流式细胞术流式细胞术及其科研应用及其科研应用流式细胞仪的原理流式细胞仪的原理BD BiosciencesImmune Function流式细胞术的基本概念流式细胞术的基本概念=流式细胞术（流式细胞术（Flow Cytometry, Flow Cytometry, 简称简称FCMFCM）是一种可是一种可以快速、准确、客观，并且同时检测单个微粒（通常以快速、准确、客观，并且同时检测单个微粒（通常是细胞）的多项特性，并加以定量的技术，同时可以是细胞）的多项特性，并加以定量的技术，同时可以对特定群体加以分选对特定群体加以分选=研究对象为生物颗粒，如各种细胞、微生物及人工合研究对象为生物颗粒，如各种细胞、微生物及人工合成微球等成微球等=研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加以研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加以定量定量BD BiosciencesImmune Function流式细胞术的特点流式细胞术的特点v极短时间内可分析大量细胞，只要标本中的细胞数量足够，极短时间内可分析大量细胞，只要标本中的细胞数量足够，流式细胞仪（流式细胞仪（Flow cytometerFlow cytometer）可以每秒钟数十、数百、数）可以每秒钟数十、数百、数千个细胞的速率进行测量，测量的细胞总数可达数千、数万千个细胞的速率进行测量，测量的细胞总数可达数千、数万乃至数百万个。乃至数百万个。 v可同时分析单个细胞的多种特征，当同时用多种分子探针，可同时分析单个细胞的多种特征，当同时用多种分子探针，如用不同荧光素标记的不同单克隆抗体进行多色荧光染色，如用不同荧光素标记的不同单克隆抗体进行多色荧光染色，通过流式细胞分析，即可获得单细胞的多种信息，使细胞亚通过流式细胞分析，即可获得单细胞的多种信息，使细胞亚群的识别、计数更为准确。群的识别、计数更为准确。v定性或定量分析细胞：通过荧光染色对单细胞的某些成分如定性或定量分析细胞：通过荧光染色对单细胞的某些成分如DNADNA含量、抗原或受体表达量、含量、抗原或受体表达量、CaCa2+2+浓度、酶活性以及细胞的浓度、酶活性以及细胞的功能等均可进行单细胞水平的定性与定量分析功能等均可进行单细胞水平的定性与定量分析 v强大的分选功能，在分析的强大的分选功能，在分析的同时可以对特定群体加以分选同时可以对特定群体加以分选BD BiosciencesImmune Function流式细胞仪的检测范围流式细胞仪的检测范围细胞结构细胞结构=细胞大小细胞大小=细胞粒度细胞粒度=细胞表面面积细胞表面面积=核浆比例核浆比例=DNADNA含量与细胞周期含量与细胞周期=RNARNA含量含量=蛋白质含量蛋白质含量细胞功能细胞功能=细胞表面细胞表面/ /胞浆胞浆/ /核的特异核的特异性抗原性抗原=细胞活性细胞活性=细胞内细胞因子细胞内细胞因子=酶活性酶活性=激素结合位点激素结合位点=细胞受体细胞受体BD BiosciencesImmune Function当前流式细胞分析发展趋势当前流式细胞分析发展趋势v从相对细胞计数到绝对细胞计数从相对细胞计数到绝对细胞计数 v从相对定量到绝对定量分析从相对定量到绝对定量分析v从单色到多色荧光分析从单色到多色荧光分析 v从细胞膜成分到细胞内成分分析从细胞膜成分到细胞内成分分析v从细胞分析到可溶性成分的流式细胞分析从细胞分析到可溶性成分的流式细胞分析 BD BiosciencesImmune Function散射光信号散射光信号Right Angle Light Detector Cell ComplexitySSCForward Light Detector Cell Surface Area FSCIncident Light Source=前向角散射光（前向角散射光（FSC, Forward ScatterFSC, Forward Scatter）细胞相对大小及其表面积细胞相对大小及其表面积 =侧向角散射光（侧向角散射光（SSC, Side ScatterSSC, Side Scatter）细胞粒度及细胞内相对复杂性细胞粒度及细胞内相对复杂性LaserFALS SensorBD BiosciencesImmune Function外周全血细胞散射光双参数点图外周全血细胞散射光双参数点图（红细胞溶解后）（红细胞溶解后）BD BiosciencesImmune Function流式细胞仪的检测信号流式细胞仪的检测信号荧光信号荧光信号使用荧光标记的单克隆抗体染色，做多色分析使用荧光标记的单克隆抗体染色，做多色分析荧光信号的强弱，反映了细胞抗原的表达含量荧光信号的强弱，反映了细胞抗原的表达含量BD BiosciencesImmune Function荧光信号荧光信号双色直接染色双色直接染色BD BiosciencesImmune Function数据分析数据分析=直方图分析直方图分析BD BiosciencesImmune Function数据分析数据分析=点图分析点图分析BD BiosciencesImmune Function数据分析数据分析=等高图和密度图分析等高图和密度图分析BD BiosciencesImmune Function数据分析数据分析=三维图分析三维图分析流式细胞仪的应用流式细胞仪的应用BD BiosciencesImmune Function临床研究临床研究: : 血液、肿瘤、药理、免疫.生物学研究：生物学研究：遗传、生殖、微生物、细胞生物、毒理、分子生物、.环境研究：环境研究：海洋生态研究.制药工业制药工业食品工业食品工业农业畜牧业农业畜牧业流式细胞仪的应用领域流式细胞仪的应用领域BD BiosciencesImmune Function流式细胞仪的临床应用流式细胞仪的临床应用( (免疫免疫) )淋巴细胞免疫分型淋巴细胞免疫分型淋巴细胞亚群分析淋巴细胞亚群分析CD4CD4绝对计数绝对计数HIVHIV的诊断与研究的诊断与研究淋巴细胞淋巴细胞 CD4/CD8CD4/CD8分析分析CD4CD4绝对计数绝对计数T T细胞活化细胞活化细胞移植的交叉配型和免疫状态监测细胞移植的交叉配型和免疫状态监测免疫功能和免疫调控的研究免疫功能和免疫调控的研究淋巴细胞和单核细胞的活化检测淋巴细胞和单核细胞的活化检测细胞因子的检测细胞因子的检测HLA-B27HLA-B27检测检测BD BiosciencesImmune Function流式细胞仪的临床应用流式细胞仪的临床应用( (血液血液) )白血病和淋巴瘤免疫分型白血病和淋巴瘤免疫分型残留白血病残留白血病造血干细胞计数造血干细胞计数PNHPNH诊断诊断网织红细胞分析网织红细胞分析血小板分析血小板分析血小板膜糖蛋白分子的表达血小板膜糖蛋白分子的表达血小板活化血小板活化网织血小板分析网织血小板分析BD BiosciencesImmune Function流式细胞仪的临床应用流式细胞仪的临床应用( (肿瘤肿瘤) )细胞周期分析细胞周期分析uDNA非整倍体的出现可能是癌前病变发生早期癌变的一个重要标非整倍体的出现可能是癌前病变发生早期癌变的一个重要标志志u在在L&L病理形态学不能做出诊断前可提供确切诊断信息病理形态学不能做出诊断前可提供确切诊断信息uDNA非整倍体的交界瘤应按恶性对待非整倍体的交界瘤应按恶性对待u形态学表现良性的肿瘤出现非整倍体提示恶变可能形态学表现良性的肿瘤出现非整倍体提示恶变可能uDNA指数可作为判断间叶组织肿瘤良恶性的辅助指标指数可作为判断间叶组织肿瘤良恶性的辅助指标多药耐药基因的检测多药耐药基因的检测BD BiosciencesImmune Function流式细胞仪的科研应用流式细胞仪的科研应用=树突细胞研究树突细胞研究=干细胞研究干细胞研究=细胞凋亡细胞凋亡=细胞动力学功能研究细胞动力学功能研究=环境微生物分析环境微生物分析=流式细胞术与分子生物学研究流式细胞术与分子生物学研究BD BiosciencesImmune Function淋巴细胞亚群分析淋巴细胞亚群分析根据功能，淋巴细胞主要分为根据功能，淋巴细胞主要分为B B淋巴细胞（淋巴细胞（CD19+CD19+），与体液免疫有关），与体液免疫有关T T淋巴细胞（淋巴细胞（CD3+CD3+），与细胞免疫有关），与细胞免疫有关总总T T和总和总B B可以用来判断某些免疫缺陷和自身免疫性疾病可以用来判断某些免疫缺陷和自身免疫性疾病 NKNK细胞（细胞（CD3-CD16+56+CD3-CD16+56+），行使免疫监控功能），行使免疫监控功能，能能够介导对某些肿瘤细胞和病毒感染细胞的细胞毒性够介导对某些肿瘤细胞和病毒感染细胞的细胞毒性作用。作用。BD BiosciencesImmune Function淋巴细胞亚群分析淋巴细胞亚群分析根据根据CD4CD4、CD8CD8表达，表达，T T淋巴细胞又分为淋巴细胞又分为T T辅助辅助/ /诱导细胞（诱导细胞（CD3+CD4+CD3+CD4+）T T抑制抑制/ /细胞毒性细胞（细胞毒性细胞（CD3+CD8+CD3+CD8+）Th/Ts Th/Ts 评价那些自身免疫失调或被怀疑是免疫失调或已评价那些自身免疫失调或被怀疑是免疫失调或已知患有免疫缺陷的病人的免疫状态，此外，这一比值还知患有免疫缺陷的病人的免疫状态，此外，这一比值还可用来监测骨髓移植病人以免受到急性可用来监测骨髓移植病人以免受到急性GVHDGVHD的攻击的攻击 Th/TsTh/Ts升高：自身免疫性疾病（类风湿性关节炎、升高：自身免疫性疾病（类风湿性关节炎、SLESLE） Th/TsTh/Ts降低：病毒感染、恶性肿瘤、再生障碍性贫血降低：病毒感染、恶性肿瘤、再生障碍性贫血BD BiosciencesImmune Function常见疾病的常见疾病的T T 淋巴细胞的变化淋巴细胞的变化：疾病疾病 CD4+ CD8+ CD4+/CD8+ 类风湿性关类风湿性关节炎节炎 （活动期）（活动期） 系统性红斑狼疮系统性红斑狼疮 - 或或 （活动期）（活动期） 多发性硬化症多发性硬化症 重症肌无力重症肌无力 膜型肾小球肾炎膜型肾小球肾炎 胰岛素依赖性糖尿病胰岛素依赖性糖尿病 乙型肝炎乙型肝炎 自身溶血性贫血自身溶血性贫血 上呼吸道感染上呼吸道感染 BD BiosciencesImmune Function常见疾病的常见疾病的T T 淋巴细胞的变化淋巴细胞的变化 CD3+ CD4+ CD8+ CD4+/CD8+ 肿瘤肿瘤 再障及粒细胞减少症再障及粒细胞减少症 巨细胞病毒感染巨细胞病毒感染 血小板减少血小板减少 活动性特应性皮炎活动性特应性皮炎 过敏性皮炎过敏性皮炎 BD BiosciencesImmune Function淋巴细胞亚群双色分析淋巴细胞亚群双色分析12%76%49%26%11%BD BiosciencesImmune FunctionAIDS 病人病人T亚群分析亚群分析27-51%15-44%50-84%BD BiosciencesImmune Function先天性无先天性无 r 球蛋白血症球蛋白血症5-18%淋巴细胞淋巴细胞活化功能研究活化功能研究BD BiosciencesImmune FunctionT淋巴细胞活化淋巴细胞活化细胞数目增殖细胞数目增殖细胞表面表达细胞表面表达活化标记活化标记分泌细胞因子分泌细胞因子BD BiosciencesImmune FunctionT细胞激活抗原表达的动力学曲线细胞激活抗原表达的动力学曲线BD BiosciencesImmune Function活化的淋巴细胞分泌细胞因子活化的淋巴细胞分泌细胞因子FastImmune Assay System快速全面检测淋巴细胞功能快速全面检测淋巴细胞功能 BD BiosciencesImmune FunctionBDFastImmuneActivationSystem快速免疫活化检测系统快速免疫活化检测系统lymphocyte Activation4hStain15minLyse/Fix15minAcqusitionerythrocytestimulusBD BiosciencesImmune Function优点点快速快速全程全程5h简便便全血分析全血分析（肝素肝素钠抗凝血抗凝血）无需分离无需分离PBMCs无需无需组织培养培养免洗免洗试剂，无需洗，无需洗涤离心离心高效高效多参数分析加速研究多参数分析加速研究进程程功能活性功能活性检测同同时报告告单个个细胞胞亚型型可外延可外延T细胞分析可胞分析可进行行亚群分析群分析可外延于可外延于B、NK、单核核细胞胞接近生物体接近生物体自身分析条件自身分析条件应用全血保留了用全血保留了细胞与生化微胞与生化微环境境更能代表体内状更能代表体内状态BDFastImmuneActivationSystem快速免疫活化检测系统快速免疫活化检测系统BD BiosciencesImmune Function应用实例：应用实例：HIVHIV病例病例T T细胞活化检测细胞活化检测BD BiosciencesImmune FunctionBDFastImmuneCytokineSystem快速免疫细胞因子检测系统快速免疫细胞因子检测系统 AntiIFNgCD69 Activation37IncubationIntracellularStainLyse/FixAcqusitionPermeabilizelymphocyteerythrocytestimulusSurfaceStainWashcytokineWashWashprotein blocking基于细胞水平的研究基于细胞水平的研究胞内因子胞内因子胞外因子胞外因子BD BiosciencesImmune Function优点点快速快速一天内完成，实验流程需6-8小时简便便全血分析全血分析（肝素肝素钠抗凝血抗凝血）无需分离无需分离PBMCs无需无需组织培养培养高效高效可在同一个细胞内同时检测两种或更多种细胞因子可在同一个细胞内同时检测两种或更多种细胞因子也可根据细胞免疫表型区分分泌细胞因子的细胞亚型，也可根据细胞免疫表型区分分泌细胞因子的细胞亚型，进行多参数相关分析进行多参数相关分析接近生物体接近生物体自身分析条件自身分析条件应用全血保留了用全血保留了细胞与生化微胞与生化微环境境更能代表体内状更能代表体内状态注意注意质控：用质控：用CD69做刺激和破膜效果的判定做刺激和破膜效果的判定BDFastImmuneCytokineSystem快速免疫细胞因子检测系统快速免疫细胞因子检测系统BD BiosciencesImmune Function应用实例：分析应用实例：分析1型与型与2型免疫反应型免疫反应Cytometric Beads Array (CBA)流式液相多重蛋白流式液相多重蛋白定量技术定量技术BD BiosciencesImmune Function导言导言常规的蛋白分析方法：常规的蛋白分析方法：ELISA：一次反应只能检测一个指标：一次反应只能检测一个指标Westernblot：不能对蛋白精确定量：不能对蛋白精确定量不足之处：不足之处：检测多个指标需耗费大量样本检测多个指标需耗费大量样本分批操作导致组间差异大分批操作导致组间差异大操作繁琐，耗时耗力操作繁琐，耗时耗力如何能够从单个微量样本中一次检测多个目标蛋白，并加以定量，获得如何能够从单个微量样本中一次检测多个目标蛋白，并加以定量，获得高精确度的数据呢？高精确度的数据呢？针对于此，针对于此，BD-Pharmingen成功研发了基于流式细胞仪检测平台的液相成功研发了基于流式细胞仪检测平台的液相多重蛋白定量技术多重蛋白定量技术BDCytometricBeadArray，简称，简称CBA BD BiosciencesImmune FunctionCBACBA技术简介技术简介CBA是是一一系系列列带带有有不不同同强强度度红红色色荧荧光光、包包被被有有捕捕获获抗抗体体的的微微球球，类类似似ELISA的的捕捕获获孔孔板板，可可以以捕捕获获液液相相样样本本（血血清清、血血浆浆或或者者细细胞胞培培养养上上清清液液等等）中中相相应应的的抗抗原原，再再结结合合PE标标记记检检测测抗抗体体，形形成成双双抗抗体体夹夹心心结结构构，通通过过流流式式细细胞胞仪仪进进行行荧荧光光检检测测，便便可可同同时时对对样样本中的多种可溶性蛋白成分进行定量本中的多种可溶性蛋白成分进行定量+Analyte of interestFluorescent detection Ab capture Bead capture AbBeadBD BiosciencesImmune FunctionBDCytometricBeadArray123不同强度红色荧光不同强度红色荧光的捕获微球，在的捕获微球，在FCMFL3检测检测不同的目标蛋白不同的目标蛋白PE标记的检测抗体，标记的检测抗体，在在FCMFL2检测。检测。PE的荧光强度即反映的荧光强度即反映靶蛋白的含量靶蛋白的含量456Human Th1/Th2 Lymphokine CBABD BiosciencesImmune FunctionHumanTh1/Th2LymphokineCBATh1/Th2 panel: IL2, IL4, IL5, IL10, TNF, IFN用 FL3荧光的强度不同区别 种不同的微球（beads）Direct sandwich immunoassayFL2 (PE) detector reagentl样本处理l6 cytokines from a 50 L samplelThree pipetting stepsl3 hour total incubationlQuantitative results and complete report generationSoftware assisted quantitative analysis, with curve fitting algorithmResult reporting included in softwareBD BiosciencesImmune FunctionHumanTh1/Th2LymphokineCBABD BiosciencesImmune FunctionHumanTh1/Th2CytokineCBAKitNosampleaddedinDetectorantibodiesonlyBD BiosciencesImmune Function Chemokine-ICBAAssayStandard0 pg/mlCBAAssayStandardBD BiosciencesImmune Function10 pg/mlCBAAssayStandard cont. cont.Chemokine-ICBAAssayStandardBD BiosciencesImmune Function20 pg/mlCBAAssayStandard cont. cont.Chemokine-ICBAAssayStandardBD BiosciencesImmune Function40 pg/mlCBAAssayStandard cont. cont.Chemokine-ICBAAssayStandardBD BiosciencesImmune Function80 pg/mlCBAAssayStandard cont. cont.Chemokine-ICBAAssayStandardBD BiosciencesImmune Function156 pg/mlCBAAssayStandard cont. cont.Chemokine-ICBAAssayStandardBD BiosciencesImmune Function312 pg/mlCBAAssayStandard cont. cont.Chemokine-ICBAAssayStandardBD BiosciencesImmune Function625 pg/mlCBAAssayStandard cont. cont.Chemokine-ICBAAssayStandardBD BiosciencesImmune Function1250 pg/mlCBAAssayStandard cont. cont.Chemokine-ICBAAssayStandardBD BiosciencesImmune Function2500 pg/mlCBAAssayStandard cont. cont.Chemokine-ICBAAssayStandardBD BiosciencesImmune FunctionHumanTh1/Th2LymphokineCBA 标准曲线标准曲线5000 pg/ml2500 pg/ml1250 pg/ml625 pg/ml312 pg/ml80 pg/ml20 pg/mlIL-2IL-4IL-5IL-10TNF- IFN- IL-2IL-4IL-5IL-10TNF- IFN- BD BiosciencesImmune Function操作步骤操作步骤检测物与捕获微球共检测物与捕获微球共孵育孵育。洗涤洗涤。标记标记荧光探测试剂（荧光探测试剂（FITC或或PE标记）。标记）。洗涤洗涤。流式细胞仪上机流式细胞仪上机检测检测。CBA分析软件批量数据分析分析软件批量数据分析。BD BiosciencesImmune FunctionCBA分析软件分析软件HomeScreenToolbarCalibrationentryscreenBD BiosciencesImmune Function与传统的与传统的ELISAsELISAs检测相比检测相比能够同时对单一样本进行多种目的蛋白检测能够同时对单一样本进行多种目的蛋白检测较传统检测节省样本量（较传统检测节省样本量（50l）与与ELISAs相比灵敏度高（相比灵敏度高（2.8pg/ml）、重复性好）、重复性好检测的线性范围宽（检测的线性范围宽（0-5000pg/ml）所有分析只需一组标准曲线所有分析只需一组标准曲线避免酶联反应所致人工假象避免酶联反应所致人工假象强大的强大的CBA分析软件分析软件节省操作时间、检测时间和分析时间节省操作时间、检测时间和分析时间BD BiosciencesImmune FunctionHuman Allergy Mediator KitBD BiosciencesImmune Function使用使用Prostate-specificantigen（PSA-3）及其突变体）及其突变体PSA-3A对前列腺癌患者对前列腺癌患者T细胞免疫，通过细胞免疫，通过HumanTh1/Th2CytokineCBAKit检测免疫检测免疫T细胞的细胞因子分泌水平细胞的细胞因子分泌水平A，B，C为稀释标准，为稀释标准，D为无处理对照组，为无处理对照组，E为为PSA-3A处理组，处理组，F为为PSA-3处理组处理组摘自摘自TerasawaH,etal.ClinicalCancerResearch.Vol.8,41-53,January2002上述研究发现上述研究发现PSA-3A比比PSA-3能更有效的杀伤前列腺肿瘤，与能更有效的杀伤前列腺肿瘤，与PSA-3A能刺激能刺激T细胞分泌更高水平细胞分泌更高水平的的IL-2、IL-4、IL-5和和IFN-有关，为后续药物开发打下基础有关，为后续药物开发打下基础BD BiosciencesImmune FunctionCBA新产品系列新产品系列CBAFlexSet基本原理与基本原理与CBAKit相似，略有不同相似，略有不同检测原理：检测原理：FlexSet微球带有近红外和红色两种荧光，分别在流微球带有近红外和红色两种荧光，分别在流式细胞仪的式细胞仪的FL3（近红外荧光）和（近红外荧光）和FL4（红色荧光）通道检测，（红色荧光）通道检测，通过这个二维矩阵（对应于微球上的特定序号）识别捕获微球，通过这个二维矩阵（对应于微球上的特定序号）识别捕获微球，从而鉴定目的蛋白，从而鉴定目的蛋白，PE标记的检测抗体在标记的检测抗体在FL2通道来对目的蛋通道来对目的蛋白定量白定量newBD BiosciencesImmune FunctionCBAFlexSet的分析软件的分析软件FCAPArraySoftwareBD BiosciencesImmune FunctionCBAKit与与CBAFlexSetCBAKit同时检测同时检测5、6或者或者7个个全部试剂全部试剂CBAAnalysisSoftware检测指标组合固定检测指标组合固定CBAFlexSet最多达最多达75个个需另购需另购BufferkitFCAPArraySoftware检测指标可自由组合检测指标可自由组合BD BiosciencesImmune FunctionCBA/CBAFlexset的应用领域的应用领域血清、血浆、眼泪、房水、唾液、体腔灌洗液、细胞培养液上血清、血浆、眼泪、房水、唾液、体腔灌洗液、细胞培养液上清、细胞裂解物等各种液相样本中可溶性细胞因子、炎症因子、清、细胞裂解物等各种液相样本中可溶性细胞因子、炎症因子、趋化因子、酶等的浓度检测趋化因子、酶等的浓度检测细胞信号传导中磷酸化蛋白、凋亡相关蛋白定量分析细胞信号传导中磷酸化蛋白、凋亡相关蛋白定量分析 免疫疾病或传染疾病（如眼部疾病、类风湿性关节炎、系统性免疫疾病或传染疾病（如眼部疾病、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、新生儿溶血症及脓血症、病毒性感染等）的辅助诊红斑狼疮、新生儿溶血症及脓血症、病毒性感染等）的辅助诊断和监控断和监控肿瘤研究肿瘤研究药效评价，药物研发、疫苗研究药效评价，药物研发、疫苗研究总体免疫功能分析总体免疫功能分析BD BiosciencesImmune Function现有现有CBA Kit产品产品Human Allergy Mediator KitIL-3, IL-4, IL-5, IL-7, IL-10, GM-CSFHuman Allergy Mediator Kit IIIL-3, IL-4, GM-CSF, G-CSF, EotaxinHuman Anaphylatoxin KitC4a, C3a, C5aHuman Angiogenesis KitIL-8, bFGF, Angiogenin, VEGF, TNFHuman Chemokine KitIL-8, RANTES, MIG, MCP-1, IP-10Human Chemokine Kit IIIL-8, RANTES, MIP-1a, MIP-1b, MCP-1Human Inflammation KitIL-8, IL-1b, IL-6, IL-10, TNF, IL-12p70Human Th1/Th2 Cytokine KitIL-2, IL-4, IL-5, IL-10, TNF, IFN-gHuman Th1/Th2 Cytokine II Kit IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF, IFN-gMouse Inflammation KitIL-6, IL-10, MCP-1, IFN-g, TNF, IL-12p70Mouse Th1/Th2 Cytokine KitIL-2, IL-4, IL-5, IFN-g, TNFNon-human Primate Th1/Th2 Cytokine KitIL-2, IL-4, IL-5, IL-6,TNF, IFN-gHuman Apoptosis KitCleaved PARP, Bcl-2, Active Caspase-3Mouse Immunoglobulin Isotyping KitHeavy and light chain isotypes of mouse IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgA, IgM, IgEHuman Inflammation Lyophilized StandardsIL-8, IL-1b, IL-6, IL-10, TNF, IL-12p70Human Th1/Th2 Cytokine Lyophilized StandardsIL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, TNF, IFN-gMouse Inflammation Lyophilized StandardsIL-6, IL-10, MCP-1, TNF, IFN-g, IL-12p70Mouse Th1/Th2 Cytokine Lyophilized StandardsIL-2, IL-4, IL-5, IFN-g, TNFBD BiosciencesImmune Function信号传导类信号传导类细胞因子类细胞因子类磷酸化蛋白磷酸化蛋白人人 小鼠小鼠 大鼠大鼠ERK(T202/Y204)JNK(T183/Y185)p38/MAPK(T180/Y182)PLC-gamma(Y783)ZAP70(Y319)Syk(Y352)Stat1(Y701)Btk(Y551)RSK(T573)Itk(Y511)eNos(S1177)ZAP70（Y319）TotalSykTotalStat1IFN-IL-2IL-4IL-5IL-6IL-8IL-10IL-1IP-10IL-12p70LT-MIGMCP-1MIP-1 TNFIFN- IL-2IL-4TNFIL-10IL-6IL-5IL-12p70 IFN- IL-4TNFIL-10IL-6 现有现有CBA Flex Set产品产品树突状细胞树突状细胞（DendriticCell，DC）BD BiosciencesImmune FunctionDC的分化和成熟的分化和成熟DC可分为可分为前体前体DC，未成熟未成熟DC，成熟成熟DCDC起源于骨髓起源于骨髓CD34+多能细胞，多能细胞，在在GM-CSF作用下，进一步分化为作用下，进一步分化为DC前体细胞，包括髓系前体和淋巴系前体，并离开骨髓进入外周血前体细胞，包括髓系前体和淋巴系前体，并离开骨髓进入外周血。在在外周血中至少有两种外周血中至少有两种DC前体被鉴定出来：前体被鉴定出来：PlasmacytoidDCPDC浆细胞样的树突细胞浆细胞样的树突细胞MyeloidDCMDC髓样的树突细胞髓样的树突细胞血液中的前体血液中的前体DC随血液迁移到随血液迁移到皮肤、胃肠道、心、肝、肺等非淋巴器皮肤、胃肠道、心、肝、肺等非淋巴器官发育为未成熟官发育为未成熟DC未成熟未成熟DC摄取外来抗原后，可自发成熟，由外周向次级淋巴器官归巢摄取外来抗原后，可自发成熟，由外周向次级淋巴器官归巢在成熟过程中，在成熟过程中，DC摄取和加工处理外来抗原的能力逐渐减弱，而递呈摄取和加工处理外来抗原的能力逐渐减弱，而递呈抗原的功能逐渐增强抗原的功能逐渐增强BD BiosciencesImmune FunctionAreviewofJacquesBanchereauBD BiosciencesImmune Function树突状细胞的可塑性树突状细胞的可塑性DC在不同细胞因子和生长因子的作用下可以向着不同的方向分化在不同细胞因子和生长因子的作用下可以向着不同的方向分化DC分化过程中的不同刺激引导它们向多种组织和器官移动，在这些分化过程中的不同刺激引导它们向多种组织和器官移动，在这些组织中担当起对抗入侵感染因素的哨兵组织中担当起对抗入侵感染因素的哨兵BD BiosciencesImmune FunctionDC的表面标志的表面标志人人DC的主要特征性表面标志为的主要特征性表面标志为CD1a和和CD83，CD83还是还是DC充分成熟充分成熟的标志。的标志。成熟成熟DC高表达高表达CD80（B7-1），），CD86，CD40和和CD54等共刺激分子，等共刺激分子，而未成熟而未成熟DC不表达或低表达这些分子不表达或低表达这些分子未成熟未成熟DC具有强大的内吞作用，并高表达大多数趋化因子受体具有强大的内吞作用，并高表达大多数趋化因子受体所有所有DC共同的突出特点是能高水平表达共同的突出特点是能高水平表达MHC-II类分子如类分子如HLA-DR，DC成熟过程突出的标志是成熟过程突出的标志是MHC-II类分子的重分布，从主要在细胞浆类分子的重分布，从主要在细胞浆内转变为主要在细胞膜表面。内转变为主要在细胞膜表面。BD BiosciencesImmune Function人外周血人外周血DC亚群的鉴定亚群的鉴定PDC：linnegCD11cnegCD123high；MDC：linnegCD11chighCD123low 二者还都高表达二者还都高表达MHC-（HLA-DR），但都不表达），但都不表达lin（CD3，CD14，CD16，CD19，CD20，CD56）注：注：CD11c：整合素：整合素x链链 CD123：IL-3受体受体链链BD BiosciencesImmune FunctionDC体外诱导分化体外诱导分化BD BiosciencesImmune Function监控监控DC成熟度成熟度BDMulticolorMDDCphenotypingreagentCD209(DC-SIGN)：DC独有标志独有标志CD83：充分成熟标志：充分成熟标志CD86：DC成熟过程中表达增加成熟过程中表达增加BD BiosciencesImmune Function小鼠小鼠DC小鼠小鼠DC的标志是的标志是CD11c，成熟，成熟DC也有也有MHC-和和CD80，CD86的表达的表达小鼠小鼠DC前体主要分为两类：功能上等同于人前体主要分为两类：功能上等同于人MDC和和PDC小鼠小鼠DC制备：小鼠骨髓制备：小鼠骨髓BDIMagMouseDendriticCellEnrichmentSet大鼠大鼠DC：常用标志：常用标志OX62，OX6（MHC-），），CD80，CD86等等细胞凋亡检测细胞凋亡检测BD BiosciencesImmune Function细胞凋亡的分析细胞凋亡的分析细胞凋亡与细胞坏死是两个不同的过程细胞凋亡与细胞坏死是两个不同的过程细胞凋亡的主要检查手段细胞凋亡的主要检查手段形态学检查形态学检查DNALadders实验实验流式细胞仪检查流式细胞仪检查与凋亡相关的病理过程与凋亡相关的病理过程HIV自身免疫性疾病自身免疫性疾病肿瘤肿瘤BD BiosciencesImmune Function细胞凋亡的分析细胞凋亡的分析细胞凋亡的主要表现细胞凋亡的主要表现细胞内水解酶改变：如细胞内水解酶改变：如Caspase-3活化活化细胞膜不对称性改变，磷脂酰丝氨酸外翻，但仍然保持细胞膜不对称性改变，磷脂酰丝氨酸外翻，但仍然保持膜的完整性：膜的完整性：AnnexinV/PI细胞核细胞核DNA的断裂改变：的断裂改变：TUNNEL实验（实验（APO-BRDU，APO-DIRECT）凋亡相关蛋白：凋亡相关蛋白：FasBcl-2BD BiosciencesImmune Function细胞凋亡细胞凋亡PI分析分析PI-Fluorescence#Events凋亡细胞凋亡细胞正常正常G0/G1期细胞期细胞BD BiosciencesImmune Function细胞凋亡细胞凋亡Active Caspases-3BD BiosciencesImmune Function细胞凋亡细胞凋亡Caspases-3BD BiosciencesImmune Function细胞凋亡细胞凋亡Annexin BD BiosciencesImmune Function细胞凋亡细胞凋亡Annexin BD BiosciencesImmune Function凋亡检测（凋亡检测（Annexin V/PIAnnexin V/PI法）法） PIAnnexin V-FITCAnnexin V-FITCBD BiosciencesImmune Function凋亡检测（凋亡检测（BrdUBrdU法）法） BD BiosciencesImmune Function细胞凋亡细胞凋亡BrdU 流式分选流式分选 与与分子生物学研究分子生物学研究BD BiosciencesImmune Function流式分选与分子生物学研究流式分选与分子生物学研究除了将分选得到的细胞进行后续培养研究外，除了将分选得到的细胞进行后续培养研究外，FCMFCM分选系统可为分选系统可为PCRPCR、FISHFISH等分子技术提供纯等分子技术提供纯度较高的特异性细胞群，减少研究中的干扰因度较高的特异性细胞群，减少研究中的干扰因素，获得更准确的实验结果。素，获得更准确的实验结果。BD BiosciencesImmune Function流式与分子生物学流式与分子生物学-FISH 以流式细胞仪分选目的细胞以流式细胞仪分选目的细胞分选后的细胞进行分选后的细胞进行FISHFISH右图显示未分选前混合细胞右图显示未分选前混合细胞较小的较小的PBMCsPBMCs显示有两个红色显示有两个红色斑点斑点( ( X X探针探针) )，较大的，较大的DaudiDaudi细胞显示有一个红色斑点及细胞显示有一个红色斑点及一个绿色斑点一个绿色斑点。BD BiosciencesImmune Function分选后的细胞进行分选后的细胞进行FISHBD BiosciencesImmune Function分选后细胞进行分选后细胞进行PCR分析分析流式流式&干细胞研究干细胞研究SP细胞细胞BD BiosciencesImmune Function为什么要研究干细胞为什么要研究干细胞干细胞替代治疗治疗血液疾病的骨髓移植、脐带血移植比较成熟应用骨髓干细胞移植治疗心肌梗死和血管性疾病 骨髓间充质干细胞等对神经系统疾病、糖尿病的治疗作用已在动物模型中取得一定进展药物筛选利用干细胞的分化潜能体外构建各种组织模型，通过基因修饰等手段研究药物作用靶点，毒理、药理等发育生物学基础理论研究通过gain-of-function和loss-of-function研究基因在分化、发育中的功能借助体细胞核转移技术建立各种疾病的干细胞模型研究疾病成因及治疗途径BD BiosciencesImmune FunctionSP细胞的鉴定和分离细胞的鉴定和分离大部分大部分SP细胞保持原始细胞的细胞保持原始细胞的c-kitSca-1Lin表型。表型。Nakauchi等研究认为，等研究认为，CD34low/c-kitSca-1Lin细胞和细胞和SP细胞有一个很大的交叉，而长期的骨髓造血活性只发现细胞有一个很大的交叉，而长期的骨髓造血活性只发现在在CD34low/c-kitSca-1Lin的细胞。的细胞。SP细胞群缺乏明确的细胞群缺乏明确的Marker，利用流式细胞仪检测其对活，利用流式细胞仪检测其对活细胞染料细胞染料Hoechst33342的染色排斥是目前最准确和推荐的的染色排斥是目前最准确和推荐的鉴定方法，用该染料活染鉴定方法，用该染料活染SP细胞时，经紫外激发表现为细胞时，经紫外激发表现为Hoechst33342双波长荧光阴性或弱阳性的细胞群体，能与双波长荧光阴性或弱阳性的细胞群体，能与非非SP细胞区分。细胞区分。BD BiosciencesImmune FunctionHoechst染色的染色的C57Bl/6小鼠的全骨髓细胞小鼠的全骨髓细胞Hoechst单染单染Hoechst/PI双染双染BD BiosciencesImmune Function流式鉴定小鼠骨髓和流式鉴定小鼠骨髓和CD34富集的人脐血中富集的人脐血中的的SP细胞细胞摘自摘自FlowCytometryProtocols（第二版）（第二版）BD BiosciencesImmune FunctionHoechst 33342染色的小鼠骨髓中染色的小鼠骨髓中SP表型和表型和HSCs表面抗原表达的关系表面抗原表达的关系右图显示的是右图显示的是KLS(c-KitLinSca-1)细胞，可见细胞，可见KLS细胞在细胞在SP区域区域内高度富集内高度富集摘自摘自FlowCytometryProtocols（第二版）（第二版）流式细胞仪的流式细胞仪的其它应用其它应用BD BiosciencesImmune Function酶活力的测定酶活力的测定 BD BiosciencesImmune Function动力学研究动力学研究- - 钙离子检测钙离子检测BD BiosciencesImmune Function流式网络资源流式网络资源=关键词搜索：关键词搜索：FCM，FACS，流式，流式=（中文）（中文）谢谢！谢谢！