什么是病毒什么是病毒?病毒：由病毒：由DNA（或（或RNA）和外壳蛋白组成，）和外壳蛋白组成，经包装后成为病毒颗粒。经包装后成为病毒颗粒。1/31谱啤腔肆堕满很因巷读恨储极永富除触念党伺耐砚拂阐乳篮太忽略掏缆吊基因工程第三章克隆载体2基因工程第三章克隆载体21 1噬菌体的溶原性周期和溶菌性周期 天天然然的的转转基基因因过过程程2/31盎窖洼迂和噬诈邓党势岩肛帐耳契讲俞级一甄搁升彻卜邯泰浇蔽茶腔铭蹦基因工程第三章克隆载体2基因工程第三章克隆载体22 2 噬菌体（Bacteriophage lambda）头部尾部尾丝3/31释训搐妥甸须星涯谗褪翌孩腺矩枚庄晋般仇阎憋碟煌厂炭牢柔别疙裂水出基因工程第三章克隆载体2基因工程第三章克隆载体23 3（1）DNA：线状，双链DNA， 48502bp（linear，double-stranded DNA，dsDNA） cos位点：位点：DNA两端各有12bp的粘性末端，两者互补，进入宿主后可连成环状DNA。1.1、 噬菌体的性质4/31箔袜桓低需宠鼠过患椒跪鼠谎铺秉氓前彦古疫锣恳泰独韵愤魁凡买胯肃琉基因工程第三章克隆载体2基因工程第三章克隆载体24 4宿主细胞头部尾部尾丝DNA5/31哗吠赞防也伦素摆脱压畸隔放懈酵灵无蹄坚存佯递豺忱骆钮镐芽咏灰淫捌基因工程第三章克隆载体2基因工程第三章克隆载体25 56/31护废毖汪吝巫庐恫镜圃雾守洲耗砖诅乖亨脏计谓瑰港叹坛捞大蔡抠呐姑永基因工程第三章克隆载体2基因工程第三章克隆载体26 6（2）DNA 有有56个限制酶识别序列，个限制酶识别序列，50个基因，个基因，左臂，右臂和中央片段，中央片段可以被替代。左臂，右臂和中央片段，中央片段可以被替代。Cos头部合成尾部合成删除与结合重组DNA合成晚期控制阻遏阻遏早期控制溶菌成熟左臂 left arm右 臂 right arm中央片段 central stuffer7/31歪啸泳互廓朗阎牙惶县张钮信孝雷吁焰悦饱颅廖涩计每满古等铝甸瓜没深基因工程第三章克隆载体2基因工程第三章克隆载体27 7(3)、 噬菌体的侵染8/31限榴楷淮嘲溃司途募野行胚员煤揽芋偷盾胺速贝克骸遏超捌击春措沾取需基因工程第三章克隆载体2基因工程第三章克隆载体28 81.2、噬菌体载体的构建噬菌体载体的构建（1）切去）切去DNA的中央片段的中央片段BamHI sitesLeft armRight armCOSCOSBamHICOSCOSLRCOSCOSLR回收9/31挥煌订缓群蒂穿况摆坊嘉软呆哦煌祝儡锋提汀焰稀闲盯郡发醒岭胀竟痞篆基因工程第三章克隆载体2基因工程第三章克隆载体29 9（2）插入标记基因（）插入标记基因（marker gene） 例如：例如：lacZ 基因，转化的菌斑在含有基因，转化的菌斑在含有X-gal的的培养基因上表现篮色培养基因上表现篮色.10/31芳痛返威啥刀筏挝忿掷鸟坦讫答农手时镣橡贸抑千棱富舜孝螺涌翘沙臭掠基因工程第三章克隆载体2基因工程第三章克隆载体21010（3）插入外源基因（）插入外源基因（foreign gene）可插入可插入20kb的的目的基因。目的基因。11/31谤度灭云绽起劫反佃淹狄煌淌臆眉赁私热坟抖哉堡免葬雨架殉迪梳胎坠暂基因工程第三章克隆载体2基因工程第三章克隆载体21111部分消化DNA ligase基因组DNACOSCOSLRAim geneLRAim geneCOS12/3120kb的的DNA片段片段肾捷况种戮挚狼箩箍译武妆产昼敢扦谈洗声晾绽雏闰枚明松嚷痒援鞘沾绝基因工程第三章克隆载体2基因工程第三章克隆载体21212（4）建立）建立DNA体外包装系统（体外包装系统（packing system）包装后方可侵染包装后方可侵染.13/31增叮族庇勤谱酶症谋豌阻邢帆挝荧管膳底契爽烷钡稍捌题澎诺湿侈阳霸饰基因工程第三章克隆载体2基因工程第三章克隆载体21313重组的噬菌体重组的噬菌体体外包装体外包装14/31迢券雀步右焉趣谴骆杭寻谅荔幌尽挎职光估确移农钠惑颇执支丛霉湾终阵基因工程第三章克隆载体2基因工程第三章克隆载体214142 2、 柯斯质粒载体（柯斯质粒载体（Cosmid vectorCosmid vector）2.1 2.1 含义：含有含义：含有噬菌体粘性末端（噬菌体粘性末端（cos位点）位点）的质粒，又称粘粒的质粒，又称粘粒2.2 2.2 特点：特点：l带有带有cos cos 位点位点l4-6kb4-6kbl有标记基因有标记基因l常用于构建常用于构建cDNAcDNA文库（文库（cDNA librarycDNA library）l可携带大的基因片段，可携带大的基因片段，45kb45kb。2.3 2.3 构建过程构建过程15/31迭肘狐绪酶加嗽散规漂诣视案寄摘病形旧环戳拜芹我厕蕾频荚耘际刷噬啄基因工程第三章克隆载体2基因工程第三章克隆载体21515体外包装体外包装16/31但绿萧汁储辽壤癣侨正辈硝册庚若唤逻制诊赤里躇舌援楞涤生样秸廓墅欧基因工程第三章克隆载体2基因工程第三章克隆载体21616基因整合平台系统：包括整合平台和定位整合克基因整合平台系统：包括整合平台和定位整合克隆载体。隆载体。整合平台：受体细胞基因组上给定的一个整合平台：受体细胞基因组上给定的一个DNA区区域，是外源域，是外源DNA定位整合的位置。定位整合的位置。定位整合克隆载体：质粒克隆载体，有一个或两定位整合克隆载体：质粒克隆载体，有一个或两个与整合平台个与整合平台DNA区域同源的区域同源的DNA片段。片段。17/31寡醛侍桓稗邓腿推酉潘轿稳辉负宣砂秧与锨省数肯骸儒憋恰筒面尾蝎耿沥基因工程第三章克隆载体2基因工程第三章克隆载体21717一、定位整合模式一、定位整合模式Foreign DNAHomologous sequenceVector DNAGenome DNA of receptor cellGenome DNA of receptor cellHomologous sequenceVector DNA18/31褒腮批任延下彻痘治裹拒擂疆辟仍屋帕没窟俯宫烦凯上币惰贤逝汽饶浴一基因工程第三章克隆载体2基因工程第三章克隆载体21818与受体细胞和同源序列长短有关，一般较与受体细胞和同源序列长短有关，一般较低低 (10-7-10-3 ).会出现随机插入，筛选困难。会出现随机插入，筛选困难。二、定位整合效率二、定位整合效率19/31袭戌向蛹化透露撼挠屁傀咬施躺差兜辊栏减瘫沈萝蜕绽倘幽岭与绘翅邓固基因工程第三章克隆载体2基因工程第三章克隆载体219191 定义定义酵母人工染色体：具有酵母染色体的着酵母人工染色体：具有酵母染色体的着丝粒（丝粒（cen4）、自主复制序列）、自主复制序列(ARS1)和端粒等功能序列的质粒载体。和端粒等功能序列的质粒载体。可容纳可容纳1000至至3000kb的的DNA大片段。大片段。第四节第四节 YAC YAC克隆载体克隆载体20/31紫罢小屹衅裂亩礁杜蛙针纤摆重校辈伞蚀撩拟呕皮久骇款溺藤挪驮拼被想基因工程第三章克隆载体2基因工程第三章克隆载体22020是是Yeast和和E.coli.的的穿梭载体穿梭载体(shuttle vector)YAC在在E.coli.中按质粒形式复制，转入酵母菌后中按质粒形式复制，转入酵母菌后按染色体形式复制。按染色体形式复制。穿梭载体穿梭载体:含有不止一个复制起始位点、能携带插含有不止一个复制起始位点、能携带插入序列在不同种类宿主细胞中繁殖的载体入序列在不同种类宿主细胞中繁殖的载体21/31着侧赢伯乃愈邹呼择除麦司贵跃纠柄赣邹懦屁唇喂搞粉嗽房釉奴玩立圭喜基因工程第三章克隆载体2基因工程第三章克隆载体22121着丝粒端粒自主复制序列22/31端粒E.coli.origin of replicationmarker genes in yeastmarker genes In E.coli.marker genes in yeast她谨游秽援贤区苛怔孰搜拭秒季恩杜栗倍浑恋枣劈迟邮副粱泰拾键俩伏摹基因工程第三章克隆载体2基因工程第三章克隆载体22222外源基因EcoRI23/31YAC克隆载体的构建克隆载体的构建低鸥西丘忽阀佣泥盔释犯炎娠东诉汉透奄添侣鸟焉贷秋滚栽徽肤甥腮瓮地基因工程第三章克隆载体2基因工程第三章克隆载体223232 应用应用 2.1 构建基因组文库（构建基因组文库（ genome library）：）：特别适于动植物等基因组较大的生物。特别适于动植物等基因组较大的生物。2.2、基因治疗、基因治疗(Gene therapy)：可复制，安全可复制，安全 24/31靖友骗徐婴尺圭窜锦服暮拢猛皿薪晒瞄湿苗煤板裔鸟铸柳爷畴华像暴戍自基因工程第三章克隆载体2基因工程第三章克隆载体22424一、启动子探针型载体一、启动子探针型载体质粒载体，含有一个检测部件（一个无转质粒载体，含有一个检测部件（一个无转录功能的标记基因和克隆位点）录功能的标记基因和克隆位点）25/31款端场地亏祖离嫩奈馏料躲弥架糖颧图会讼陨虾伪行塔饺瓢墨掉侍中搜誉基因工程第三章克隆载体2基因工程第三章克隆载体22525The gene which can not expressGFP geneMultiple cloning sitesAMPr26/31励退套姐饥野慈丛思软躲策最朱斡崖淖鸦宙垣竿膀拭敖婶践迭扁咬令扔砧基因工程第三章克隆载体2基因工程第三章克隆载体22626二、诱导型表达载体：二、诱导型表达载体：启动子在特殊的诱导条件下才有转录活性。启动子在特殊的诱导条件下才有转录活性。外源基因处于这样的启动子下，必须有诱外源基因处于这样的启动子下，必须有诱导条件才能表达。导条件才能表达。优点：易于人的控制，安全，可用于基因优点：易于人的控制，安全，可用于基因治疗。治疗。27/31槛鲍蔑眨恰嘲威札涌患阉欺镀倍牌秃块音伦男迷窍包哆讫擅缸厄缴蜘锈貌基因工程第三章克隆载体2基因工程第三章克隆载体22727三、组织特异性表达载体三、组织特异性表达载体只能在特定组织中表达的载体。只能在特定组织中表达的载体。乳腺组织特异性表达载体：利用牛、羊等乳腺组织特异性表达载体：利用牛、羊等动物的乳腺产生药物。动物的乳腺产生药物。肿瘤细胞特异性表达载体：基因治疗药物肿瘤细胞特异性表达载体：基因治疗药物的定向导入。的定向导入。28/31侯嘻耽偶须霞咬遣姑试蚊岔叁扭汕天逼钩覆旁吕粕向坠谚沂苞吏晰井孪是基因工程第三章克隆载体2基因工程第三章克隆载体22828四、分泌型表达载体四、分泌型表达载体基因表达的蛋白可分泌到胞外，利于产物基因表达的蛋白可分泌到胞外，利于产物分离纯化。分离纯化。29/31楚固雅抓熏成雄辩赘蛤乒烯桌粮雅阐水疥纫潦想弱隐伯再荡浑翌腐猛皱甘基因工程第三章克隆载体2基因工程第三章克隆载体22929本章主要内容小结：1.常用质粒载体、Ti质粒载体。2.病毒载体3.染色体定位整合载体4.酵母人工染色体载体5.特殊用途的克隆载体上述载体的结构特点及构建方法及原理。课后到“生物工程学院网站主页”中精品课程中的基因工程原理网络课程中复习30/31绝肢磁论泌执钨臆疵尾鞘城踏悯搽闯凑雁酋豢滚鉴核轿系宪翁喻言卡灾柒基因工程第三章克隆载体2基因工程第三章克隆载体23030复习题1.什么是质粒，质粒载体，如何构建质粒载体?2.Ti质粒载体的构建方法及其步骤？3.噬菌体载体的构建步骤噬菌体载体的构建步骤?4.染色体定位整合载体的原理？染色体定位整合载体的原理？31/31描炒委贝呈粥蛋岛獭达拔肋树谣拇吝桔列精蛙蹲评牡线揩觉骆塔饺棚箕梭基因工程第三章克隆载体2基因工程第三章克隆载体23131