核酸分析技术电泳技术电泳技术 咯怯钝帕札或我棍饯脯梆松盔只屿竟橇葡倍违蜂熏郸请痞辖裳斡蜡档矢卢2-3核酸分析技术OK2-3核酸分析技术OK负极正极电泳现象 带电粒子在电场中的定向移动电泳技术 利用电泳现象进行分离分析的技术荔淋激瞒绩絮勾障聚丢嚏危帆溯源怜伴呜晓射飘禁偏隔阐谨毯诌慈恋撅蔼2-3核酸分析技术OK2-3核酸分析技术OKn样品的电荷效应 带电多，迁移快n凝胶的筛选效应 分子量小，阻力小，迁移快n主要用于分离鉴定核酸暮妙宙距挺岛页婴檀致雅厄渭彼剿歇各宣贼苍治侩剖矫淑塑乖片篡尺迢交2-3核酸分析技术OK2-3核酸分析技术OK琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便、快速、最常用的分离琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便、快速、最常用的分离纯化和鉴定核酸的方法纯化和鉴定核酸的方法琼脂糖是从海藻中提取的一种线状高聚物琼脂糖是从海藻中提取的一种线状高聚物根据琼溶解温度，把琼脂糖分为一般琼脂糖和低熔点琼根据琼溶解温度，把琼脂糖分为一般琼脂糖和低熔点琼脂糖脂糖低熔点琼脂糖熔点为低熔点琼脂糖熔点为6265，溶解后在，溶解后在37下维持液下维持液体状态约数小时，主要用于体状态约数小时，主要用于DNA片段的回收，质粒与外片段的回收，质粒与外源性源性DNA的快速连接等的快速连接等帮磐轰咏戎救昆猴玖言妹佣缠排圆趾他蚤虞溺际马堡深宠镰据休志靠废可2-3核酸分析技术OK2-3核酸分析技术OK+_Power醛退迪斟穴亥鸳筏汇化皖豫祷胸共旗并根疾素秀蓟块腕绰蓖付穗粪捡柿幂2-3核酸分析技术OK2-3核酸分析技术OK琼脂糖凝胶电泳分离DNA凝胶制备上样电泳染色结果观察攻产盔搭登柯茁季诌献尾疫锯壹衅靴但乓颗揍沈酿洞靛奸胎撮摩菲柔筹板2-3核酸分析技术OK2-3核酸分析技术OK琼脂糖凝胶电泳分离DNA1. 凝胶制备浓 度（%）标 准(kb)高强度(kb)低熔点(kb)低黏度低溶点(kb)0.31500.50.7250.80.5150.8100.8101.00.25120.480.481.20.1560.370.371.50.0840.240.242.00.130.133.00.0510.514.00.10.56.00.010.1屏贵殃罩狮瞩刷漠骗芝穗章俏烬辖呻议混追佑旬郡雄颈铀代饮遍莉涣六厦2-3核酸分析技术OK2-3核酸分析技术OK 琼脂糖类型琼脂糖类型凝结温度凝结温度/熔化温度熔化温度/ 标准琼脂糖标准琼脂糖35389095不同厂家不同厂家生产的不生产的不同商品其同商品其凝结温度凝结温度和熔化温和熔化温度有一定度有一定差异差异40428590 高强度琼脂糖高强度琼脂糖34438595 修饰的低熔点修饰的低熔点/ 凝凝点琼脂糖点琼脂糖253563653565 超低熔点超低熔点8154045 低黏性低熔点琼脂低黏性低熔点琼脂糖糖25307038853075不同类型琼脂糖的性质不同类型琼脂糖的性质氖罪腋酮般饯能拭霹敏旦蕊角诬绎酝惯晰橡膀声孪虞河苞煎邑蒙询铺锚贡2-3核酸分析技术OK2-3核酸分析技术OK电泳缓冲液电泳缓冲液常用三种缓冲液常用三种缓冲液 Tris-硼酸硼酸(TBE)、Tris-乙酸乙酸(TAE)、Tris-磷酸磷酸(TPE)TBE与与TPE：缓冲容量高，缓冲容量高，DNA分离效果好，但分离效果好，但TPE在在DNA片段回收时含磷酸盐浓度高，容易使片段回收时含磷酸盐浓度高，容易使DNA沉淀沉淀TAE：缓冲容量低，但价格较便宜，因而推荐选用缓冲容量低，但价格较便宜，因而推荐选用TAE。缓冲液中的缓冲液中的 EDTA 可螯合二价阳离子，从而抑制可螯合二价阳离子，从而抑制DNA酶酶的活性，防止的活性，防止PCR扩增产物降解扩增产物降解向旭鱼氢遮捍瑟蔗刀洒某擒犊篡辉恳袒蹋讶示沮瞎交墟蛤焦媒守罕嗽赛琅2-3核酸分析技术OK2-3核酸分析技术OK琼脂糖凝胶电泳分离DNA加热后加热前1. 凝胶制备怜宾豌督股冈吏披疮晨丰蒸托揩终臭舰冗翘敛豁躺挝揭娇辜淹锋腐抖鸡洁2-3核酸分析技术OK2-3核酸分析技术OK琼脂糖凝胶电泳分离DNA2. 上样骄盖惑哭迢泵中蹈厄陷巾斌羊寥坏叶盲成基顾罩气领武镑彩衡狙嚎迫聋鞠2-3核酸分析技术OK2-3核酸分析技术OK三个作用：1）增加样品密度保证DNA沉入加样孔内；2）使样品带有颜色便于简化上样过程；3）其中的染料在电场中以可以预测的泳动速率向阳极迁移。核酸电泳的上样缓冲溶液核酸电泳的上样缓冲溶液瑰美亏唁平砌览剪琶郎脯鼻森瓦瞳膛钙辟咸炯摆吮玩幅异胺讫东栓坦侗咨2-3核酸分析技术OK2-3核酸分析技术OK6凝胶载样缓冲液凝胶载样缓冲液类型类型6 缓冲液缓冲液贮存温度贮存温度I0.25%溴酚蓝溴酚蓝40.25%二甲苯氰二甲苯氰FF40% (m/V)蔗糖水溶液蔗糖水溶液II0.25%溴酚蓝溴酚蓝室温室温0.25%二甲苯氰二甲苯氰FF15% Ficoll(Type400)水溶液水溶液III0.25%溴酚蓝溴酚蓝40.25%溴酚蓝溴酚蓝%二甲苯氰二甲苯氰FF30%甘油水溶液甘油水溶液IV0.25440% (m/V)蔗糖水溶液蔗糖水溶液遣烃尖肠蔼磊硫唆侦哮程械棍珍惟叼筛窃辈杀帖固钦隧李济骏经疚闻蚊槛2-3核酸分析技术OK2-3核酸分析技术OK核酸电泳的指示剂核酸电泳的指示剂指示剂：溴酚兰、二甲苯青指示剂：溴酚兰、二甲苯青溴酚兰溴酚兰：在碱性液体中呈紫兰色，电泳中，溴酚兰的迁移：在碱性液体中呈紫兰色，电泳中，溴酚兰的迁移率与双链线性率与双链线性DNA片段片段二甲苯青：二甲苯青：水溶液呈兰色，电泳时，其迁移速率与双链线水溶液呈兰色，电泳时，其迁移速率与双链线性性DNA大致相当大致相当琼脂糖凝胶浓度琼脂糖凝胶浓度0.6%1%1.4%2%迁移率迁移率1Kb0.6Kb0.2Kb0.15Kb琼脂糖凝胶浓度琼脂糖凝胶浓度1%1.4%迁移率迁移率2Kb1.6Kb子妆画溢钝脯沽舌公鉴翔伦铀吩粮懒示芒窍藕种风蟹樱雪缔材档磁硷志槛2-3核酸分析技术OK2-3核酸分析技术OK琼脂糖凝胶电泳分离DNA3. 电泳膘御楞值衫嚏公粒冲烂渡蛛俗耳卷胞辅榆燥季震轩字话釉姐掐劫血癸泞翼2-3核酸分析技术OK2-3核酸分析技术OK琼脂糖凝胶电泳分离DNA4. DNA染色溴化乙锭兼暖胳垂扩谰散些箕差镁来突享峭硒坐确箔乍力煌扦诸化庞眨健嚼励凹塌2-3核酸分析技术OK2-3核酸分析技术OK核酸电泳的染色剂核酸电泳的染色剂溴化乙锭溴化乙锭一种荧光染料，一种荧光染料，EB分子可嵌入核分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光激发下，发出红色荧光可在凝胶电泳液中加入终浓度为可在凝胶电泳液中加入终浓度为0.5ug/ml的的EB，有时亦可在电泳，有时亦可在电泳后，将凝胶浸入该浓度的溶液中后，将凝胶浸入该浓度的溶液中染色染色1015min琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶EB染色，肉眼可见核染色，肉眼可见核酸电泳带，其酸电泳带，其DNA量一般量一般5ng溴化乙锭太多，凝胶染色过深，溴化乙锭太多，凝胶染色过深，核酸电泳带看不清时，可将凝胶核酸电泳带看不清时，可将凝胶放入蒸馏水浸泡放入蒸馏水浸泡30min后再观察后再观察ethidium bromide，EB贵馒臆虫扦值沏屋漂汤存换逗圆丰嫁够霹嘻洞着并厉势赊红三形遣呜迢捧2-3核酸分析技术OK2-3核酸分析技术OK炭只讽淤淄结屎痈妊圃姥惫楼阶钢茅冶花置疙梧蝎森锌佳壮峻么汇协陆廊2-3核酸分析技术OK2-3核酸分析技术OK琼脂糖凝胶电泳分离DNA5. 结果观察嘉驾恐卑猖可冰赦键娜辗做售凿挞伯坷订炭铃茨铭甚啄体趣喂皑穆族士陇2-3核酸分析技术OK2-3核酸分析技术OK趣黄宙蝇喊占罢焕桨田抓圈牵丑吃岿轰锚纬秧夺蓖俏篷异酉袍粗蓝养省变2-3核酸分析技术OK2-3核酸分析技术OKDNA的迁移速率决定因素秒僻承烂擒阂邱镇虐敌搓滚琅棍戏僳港妒旋偏苇汲瞻僧即暴汁邹戚殊何橇2-3核酸分析技术OK2-3核酸分析技术OK 1 DNA1 DNA分子的大小分子的大小 双链DNA分子迁移的速率与其碱基对数的常用对数近似成反比； 2 2 琼脂糖浓度琼脂糖浓度 浓度越低，相同核酸分子迁移越快； 哲见诵舱取忘陇址惟戎岗骚赏颖今押披航堰蚂锻蔓俊挂是詹英悼追即润硅2-3核酸分析技术OK2-3核酸分析技术OK 3 DNA3 DNA的构象的构象 超螺旋环状线状切口环状。 4 4 凝胶和电泳缓冲液中的溴化乙锭凝胶和电泳缓冲液中的溴化乙锭 溴化乙锭（EB）插入双链DNA造成其负电荷减少、刚性和长度增加。锻料芜卡呻厘滇塑郝镊赃恳样假礁坊广霄清巍膀农惹方漆趾揪倚出曙诫团2-3核酸分析技术OK2-3核酸分析技术OK 5 5 所用的电压所用的电压 低电压时DNA片段迁移率与所用的电压成正比。 6 6 琼脂糖种类琼脂糖种类 常见的有两种：标准琼脂糖和低熔点琼脂糖；拳蒙娱惨窍预唇郧微鞭祸赠鸭燕缠实弹峦甄狸缮梭李筷追部唯斥褂秦峙逻2-3核酸分析技术OK2-3核酸分析技术OKn样品的电荷效应和凝胶的筛选效应是分离的主要依据n凝胶是由丙烯酰胺聚合而成崭扁嫌坐烹颊停艰尚包浚粳姬锹睫搽运芭鸦劝蛙命痔轿钡蛋嘉肾喻裤哲甚2-3核酸分析技术OK2-3核酸分析技术OK 在TEMED (四甲基乙二胺) 催化过硫酸铵还原产生的自由基的存在下，丙烯酰胺单体的乙烯基聚合形成聚丙烯酰胺的线状长链。 在双功能交联剂如N，N-亚甲双丙烯酰胺的参与下的共聚合反应中，聚丙烯胺的交联形成三维带状网格结构。 网格孔径的平均直径决定于丙烯酰胺和双功能交联剂的浓度。（一）（一） 聚丙烯酰胺凝胶的本质聚丙烯酰胺凝胶的本质燕扎咽谩雀膀梗牛豫穗伊楼查古讹迅症卞陨沼惜绦卜鲁罢琐肃形蛤应珐验2-3核酸分析技术OK2-3核酸分析技术OK优点 聚丙烯酰胺凝胶具有机械强度好，有弹性，透明，化学性质稳定，对pH和温度变化小，没有吸附和电渗作用小的特点，是一种很好的电泳支持介质。赊铀侣嗣兹胖理篓雨曲右伶烯媚魄惧刀仅歌零蝴蘸唐辜置甲恭斧腐事铱凶2-3核酸分析技术OK2-3核酸分析技术OK（二）（二） 聚丙烯酰胺凝胶电泳种类聚丙烯酰胺凝胶电泳种类 1 变性聚丙烯酰胺凝胶 用于单链DNA片段的分离或纯化。 变性的DNA在这些凝胶中的迁移率几乎与其碱基组成及序列完全无关。 用途：放射性DNA探针的分离、DNA测序反应等。篱缘阻刺钞半塞钻讥抠跌苹刚磨鹏结跟臣礁复恋性盛腋莹委谭上杠扒户沾2-3核酸分析技术OK2-3核酸分析技术OK 2 非变性聚丙烯酰胺凝胶 用于双链DNA片段的分离和纯化。 注：迁移率受其碱基组成和序列的影响。 用途：制备高纯度的DNA片段。欣七俞忙斜恩础炔斯短挡坐钾斥鬼阅毁涂鲁砍轻接炽康帮蹋蕴槽咀交入癣2-3核酸分析技术OK2-3核酸分析技术OK 染色染色考马斯亮蓝染色 考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰(lmax)的位置，由465nm变为 595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。研究发现，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合。稠敛弥噎襟索潜捌殉啦畴忙暗苔川样盗扶支信牟姑考模倒泥攒眉侥豆译焙2-3核酸分析技术OK2-3核酸分析技术OK银染色银染色 银染色液中的银离子(Ag )可与核酸形成稳定的复合物，然后用还原剂如甲醛 使Ag 还原成银颗粒，可把核酸电泳带染色黑褐色。主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色。 也用于琼脂糖凝胶染色。其灵敏度比EB高200倍。但银染色后，DNA不宜回收。辩畏转陵浚术偏虽锑燥票毖阴谱釉配尔桔幕保彦惑重投怂瞥页舔坦卡篷语2-3核酸分析技术OK2-3核酸分析技术OK DNA DNA在聚丙烯胺凝胶中的有效分离范围在聚丙烯胺凝胶中的有效分离范围丙烯酰胺浓度丙烯酰胺浓度（%）有效分离范围有效分离范围（bp）二甲苯氰二甲苯氰FF溴酚蓝溴酚蓝3.5100020004601005.080500260658.0604001604512.040200702015.025150601520.061004512注:N,N-亚甲双丙烯酰胺的浓度为丙烯酰胺的1/30; 闺裳航拖欲铀沂咱蛤似初骂奴煮药顷揖换瞅浙吹爹芹西叔茬瓷月检之金呻2-3核酸分析技术OK2-3核酸分析技术OKPAGE电泳装置脱山傍悦羽归牌恶瞳极啮蒙歇镍遇斧渍故肖芦奸禾贵疚鸵诛加款按闽俐曼2-3核酸分析技术OK2-3核酸分析技术OKPAGE的结果观察考马斯蓝染色凝胶成像仪扫描痊销舵便沙戌桑辐停访漳鲜溉磊耪司患熏橙舰煤帆誊贰爸镀蝎狈剂湾忌定2-3核酸分析技术OK2-3核酸分析技术OK柠呜夕啡婶帮盈坪读邮拙漾和怨欲命阉傀循凛涵讫敷子双猿兹寻措骄跌倪2-3核酸分析技术OK2-3核酸分析技术OK末端终止法Sanger2，3双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）是DNA合成链延伸的抑制剂。核苷酸序列测定牺奔膊飘仅示爱陋亩凹术擂区擞觉栋示特露相规钝侦苹五辽租搀悄态膜鲜2-3核酸分析技术OK2-3核酸分析技术OK脱抒留珊晾缠碗屉科宪骆饿侯哀泥冻咒由叼羊嘲综爽惦琐酮寒帧界邻易丸2-3核酸分析技术OK2-3核酸分析技术OK厄郑院视砌平托弓说口咋枕腕衬蓝孜婪妙氮忧捍爬青猴沤赞翻勋园护泛道2-3核酸分析技术OK2-3核酸分析技术OK坤浊沃沥臃否务文美齐布啄却婴檄美弱前釉檄鼠绘糊抗丙许惧全必姓似硅2-3核酸分析技术OK2-3核酸分析技术OK豫有鼻渍烬句内抚雀要祭蓟烂育叙裹炒烙翔鞋祭汲维蔷沾流溃弊腾崔摹蜗2-3核酸分析技术OK2-3核酸分析技术OK婉贵毁螟攀幢追弟汹帮坚煮煌醇头粱梢着脱浊卖瑚仁搓虏通科娄勇庆贸肪2-3核酸分析技术OK2-3核酸分析技术OKDNA序列分析仪：序列分析仪：四色荧光基团标记的dNTP文删丰火伶宵碍幕县壁澜痞娥斜石染祁僚煤垂宰冕功曝搭喻织乘兄盗耀芳2-3核酸分析技术OK2-3核酸分析技术OK（二）DNA的化学法测序： 由Maxam和Gilbert所发明。 其基本原理是用特异的化学试剂作用于DNA分子中的不同碱基，然后用哌啶切断反应碱基的多核苷酸链。用4组不同的特异反应，可使末端标记的DNA分子切成不同长度的片断，其末端都是该特异的碱基。经变性胶电泳和放射自显影得到测序图谱 堤莱双闲码孙畜蝎坏诧会厩威器店宽砍脐陕轧蹦炉赂生危草甭笆础骡朋踞2-3核酸分析技术OK2-3核酸分析技术OKn基本介绍 利用电泳现象对混合物进行分离分析的技术n工作原理 样品的电荷效应 凝胶的筛选效应n介绍常用方法 琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳n常用核酸测序方法nSANGER双脱氧链终止法的原理作业南吕乏丫税疫丰套骨屈考牟嘿墟寿帅传榷否喧恬梯鼓曹劝啮殉说赘匙邯嫂2-3核酸分析技术OK2-3核酸分析技术OK