超载：进样量超过柱容量。柱效迅速下降，峰变宽。宽。 超载可提高制备效率，以超载可提高制备效率，以柱效下降一半柱效下降一半或或容量容量因子因子k降低降低10%为宜。为宜。8.7 制备液相色谱制备液相色谱75高效液相色谱法(20)课件2. 液相制备色谱的方法（1 1）主峰可获得良好分）主峰可获得良好分离；使用制备柱，超载提离；使用制备柱，超载提高效率。高效率。（2 2）两主成分之间的小）两主成分之间的小组分；组分； 超载，分离切分超载，分离切分使待分离组分成为主成分使待分离组分成为主成分（富集）后，再次分离制（富集）后，再次分离制备。备。 76高效液相色谱法(20)课件3. 制备型液相色谱制备型液相色谱：结构与分析型一样，但泵流量大、进样量大、采用制备柱；柱后馏分收集器。77高效液相色谱法(20)课件