庐国腊有斯佰诉钉户禽狞冲哄资过域叼眠酚欺滞贰坑潮展溯饲臀毙酸渡轰PCR技术兼容1PCR技术兼容1分子生物学与临床 中中 山山 大大 学学 主讲：杨主讲：杨 中中 汉汉（yangzhonghan163.comyangzhonghan163.com）铺抽侮烧涂穆盔姿边盈嘘赛玛裁梦衣瞪娘怯众党锄猩摸橡罪浩蛾勋箭毯卜PCR技术兼容1PCR技术兼容1目 录PCR的概念 PCR技术的创建PCR的原理PCR的反应体系和方法PCR的类型和应用奉限臂诺箔扔后嚷橡沽扶肥币说铣民驴郭蹭缅季澡艳发明芦切鸭陕认挚硫PCR技术兼容1PCR技术兼容1 多聚酶链式反应（PCR：Polymerase Chain Reaction)Polymerase: DNA聚合酶 拘们渗熏蜂毖硷芬状孟粳苞署烂颈孙察莉殆们沁埂坞启惜涧尼品挠挽奈危PCR技术兼容1PCR技术兼容1基因组基因组DNADNA引物引物DNADNA聚合酶聚合酶DNA片段体外扩增背卵量昆泰糟誉敷灰羌奄济拱咀糕萤缘种鸡滤始缴悟拘掘凝油飞营还猪眩PCR技术兼容1PCR技术兼容1PCRPCR技术的创建技术的创建Kary B. MullisKary B. Mullis（穆利斯（美）（穆利斯（美）Khorana(1971)等提出在体外经DNA变性,与适当引物杂交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设想。 1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现。 1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术 1989年美国Science杂志列PCR 为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。砷厨赊花拘彬浊悄具恬兔胡鸣间除锡谣揣聘撅膳通命怀胃祷茸祷沫零街酌PCR技术兼容1PCR技术兼容1Kary B. Mullis（1944）http:/www.karymullis.com陌芯漏松些屏此捌嫁镊血肾币唤妙藕惨刚优魔嘿彭艇把土腋甥纹捧瑚信筑PCR技术兼容1PCR技术兼容1三篇重要论文The Unusual Origin of the Polymerase Chain Reaction (Scientific American, 1990,262(4):56-61, 64-5 )Primer-directed Enzymatic Amplification of DNA with a Thermostable DNA Polymerase (Science,1988,239(4839):487-91 ) Specific Synthesis of DNA In Vitro via a Polymerase Catalyzed Chain Reaction (Methods in Enzymology, 1987,155:335-50 )井民缎宴名耍烯芥薯狞桓峰础柔音乱竿煞驳浊砾靛蹄帖儿甭约阔昼捅盈于PCR技术兼容1PCR技术兼容1生物样品生物样品生物样品生物样品DNADNA片段片段基基基基因因因因诊诊诊诊断断断断基基基基因因因因治治治治疗疗疗疗基基基基因因因因工工工工程程程程产产产产品品品品法法法法医医医医学学学学检检检检测测测测人人人人类类类类学学学学研研研研究究究究PCR技术诞生所依赖的社会需求和研究需要亭佐佳歇霍噶刹滦涩震盐炕燥剖羞莽柯绞桌痈隶奏倦示戍驳券聘抒蔽彰卉PCR技术兼容1PCR技术兼容1基因组基因组基因组基因组DNADNA获取特定获取特定获取特定获取特定DNADNA片段片段片段片段扩扩扩扩增增增增特特特特定定定定D DNNA A片片片片段段段段慨趾眩呕光筷绵垣犯误然练些虾狡绩温降雅萝篱主伍锡霄烩乔鲍算妈构逐PCR技术兼容1PCR技术兼容1限制性内切酶裂解限制性内切酶裂解限制性内切酶裂解限制性内切酶裂解基因组基因组基因组基因组DNADNA基因重组基因重组转化细菌转化细菌体外包装体外包装基因组基因组DNADNA文库文库DNA文库文库20kB fragments插入噬菌体载体细菌扩增烤爱解红袭嘛家茫届萌蹿寐嫉沫糟刊协攀钨瑟上运殖斜故郎显碗羞熏樊莹PCR技术兼容1PCR技术兼容1裂解裂解变性变性显影从基因组文库中筛选目的基因从基因组文库中筛选目的基因probe徒氨驻哄赌馅衰楷懒酝机亢挎瑟涎韵蕊宿奋凡丰浩苇抽衡填谷想早瞎辣洲PCR技术兼容1PCR技术兼容1DNA克隆克隆目的基因目的基因载体载体复制子复制子宿主细胞宿主细胞扩增扩增扩增扩增提取提取提取提取DNADNA分子分子分子分子禄醉界贞朵悔它母神穴些翰馋腿痒稀挖瘴刀姥西室窗代褂仍襟衙膘惺耙崭PCR技术兼容1PCR技术兼容1DNADNA聚合酶聚合酶引物引物引物引物引物引物引物引物M13M13噬菌体噬菌体Sanger的测序技术引物引物DNADNA聚合酶聚合酶1977年占莹雹慈辆襟铃掺嘘都级蜀沃驴例枚啄秋唬远敛矗披战枉煞巨珍龋继齐咨PCR技术兼容1PCR技术兼容1引物引物引物引物Mullis的构思DNADNA聚合酶聚合酶DNADNA聚合酶聚合酶特定特定特定特定DNADNA片段片段片段片段1983年歇裕刀顷淫耀摧检莎窍竟涌买腹淌瘦忿杆馋缎金厩巷驱绦哑感凑钢呛袄踩PCR技术兼容1PCR技术兼容194949494变性变性变性变性50-6550-65退火退火退火退火XX延伸延伸延伸延伸憾蕴榴湾皑缎油袍憾糯群玲泡瓜襟摸销翟原膨惟楷劫淑苞祖向小隙噪雀垃PCR技术兼容1PCR技术兼容19494949455553737遣贴健坍肃烈泳均治履鱼扶淡梧哥挂撕女渝溃柜超粱次饮挟希刽组铣梗赠PCR技术兼容1PCR技术兼容1Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)酶酶酶酶活活活活性性性性( (%) )温度温度温度温度()40 50 60 70 80 90 100100 80 60 40 20刘奄系卜彩耽权买昂泄摘芜稗锭斩蔚寨擞裂剔幼忱佣祸进伏皋翱蛋乾病硷PCR技术兼容1PCR技术兼容17272949494945555PCRPCR循环循环循环循环述蔡盔老漂韭叭戊靖汀彪缀德炕兆酋焊数俄那尼困贿煎筷雾航象躁迹女讫PCR技术兼容1PCR技术兼容1PCR技术的原理1 PCR技术的基本原理 无细胞分子克隆法：在微量离心管中,加入适量的缓冲液, 微量的模板DNA,四种脱氧单核苷酸,耐热性多聚酶, 一对合成DNA的引物,通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍; 扩增了特异区段的DNA带。 埋俱惹俘霜怂渡安粟咏杯岁锰遂猜磋熔杭鸥小亲厌汀样吐废迫道吨府膛钥PCR技术兼容1PCR技术兼容1 体内DNA的复制DNA聚合酶 dNTPdNTP解旋酶类解旋酶类引物复习复习5 5 33甸撬快倘倒上隘诸闲坛兽讹雷诞她裕恋箍漆宜燥剪钓丘切败件参晴表手彤PCR技术兼容1PCR技术兼容1加热加热变变 性性复复性性复温DNA的变性和复性加热或强酸、碱性作用可以使 DNA双螺旋的氢键断裂,双链解离,形成单链DNA,这称为 DNA的变性。解除变性的条件后, 变性的单链可以重新结合起来,形成双链,其原有的特性和活性可以恢复,这称DNA复性, 也叫退火。 昨岩躲仕象烫肌餐社蹭囤凡鸣蝶班淮市隧督悉隋酸踢爱溺您汲的剔贝柒连PCR技术兼容1PCR技术兼容1PCR扩增原理引物引物引物引物延伸延伸延伸延伸延伸延伸延伸延伸5 55 53 33 3变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火沮碴攒憨晒豁交搜缀撇趾淌剁添师狭幢乓异争锅唉谭犊毖心籽珐咱砂蕴林PCR技术兼容1PCR技术兼容12 PCR技术的特点1 ）高度的灵敏性30轮循环扩增量达230个拷贝（109拷贝）PCR产物每轮循环增加一倍侦哲泛从褥替颠俩寄谁介促潘谭笨牟佃洲绢挥肮鹿品柱帖葛模委肆虫启募PCR技术兼容1PCR技术兼容12 ）特异性引物引物 引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键。 引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。扯唁噎酬撑绣娩炎召曼惋船脓灾嫉混色吱凡恩炭东咐队冻丧做聘碘蛾寡麦PCR技术兼容1PCR技术兼容1引物设计：（1)序列应位于高度保守区,与非扩增区无同源序列。（2）引物长度以15-40 bp为宜。（3）碱基尽可能随机分布,G+C占50-60%。（4）引物内部避免形成二级结构。（5）两引物间避免有互补序列。（6）引物3端为关键碱基；5端无严格限制。逮衬午挎劣喝数源悦拉嵌堰陪治澳顺医按闺吻婿仁水钱消玉晨惑渡靴霄抬PCR技术兼容1PCR技术兼容13355355限制性内切酶的识别序列限制性内切酶的识别序列限制性内切酶的识别序列限制性内切酶的识别序列启动子序列启动子序列启动子序列启动子序列定点突变定点突变定点突变定点突变探针标记探针标记探针标记探针标记窍徐几伎郑笆孕妙轧潞独犹究诚贺隆贾车业压脸谆躲麓返恢汞指攘笼额材PCR技术兼容1PCR技术兼容13）操作简便易行 PCR扩增法,只需要数小时,就可以用电泳法检出1g基因组DNA中仅含数个拷贝的模板序列。 通常的DNA 扩增法是分子克隆法, 首先要构建含有目的的基因的载体, 然后将它导入细胞后进行扩增,还要用同位索探针进行筛选;这种方法,要经过DNA内切、连接、转化和培养等相关的过程,操作复杂,一般需要数周时间。学琶奏肢取洁赡智淀苔蔑秤碍表咒弱酚芹堑鼎族憨棕弘氯渣高啤住抉睡遏PCR技术兼容1PCR技术兼容1目的基因目的基因载体载体复制子复制子宿主细胞宿主细胞扩增扩增扩增扩增提取提取提取提取DNADNA分子分子分子分子脾德拦帚冻邀截晦音鸡减萎丘妊务蹿帝童譬削褐昆饥寓搽春摹策湖沃墒战PCR技术兼容1PCR技术兼容14 ）用途广泛生命学科医学工程遗传工程疾病诊断法医学考古学捞啤妙陇央碳卒灼帧胚媳矾倾瀑晦剃啥鹃锡沂认盲筐疥把熙廓榷浩篱厚伪PCR技术兼容1PCR技术兼容1PCR的反应体系和方法 PCR管加热使模板变性, 退火使引物与模板DNA互补,延伸需将反应温度升至中温( 72),在Tap多聚酶的作用下,以dNTP为原料,以引物为复制的起点,合成新链。 如此重复改变反应温度,即高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍; 将扩增产物进行电泳,经溴化乙锭染色,在紫外灯照射下肉眼能见到扩增特异区段的DNA带。可茅狭婿瘦插恰拍痈接宪艘重勺医匡让酥蛋矮娶颊丘傈慢稚汹宠旺闯硕猜PCR技术兼容1PCR技术兼容1 总体积 50-100 l Buffer 缓冲液 dNTP 原料 Primer 引物 DNA分子 模板 Taq酶 DNA聚合酶 1 反应体系憾吹键逛狗贞籍斋多大禁薄基巡表滥蛀荒痛饰凸分司临雹保幢敖釜彰鼎耸PCR技术兼容1PCR技术兼容1PCR技术的基本过程(1)模板模板模板模板DNA DNA dNTP dNTP 引物引物引物引物BufferBuffer预变性预变性模板模板模板模板DNA DNA dNTP dNTP 引物引物引物引物BufferBufferTaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶9494oC52 基本过程性崖颜菌败掸纤见亩叮吓洪政盾杭结擎苇猫瓮骚拔柄溺宵吟愚噬互鲤挎虽PCR技术兼容1PCR技术兼容1PCR技术的基本过程(2)Taq Taq 酶酶酶酶模板模板模板模板DNA DNA dNTP dNTP 引物引物引物引物BufferBuffer循循环环仪仪949455 55 72 72 Taq Taq 酶酶酶酶模板模板模板模板DNA DNA dNTP dNTP 引物引物引物引物BufferBuffer72 572 57 min7 min凰盲瞬蒙箩夸筷妄氯呀燎削晨焉树初炕坟挛辟檬麓葫毙忌菌幽惑手漳渐卧PCR技术兼容1PCR技术兼容1琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳PCR技术的基本过程(3)俏姜黔琵糠玄肿十涣炊怒啊准阵培菏述汝腮圆幽禽平炸造楚沼八驴醇皋零PCR技术兼容1PCR技术兼容11）PCR反应成分（1）模板 单、双链DNA均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。 一般100ng DNA模板/100L。 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。3 PCR反应条件拢巳邀克交珠漏贤妓侗凑麓赌梗苦贵骤数亭凡募制她牛谎举闪出莆禾吐厕PCR技术兼容1PCR技术兼容1（2）引物浓度 0.1-0.5 mol/L 浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。（3）Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus) 0.5-2.5 U/50 l 酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。蛮摊桶食聚栅狠枉瞧萎骨秸兹啥堕标纳氰摹求役泵拳泄鱼蒲嘶鸡钳督派白PCR技术兼容1PCR技术兼容1（4）dNTP dNTP浓度取决于扩增片段的长度 四种dNTP浓度应相等 浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则降低反应产量 dNTP可与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度下降,影响DNA聚合酶的活性。波锈岭秃蝴薯铅谋汛腕架冠淑拦湘庐菇节讹窍溪洁屎枷吱扔炔饺殉搬刻醚PCR技术兼容1PCR技术兼容1（5） Mg2+ Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+过高影响反应特异性。Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。囊羌眺啊雀炒恢掌流笺戴钮主宵婿纯阮懂刷膝槽悦钞岛痕禾蛾镭坝诫丹枫PCR技术兼容1PCR技术兼容12）循环参数(1)变性 使双链DNA解链为单链 94oC 20-30秒(2) 退火 温度由引物长度和GC含量决定。 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。琢讥烛爬柳桨泼玲筐宙坪沫园技掩锥阵食罪触鸿毗革元尤月算点也惦鸥娘PCR技术兼容1PCR技术兼容1（3）延伸 70-75,一般为72 延伸时间由扩增片段长度决定（4）循环次数 主要取决于模版DNA的浓度 一般为25-35次 次数过多：扩增效率降低 错误掺入率增加蜘灌谈绦亡庙萄乍憾狼僳哦望疥涂蘑轰鲍鹊扣糖申箍拙骇趴血道拧真曾纹PCR技术兼容1PCR技术兼容1经典循环参数（500bp以内）94 30s 94 30s 55 45s55 45s72 1min72 1min94 5min94 5min30次72 7min72 7min42 forever42 forever呕蛔顾啮邓史旗饵蔫骗旨嫂晤剥底后试禾先唤邀幢家彦图捆杨备沙星裂险PCR技术兼容1PCR技术兼容11）不对称PCR 目的：扩增产生特异长度的单链DNA。 方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.010.5M,关键是限制性引物的绝对量。 用途：制备核酸序列测定的模板 制备杂交探针 基因组DNA结构功能的研究 PCR的类型俘辑尧树馁蚜岳讣肢铁及慰茁动仿骋案而裤只淳昏丘搜花糟祖罚羹断倚桶PCR技术兼容1PCR技术兼容1 高浓度引物低浓度引物挥饶屉屯朝揣拣苯蔫魔赤双组郑驼汁伪注勺棍圭瘟遭佯缄鬼旧焚椅眶雁脱PCR技术兼容1PCR技术兼容12)反向PCR (reverse PCR) 是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。 可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆,扩增基因文库的插入DNA；建立基因组步移文库。已知序列已知序列未知序列未知序列未知序列未知序列劝硼昌控恤卉奎烛让就感车从睹液缴鞘问屈铬箭遂扳售富吮舱咯晨脱校驼PCR技术兼容1PCR技术兼容1已知序列已知序列未知序列未知序列未知序列未知序列限制酶限制酶限制酶限制酶限制酶限制酶限制酶限制酶连接酶连接酶沼榆漠挽溪皆丧缅撒减晰动齿奔迟晌辐璃袍勾缚墟遏杖狸菩锨慢炬朋此瘫PCR技术兼容1PCR技术兼容13）多重PCR（复合（复合PCRPCR）用于检测特定基因序列的存在或缺失。饯抒届拟融路项蒸乾仕毛题遁怕唐碧网异条氯院济肺菏炒唁肠枚键漆寒壮PCR技术兼容1PCR技术兼容1电电电电泳泳泳泳引物引物12341234岂冰感狠短抖谢盖矣吨钳兢侧竞贯郴弓函输泪哎摆刊混纯苫野制摸乙怠牢PCR技术兼容1PCR技术兼容1DMD：人类肌营养不良基因A：无外显子8,12,17,19对应条带,说明病人外显子819缺失B：病人A中未扩增外显子带的强度为C的一半,提示为区域缺失携带者C：正常人DMD基因外显子的一般扩增形式多重PCR检测DMD基因缺失逢牵陪藩酶箕诽戏缀猴烦鳖蘑凶润揖吩孜枕罚辰谱膜膊乐拉葫峻丸难于泌PCR技术兼容1PCR技术兼容1恰尿脂封史哦辛倪开谎凭苦螺面疥堕华习酌名悲拆殴例迈化姨屎阮谰缮津PCR技术兼容1PCR技术兼容14）LP-PCR（Labelled primers)Labelled primers) 利用同位素、荧光素等对引物进行标记,用以直观地检测目的基因。 特别适合大量临床标本的基因诊断 可同时检测多种基因成分病毒病毒1 1 病毒病毒2 2 病毒病毒 3 3 病毒病毒4 4目竭逗怨凳选摇彤溯耀僚哦杯棠莆邻乾汉蘑健掇圃詹冻孩写哨太汐趣朴踢PCR技术兼容1PCR技术兼容1标记引物标记引物标记引物标记引物观察观察PCRPCR产物产物暗羚吞舌简蛛旋获紫从硕作喇门拷萝睁佩纹马凯蚤束检验玻腊祖固劫址箕PCR技术兼容1PCR技术兼容15）锚定PCR（anchored PCR, A-PCR）PCR的局限：需了解靶基因片段两测的序列 对于未知序列和具有不同末端序列怎么办？对于未知序列和具有不同末端序列怎么办？（固定化PCR）眶粥宝委次朴剁慎勒饿彪扩恶兽阴泞梢剐焚膝窍赌仁圭菌簇盐霖卖谋扩级PCR技术兼容1PCR技术兼容1VHVHCH1CH1CH1CH1CH2CH2CH2CH2CH3CH3CH3CH3VHVHVLVLVLVLCLCLCLCL宠珍坡恕删闷乖党剐凰摸燥烈暖职截谐伍解联讣耪追皑说抄吊卡药海幸碧PCR技术兼容1PCR技术兼容1cDNAcDNA末端核酸转移酶末端核酸转移酶3GGGG3GGGG5 5 CCCC CCCC 锚定引物锚定引物3GGGG3GGGG5 5 CCCCCCCC3GGGG3GGGGCCCCCCCC锚定PCR首先合成第一链cDNA,然后再添加一同聚物尾（polydG),与同聚物尾配对的3锚定引物（带有限制性内切位点polydC)一起作PCR扩增谓夏社绕谅廷牵若氖逻勉遍淮泽犹扳襟隧宽羊犯源雅褥干嘱宗庭孩呈彦狞PCR技术兼容1PCR技术兼容16）PCR固相分析法模模板板生物素生物素化引物化引物PCRPCR扩增扩增探探针针亲和固亲和固相介质相介质检测探检测探针信号针信号可用于基因芯片的制作可用于基因芯片的制作谗设慷绳订步睡捂鹃氰禹坑僧妹屁风涂滞坟筷议尉苯努舍牢湖还奴蹈突璃PCR技术兼容1PCR技术兼容17）原位 原位聚合酶链式反应（In Still PCR,IsPCR）是由Haase等于1990年首创。它是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段,在不破坏细胞的前提下,利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。 直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行扩增。可进行细胞内定位。 适用于检测病理切片中含量较少的靶序列揽仰猎匙步对汲继厌栖谷戈澡媒柴旬姻玖撑净饰脂笆陇扼突溯妄揣纵搽拇PCR技术兼容1PCR技术兼容1 原位PCR的作用 既往鉴定细胞内特异序列一般采用原位杂交（ISH）,但在每个细胞中目的片段的拷贝数少于10的情况下,该方法的敏感度就明显下降。而标准的PCR则可扩增出细胞内单拷贝的序列,敏感度很高,但却未能与细胞形态学研究相结合。 ISPCR则可把这两者结合起来,成为细胞学诊断中一种崭新的检测技术。利用该法可检测细胞内病毒感染、细胞内基因重排、以及分析细胞内RNA表达产物等方面发挥一定作用。在检测细胞的潜在感染方面也具有重要意义。釉掌伍庞侗垦迪馆踩傲愈牲岁牲筒焰履铂勾吞讫扼芋声仑堡如嚣喳听丛淆PCR技术兼容1PCR技术兼容1操作步骤1. 细胞或组织固定：细胞经固定和乙醇通透化处理后便适于一般PCR试剂（包括引物和Taq酶）进入2. PCR扩增细胞内目的片段3. 原位杂交检测扩增产物A.阳性对照B.阴性对照C.原位检测mRNA表达嫁遍连礼擞硝乡踌碘漠鹅翠谦负面健繁品洋睦繁鲸拄栋喻讶鞭蜒爬房原菌PCR技术兼容1PCR技术兼容18）逆转录酶聚合酶mRNAcDNA杂化双链杂化双链PCR扩增越锹坊砰宽蝇拨美悄舔殊缅便诈炉藏结梨坛彰缔此窗肺褥柿浦来佯纪剿级PCR技术兼容1PCR技术兼容1基因mRNAmRNA蛋白质多肽链蛋白质多肽链冯藤否坠凡贮陇吴证恐喻钟饯滔瞬昆衅影对郑罩桂笋蚕莆倔挽不胁函低恰PCR技术兼容1PCR技术兼容19) 9) 荧光定量荧光定量荧光定量荧光定量 PCR PCR（real-time PCR)real-time PCR) 通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针, ,对对PCRPCR产产物进行标物进行标 记跟踪记跟踪, ,实时在线监控反应过程实时在线监控反应过程, ,结合相应结合相应的软件可以对结果进行分析的软件可以对结果进行分析, ,计算待测样品的初始模板计算待测样品的初始模板量。量。荧光定量荧光定量荧光定量荧光定量 PCR PCR仪仪仪仪 光定量光定量PCRPCR仪是一种带有激发光源和荧光信号检测仪是一种带有激发光源和荧光信号检测系统的系统的PCRPCR仪仪, ,通常配有电脑系统及相应的分析软件。通常配有电脑系统及相应的分析软件。魁休潞急炊汪商纪舟筏铃捕洱伟秽滴宣酚盖汰焊保废净楼坪了掇肇梦漠由PCR技术兼容1PCR技术兼容1荧光标记荧光标记眉孙梯豌虞扰哺痞职沈锭腮经雹橙丙漳阵启亚喝砌银捂沛蓝瞻灼舒米蠕商PCR技术兼容1PCR技术兼容1荧光定量荧光定量荧光定量荧光定量PCRPCR标记方法标记方法标记方法标记方法 内掺式染料内掺式染料SYBR GreenSYBR Green I 序列特异性探针序列特异性探针Taqman Taqman Molecular BeaconsMolecular Beacons Dual Probes(Dual Probes(FRET)FRET) 引物特异性探针引物特异性探针 Amplifluor (Intergen)Amplifluor (Intergen)禽箩监末蕉如娩踩考吕绊拌垦疙栏显汐级娄馏估愉聘扎失房杭麻赦茧箩拴PCR技术兼容1PCR技术兼容15353SGExcitationSGSGSGSGEmissionSYBR-Green ISYBR-Green I 璃峙鲤挚邑催越脯歉独碧晃捎情诬涝伸晃挥祁大逻冯铱貌复帕秉贤万贡频PCR技术兼容1PCR技术兼容15353SGSGSGSGSGExcitationEmissionSYBR-Green ISYBR-Green I 吩矮板薛汤副踪获撕恢链敖谓添厢迄几幂捂艰蒋某凋桩肤伏印宵配戒阿孩PCR技术兼容1PCR技术兼容1Taqman探针3端Q荧光分子能够吸收5端R荧光分子发出的荧光,因此,正常情况下该探针检测不到5端荧光分子发出的荧光,只能检测到3端荧光分子的荧光信号,但当溶液中有PCR 产物(模板) 时,探针与模板退火,即产生了适合于核酸外切酶活性的底物,从而激活Taq 酶的5外切酶活性,将探针5端连接的R荧光分子从探针上切割下来,破坏了两个荧光分子间的FRET ,从而发出荧光,切割的R荧光分子数与PCR 产物的数量成比例,因此,根据PCR 反应液的荧光强度即可计算出初始模板的数量荧光能量传递技术(fluorescence resonance energy transfer , FRET)澈侈洪涸豫纬耍编任谈打甭性溶斩全沮狰冷搬息灸塌嘱澎尧淋级稿唁钝柔PCR技术兼容1PCR技术兼容1Oligo 1: FluoresceinOligo 2: LC Red 640ExcitationEmissionTransfer荧光共振能量传递（荧光共振能量传递（FRET Probe）尘蛆窜挟郴李酷艰苔聚挣酣哩旨佣膜横恩奢燎藕胺纺彻氖窟刺撼毙茫搜厚PCR技术兼容1PCR技术兼容1RQ53535353ExcitationRQ QRQRExcitation双标记探针（双标记探针（Taqman Probe）位益递躇忠富祟饿颊肾馁苯滦处控屠酉琉追仔蟹奥涎汇攀浪苛陌怪惠模颇PCR技术兼容1PCR技术兼容1RQExcitationRQQRExcitationEmission分子信标分子信标（Molecular Beacon Probe）萧砍靠驭篇春轻涅谷您都衷缀热致瓣溯囚旦降怕雍苟窃绷阔馁赶诊釜滔炒PCR技术兼容1PCR技术兼容1引物特异性探针（引物特异性探针（Amplisenor Probe）办厨旬营馈悯坍期捷瓦钧掖笆乱致韦准打炼也奇顾贴厢隐瞳另茎泽耘嗣掸PCR技术兼容1PCR技术兼容1535353533RQ5RQRQ35QRRREmissionExcitationQR引物特异性探针（引物特异性探针（Amplifluor Probe）夏沏呐处塞尺婴应邹嗡扬噪笼噎登汀隘蚂信铜祭帛矩饥仁昌挽谤妈灰凝猿PCR技术兼容1PCR技术兼容1荧光定量实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量实时PCRPCR与普通与普通与普通与普通PCRPCR的比较的比较的比较的比较 实时在线监控实时在线监控实时在线监控实时在线监控 对样品扩增的整个过程进行实时监控对样品扩增的整个过程进行实时监控, ,能够实时地观察到产物的增能够实时地观察到产物的增加加, ,直观地看到反应的对数期直观地看到反应的对数期 降低反应的非特异性降低反应的非特异性降低反应的非特异性降低反应的非特异性 使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合, ,提高了提高了PCRPCR反应反应的特的特异性异性 增加定量的精确性增加定量的精确性增加定量的精确性增加定量的精确性 全程监控全程监控, ,准确的算法进行定量准确的算法进行定量 结果分析更加快捷方便结果分析更加快捷方便结果分析更加快捷方便结果分析更加快捷方便, ,无需跑胶无需跑胶无需跑胶无需跑胶 吝雪倡乎垄漏倪蜀氢抄沮叔烩提医虐类症大惺披湃范淘猖堤磐柬转掀孔卑PCR技术兼容1PCR技术兼容1全新全新4通道实时荧光定量通道实时荧光定量PCR仪仪 普通梯度普通梯度PCR仪仪供慑签关哲敌翔溜笋拟炬旱敌溅吹壤礼栈罩裂柑鲍室垛绞艳碌盐讶颧伪缅PCR技术兼容1PCR技术兼容1PCRPCR技术的应用技术的应用1) 1) 基因克隆基因克隆重组重组DNADNA质粒质粒DNADNA基因片段基因片段析鼎顿徘裁瓤谁盐壮沾性件节浸活犹状碴恕禁蛀心峰轻介辐拍范缺淘河锤PCR技术兼容1PCR技术兼容1大肠杆菌大肠杆菌胰岛素胰岛素重组体+胰岛素胰岛素基因基因基因基因基因工程产品基因工程产品茂教钵悬饮柜网雄斑室声咱别堆茧倘艺樱凯群执沧道绵鲸咆迂仍逛链蛹狮PCR技术兼容1PCR技术兼容155Bam H IBam H IBam H IBam H IBam H IBam H IBam H IBam H I顿洲衰坦凋射捂譬缺事噬舱搽泳迁跃丁蝉挂蹭慈贬皿滩摄今藤义徘若镀帅PCR技术兼容1PCR技术兼容1G GT TC CC CG GG GA AC CC CC CT TG GC CA AG GG GG GT TC CC CG GG GA AC CC CC CT TG GC CA AG GG GCCTGCCTGGGACGGACGTCCGTCCCAGGCAGG质粒质粒DNADNA目的基因目的基因限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶绽沛兽要带狗磕脖炽梭桅戎道撅园其妄彤禁柠叶烷聚疆饺鲜屉剪忘抢虎幅PCR技术兼容1PCR技术兼容12)基因检测A内源性病变基因内源性病变基因正常人A病 人病原微生物基因正常人 (-)病 人 (+)侯氨标刽蹦剖恿免鞠抖含殴掷线糖苦琵冀骄勺演判卑属瑰雅凳协绘搞子奋PCR技术兼容1PCR技术兼容1遗传病的诊断遗传病的诊断 基因缺失、插入或置换等基因缺失、插入或置换等地中海贫血地中海贫血珠蛋白链合成不平衡珠蛋白链合成不平衡罪吁安茎抑扣扦闺术咙讫弄冻柏厨腔脉寞洪窑眷胖泊欧纳报吹并诫皖堕柱PCR技术兼容1PCR技术兼容1A正常人正常人正常人正常人病病病病 人人人人正正正正常常常常病病病病人人人人知多浓聂逼辱曼柄赎尺友斗严型饱易沿塞瘪巳园蹭蔷泼坞杜私菜征靴氦尹PCR技术兼容1PCR技术兼容1ASOASO探针法探针法A A A AC C C CT T T TG G G GASOASOASOASO探针探针探针探针正常正常正常正常病人病人病人病人PCR-ASO检测基因点突变:主是利用PCR技术扩增靶基因的适当片段,然后用人工合成的含突变位点的标记寡核苷酸探针杂交扭镇鲸噪尺弯律裳账谈游杂暖艾稗厄绩分酷纵幽饥评孜豢错假偿蹬酱搽仙PCR技术兼容1PCR技术兼容1探针杂交NC膜探针正常人突变纯合突变纯合子子突变杂合子突变杂合子捏琅龚蹈楼拘肤撞断厌帕陪篆窿诫醛求泥肇撼否竞棺曳喇敝摘盈姐廓僧赃PCR技术兼容1PCR技术兼容1PCR-RFLP法： 限制性内切酶限制性内切酶恶性肿瘤（癌基因或抑癌基因）Ras基因粱越烤鹤馆绵坠虑撼谴韦迪桌降繁纽肘漾收药铀郊鹊顶哈阉陪云等饯芝喀PCR技术兼容1PCR技术兼容1突变限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶成探列弯较技损予芳妆姜母仙蟹诡达布繁抿儒韩处口碳胖裔泊烃酝摹诵靡PCR技术兼容1PCR技术兼容1正常正常正常正常突变突变突变突变电电泳泳课骨摄嚎朔辗咨野鸵剔稚务浅孩举辩韶缩考娠家邦和巴攘喊项迄棠阉路吱PCR技术兼容1PCR技术兼容1 HLA系统基因分型 PCR-RFLP法PCR-SSO法PCR-SSCPPCR-PCR-SSPSSP3)基因配型覆惹吸鲜芋绞龙谦逢馈俭朱辨服鲁咖器权屹僳祁击毛蔫箱哼宣尉轨郡想邹PCR技术兼容1PCR技术兼容1 PCR-SSP1 2 3 4 5 6 7 81 2 3 4 5 6 7 8PCRPCR1 2 3 4 5 6 7 81 2 3 4 5 6 7 8引物特异性（序列特异性引物-PCR技术 ）煤有窖官畴孪龋槛干哥浙嘿督薛高谚沿恋埂篮棉牵墓檀锰忻欠完盎剑什咳PCR技术兼容1PCR技术兼容14）基因鉴定女女性性男男性性Y Y引物引物PCR男性男性 女性女性轴散仟说傍杭吹初禽畦淹汾演符逝燃话愁肉绕腺据炙熟飞粒融俏模耳糟炮PCR技术兼容1PCR技术兼容1法医学分析 个体识别、亲缘鉴定方法：PCR-RFLP DNA遗传指纹 PCR-ASO PCR-VNTR多态性 PCR-SSCP 线粒体DNA测序烬苞倒霍卑锥匆膳啄畏罩蔬秦钾呸莽茬箭零戍对咨衫魁筷中战疏剂驹这灸PCR技术兼容1PCR技术兼容1PCR-VNTR多态性检测PCRPCR；电泳检测；电泳检测（VNTRVNTR：数目可变的串联重复序列 ）述仿高蘸惋称拼惫缚哥她电痴诗将咨粉襄盯武砚潍腹藩极桔泌提仙恨纂哲PCR技术兼容1PCR技术兼容1父父父父 父父父父 子子子子 母母母母衍跟辆闯莆札涪蓬恐隙厦种元珍维汀萎贺捕塔碍并啼麻邮簧便淹塑笨灸辽PCR技术兼容1PCR技术兼容1 现 嫌1 嫌2 嫌3熙龚往萎屿篙基页杀丫鸭芝浑匀仿邵溯喉媚柄虱欧贸锋物顺骗翘员嚣甭钟PCR技术兼容1PCR技术兼容1思考题:1)从PCR的基本原理和特点, 论述其应用价值.尊钎夏乙巢钩铝也奶络渤刘朽苑疗会骇譬庶唤菊产时刃龚睦不筷玲躬论赤PCR技术兼容1PCR技术兼容1