多管发酵法测定水中大肠菌群多管发酵法测定水中大肠菌群考查内容：考查内容： 一、预习报告（包括提问）一、预习报告（包括提问） 二、操作（无菌操作，随机抽看）二、操作（无菌操作，随机抽看） 三、实验报告三、实验报告实验十一实验十一(综合实验）综合实验）多管发酵法测定水中大肠菌群多管发酵法测定水中大肠菌群一、实验目的一、实验目的二、实验原理二、实验原理三、实验材料三、实验材料四、实验步骤四、实验步骤五、实验报告五、实验报告一、实验目的一、实验目的1 1、学习测定水中大肠菌群数量的多管发酵法。、学习测定水中大肠菌群数量的多管发酵法。、学习测定水中大肠菌群数量的多管发酵法。、学习测定水中大肠菌群数量的多管发酵法。2 2、了解大肠菌群的数量在饮水中的重要性。、了解大肠菌群的数量在饮水中的重要性。、了解大肠菌群的数量在饮水中的重要性。、了解大肠菌群的数量在饮水中的重要性。 发酵法：发酵法： 又称多管发酵法或三步发酵法又称多管发酵法或三步发酵法又称多管发酵法或三步发酵法又称多管发酵法或三步发酵法 1) 1) 初发酵（推测试验）：初发酵（推测试验）：初发酵（推测试验）：初发酵（推测试验）： 将不同稀释度的水样，分别接种于含有乳将不同稀释度的水样，分别接种于含有乳将不同稀释度的水样，分别接种于含有乳将不同稀释度的水样，分别接种于含有乳糖等糖类的培养液中（糖等糖类的培养液中（糖等糖类的培养液中（糖等糖类的培养液中（3 3倍或倍或倍或倍或1 1倍乳糖液），经倍乳糖液），经倍乳糖液），经倍乳糖液），经37 C37 C培养培养培养培养24 h24 h，观察产酸产气情况，培养基，观察产酸产气情况，培养基，观察产酸产气情况，培养基，观察产酸产气情况，培养基内加有内加有内加有内加有溴甲酚紫溴甲酚紫溴甲酚紫溴甲酚紫作为作为作为作为PHPH指示剂，细菌产酸后，指示剂，细菌产酸后，指示剂，细菌产酸后，指示剂，细菌产酸后，培养基即由原来的培养基即由原来的培养基即由原来的培养基即由原来的紫色变为黄色紫色变为黄色紫色变为黄色紫色变为黄色，以初步判断，以初步判断，以初步判断，以初步判断是否有大肠菌群存在。是否有大肠菌群存在。是否有大肠菌群存在。是否有大肠菌群存在。二、实验原理二、实验原理2）平）平皿皿分离（证实试验）分离（证实试验）n n 水水水水中除中除中除中除大肠菌群外，尚有其它细菌可能引大肠菌群外，尚有其它细菌可能引大肠菌群外，尚有其它细菌可能引大肠菌群外，尚有其它细菌可能引起糖类发酵，因此需要进一步证实。起糖类发酵，因此需要进一步证实。起糖类发酵，因此需要进一步证实。起糖类发酵，因此需要进一步证实。n n 将初发酵管中已发酵的菌液接种于伊红美将初发酵管中已发酵的菌液接种于伊红美将初发酵管中已发酵的菌液接种于伊红美将初发酵管中已发酵的菌液接种于伊红美兰培养基，兰培养基，兰培养基，兰培养基，37 37 CC培养培养培养培养24 h24 h，根据菌落特征（带，根据菌落特征（带，根据菌落特征（带，根据菌落特征（带核心的、有金属光泽的深紫色菌落），挑取可核心的、有金属光泽的深紫色菌落），挑取可核心的、有金属光泽的深紫色菌落），挑取可核心的、有金属光泽的深紫色菌落），挑取可能为大肠菌群的菌落制片，经革兰氏染色，进能为大肠菌群的菌落制片，经革兰氏染色，进能为大肠菌群的菌落制片，经革兰氏染色，进能为大肠菌群的菌落制片，经革兰氏染色，进一步证实是否为大肠菌群。一步证实是否为大肠菌群。一步证实是否为大肠菌群。一步证实是否为大肠菌群。3） 复发酵试验复发酵试验(完成实验）完成实验）n n 将上述可能为大肠菌群的菌落再次转接入将上述可能为大肠菌群的菌落再次转接入将上述可能为大肠菌群的菌落再次转接入将上述可能为大肠菌群的菌落再次转接入1 1倍乳糖培养液中，经倍乳糖培养液中，经倍乳糖培养液中，经倍乳糖培养液中，经37 37 CC培养培养培养培养24 h24 h，产酸产，产酸产，产酸产，产酸产气者即最后确证为存在大肠菌群。气者即最后确证为存在大肠菌群。气者即最后确证为存在大肠菌群。气者即最后确证为存在大肠菌群。n n 产酸、产气分别记为阳性反应，不产酸、产酸、产气分别记为阳性反应，不产酸、产酸、产气分别记为阳性反应，不产酸、产酸、产气分别记为阳性反应，不产酸、产气则记为阴性反应；产气则记为阴性反应；产气则记为阴性反应；产气则记为阴性反应；n n 根据阳性管数量，查表求得水体大肠菌群根据阳性管数量，查表求得水体大肠菌群根据阳性管数量，查表求得水体大肠菌群根据阳性管数量，查表求得水体大肠菌群的数量。的数量。的数量。的数量。三、实验材料三、实验材料1 1、培养基：、培养基：、培养基：、培养基： 乳糖蛋白胨发酵管（内有倒置小套管），三倍乳糖蛋白胨发酵管（内有倒置小套管），三倍乳糖蛋白胨发酵管（内有倒置小套管），三倍乳糖蛋白胨发酵管（内有倒置小套管），三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管（瓶）（内有倒置小套管）浓缩乳糖蛋白胨发酵管（瓶）（内有倒置小套管）浓缩乳糖蛋白胨发酵管（瓶）（内有倒置小套管）浓缩乳糖蛋白胨发酵管（瓶）（内有倒置小套管），伊红美蓝琼脂平板，灭菌水。，伊红美蓝琼脂平板，灭菌水。，伊红美蓝琼脂平板，灭菌水。，伊红美蓝琼脂平板，灭菌水。2 2、仪器或其他用具：、仪器或其他用具：、仪器或其他用具：、仪器或其他用具： 载玻片，灭菌带玻璃塞空瓶，灭菌吸管，灭载玻片，灭菌带玻璃塞空瓶，灭菌吸管，灭载玻片，灭菌带玻璃塞空瓶，灭菌吸管，灭载玻片，灭菌带玻璃塞空瓶，灭菌吸管，灭菌试管等。菌试管等。菌试管等。菌试管等。四、操作步骤四、操作步骤1 1水样的采取水样的采取水样的采取水样的采取 实验室提供水样实验室提供水样实验室提供水样实验室提供水样 2 2河水的检查河水的检查河水的检查河水的检查（1 1）初（步）发酵实验）初（步）发酵实验）初（步）发酵实验）初（步）发酵实验 水样的稀释：水样的稀释：水样的稀释：水样的稀释： 1010-1-1与与与与1010-2-2 接种：分别吸取接种：分别吸取接种：分别吸取接种：分别吸取1ml 1ml 1010-2-2 、 1010-1-1和原水样和原水样和原水样和原水样接入接入接入接入装有装有装有装有10ml10ml普通浓度普通浓度普通浓度普通浓度乳糖蛋白胨发酵管乳糖蛋白胨发酵管乳糖蛋白胨发酵管乳糖蛋白胨发酵管 ；另取；另取；另取；另取10ml10ml原水样原水样原水样原水样接入装有接入装有接入装有接入装有5ml5ml三倍浓缩三倍浓缩三倍浓缩三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管乳糖蛋白胨发酵管乳糖蛋白胨发酵管乳糖蛋白胨发酵管 ，混匀后，混匀后，混匀后，混匀后，37 37 培养培养培养培养24 h24 h，24 h24 h未产气的继续培未产气的继续培未产气的继续培未产气的继续培养养养养48 h48 h。（2 2）平板分离）平板分离）平板分离）平板分离 将经将经将经将经24 h24 h和和和和48 h48 h培养后产酸产气的发酵管，分培养后产酸产气的发酵管，分培养后产酸产气的发酵管，分培养后产酸产气的发酵管，分别划线接种于伊红美蓝琼脂平板上，再于别划线接种于伊红美蓝琼脂平板上，再于别划线接种于伊红美蓝琼脂平板上，再于别划线接种于伊红美蓝琼脂平板上，再于37 37 培培培培养养养养181824 h24 h，将符合下列特征的菌落进行染色镜，将符合下列特征的菌落进行染色镜，将符合下列特征的菌落进行染色镜，将符合下列特征的菌落进行染色镜检。检。检。检。 深紫黑色，有金属光泽；深紫黑色，有金属光泽；深紫黑色，有金属光泽；深紫黑色，有金属光泽； 紫黑色，不带或略带金属光泽；紫黑色，不带或略带金属光泽；紫黑色，不带或略带金属光泽；紫黑色，不带或略带金属光泽； 淡紫红色，中心颜色较深。淡紫红色，中心颜色较深。淡紫红色，中心颜色较深。淡紫红色，中心颜色较深。（3 3）复发酵试验）复发酵试验）复发酵试验）复发酵试验 将镜检为革兰氏阴性无芽孢杆菌的菌株重复将镜检为革兰氏阴性无芽孢杆菌的菌株重复将镜检为革兰氏阴性无芽孢杆菌的菌株重复将镜检为革兰氏阴性无芽孢杆菌的菌株重复初步发酵试验。并根据初发酵管试验的阳性管初步发酵试验。并根据初发酵管试验的阳性管初步发酵试验。并根据初发酵管试验的阳性管初步发酵试验。并根据初发酵管试验的阳性管查表，即得大肠菌群数。查表，即得大肠菌群数。查表，即得大肠菌群数。查表，即得大肠菌群数。图图图图1 1 多管发酵测定水中大肠菌群的操作步骤和结果解释多管发酵测定水中大肠菌群的操作步骤和结果解释多管发酵测定水中大肠菌群的操作步骤和结果解释多管发酵测定水中大肠菌群的操作步骤和结果解释10ml1001ml1001ml10-11ml10-231111支支各各3支支五、思考题五、思考题1. 1.实验结果报告实验结果报告实验结果报告实验结果报告 河水水样：阳性结果记河水水样：阳性结果记河水水样：阳性结果记河水水样：阳性结果记“ “” ”，阴性结果记，阴性结果记，阴性结果记，阴性结果记“ “” ”。 查表查表查表查表6 6获得每升水样中总大肠菌群是多少？获得每升水样中总大肠菌群是多少？获得每升水样中总大肠菌群是多少？获得每升水样中总大肠菌群是多少？2. 2.思考题思考题思考题思考题（1 1） 何谓大肠菌群，它主要包括哪些细菌属？何谓大肠菌群，它主要包括哪些细菌属？何谓大肠菌群，它主要包括哪些细菌属？何谓大肠菌群，它主要包括哪些细菌属？（2 2） 为什么为什么为什么为什么EMBEMB培养基的琼脂平板能够作为检测培养基的琼脂平板能够作为检测培养基的琼脂平板能够作为检测培养基的琼脂平板能够作为检测大肠菌群的鉴别平板？大肠菌群的鉴别平板？大肠菌群的鉴别平板？大肠菌群的鉴别平板？