1第三章第三章 生物敏感膜的制备技术生物敏感膜的制备技术 2 第一节第一节 生物敏感膜生物敏感膜 敏感膜的构成敏感膜的构成： 膜基体膜基体 膜材料膜材料 生物敏感材料生物敏感材料31、膜基体、膜基体 膜基体是敏感膜的载体，它关系着有效发膜基体是敏感膜的载体，它关系着有效发挥敏感材料的作用和膜的寿命，也即生物传感挥敏感材料的作用和膜的寿命，也即生物传感器的使用寿命。器的使用寿命。 常用的膜基体有：常用的膜基体有：l金属材料金属材料，如铂、金、钯等；，如铂、金、钯等；l半导体材料半导体材料，如石英、玻璃、氮化硅、硅、，如石英、玻璃、氮化硅、硅、锗等；锗等；l有机材料有机材料，如聚氯乙烯、硅橡胶、，如聚氯乙烯、硅橡胶、 纤维素等。纤维素等。42、膜材料膜材料 膜材料是固化敏感材料成膜的物质，是膜材料是固化敏感材料成膜的物质，是敏感材料的支持物。敏感材料的支持物。 它必须它必须具有一定的刚性和具有一定的刚性和韧性，要适合韧性，要适合于敏感材料的搭载与结合；于敏感材料的搭载与结合； 它必须具有化学或物理附着力，以利于它必须具有化学或物理附着力，以利于固化在膜基体上。固化在膜基体上。5膜材料包括有四类：膜材料包括有四类： 有机聚合物类有机聚合物类：如聚氯乙烯、聚苯乙烯、：如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚氟乙烯、葡聚糖、硅橡胶等；聚氟乙烯、葡聚糖、硅橡胶等； 无机物类无机物类: :如多孔玻璃、活性炭、石墨、如多孔玻璃、活性炭、石墨、石英、硫化物、粘土等；石英、硫化物、粘土等； 天然生物材料类：天然生物材料类：如琼脂、动植物细胞如琼脂、动植物细胞膜、卵磷脂等；膜、卵磷脂等； 人工合成的生物材料类：人工合成的生物材料类：如各种两亲有如各种两亲有机化合物构成的双层脂膜，如磷脂。机化合物构成的双层脂膜，如磷脂。63、生物敏感材料生物敏感材料 生物敏感材料是生物传感器的核心，生物敏感材料是生物传感器的核心，有人称它为分子探针。有人称它为分子探针。 常用的生物敏感材料有：酶、微生物常用的生物敏感材料有：酶、微生物( (病毒、细菌病毒、细菌) )、动植物组织、化学和生物发、动植物组织、化学和生物发光物质、抗体和受体、光物质、抗体和受体、DNADNA等生物敏感组分。等生物敏感组分。7具体方式有四种：具体方式有四种： 膜基体膜基体膜材料膜材料敏感材料敏感材料 膜基体膜基体膜材料敏感材料膜材料敏感材料 膜基体（膜材料）膜基体（膜材料） 敏感材料敏感材料 膜基体敏感材料膜基体敏感材料8第二节第二节 生物敏感材料的生物敏感材料的 固定化技术固定化技术 生物敏感膜的制备技术就是将生物生物敏感膜的制备技术就是将生物活性物质进行固定化的技术，它是生物活性物质进行固定化的技术，它是生物传感器研究的重要内容。传感器研究的重要内容。 9 固定化目的：固定化目的： 将生物活性物质限制在一定的空间，将生物活性物质限制在一定的空间，同时不妨碍底物的自由扩散。同时不妨碍底物的自由扩散。 游离相的生物活游离相的生物活性材料性材料固相载体固相载体固相生物活性材料固相生物活性材料（eg：固定化酶）：固定化酶）固定化技术固定化技术11固定化技术应满足：固定化技术应满足： 固化后的生物组分仍能维持良好的生固化后的生物组分仍能维持良好的生物活性；物活性； 固定化层要有良好的稳定性和耐用性，固定化层要有良好的稳定性和耐用性，且能适应多种测试环境；且能适应多种测试环境； 12 生物敏感物质的固定化方法，大致划分为生物敏感物质的固定化方法，大致划分为吸附法、包埋法、夹心法、共价键固定法、吸附法、包埋法、夹心法、共价键固定法、交联法。交联法。 13一、吸附法一、吸附法 吸附法是用非水溶性载体物理吸附吸附法是用非水溶性载体物理吸附或离子结合，使生物组分固定在其表面的或离子结合，使生物组分固定在其表面的方法。方法。 包括：物理吸附包括：物理吸附 离子交换吸附离子交换吸附14物理吸附法物理吸附法 物理吸附法主要通过物理吸附法主要通过范德华力范德华力的作的作用将生物组分吸附在水不溶性的惰性载用将生物组分吸附在水不溶性的惰性载体上。体上。 常用载体有多孔玻璃、活性炭、氧常用载体有多孔玻璃、活性炭、氧化铝、石英砂、纤维素膜、葡聚糖、琼化铝、石英砂、纤维素膜、葡聚糖、琼脂糖等，脂糖等，15优点：优点： 操作简便、条件温和，不会引起生操作简便、条件温和，不会引起生物组分的变性失活，载体廉价易得，而物组分的变性失活，载体廉价易得，而且可反复使用。且可反复使用。缺点：缺点： 对周围环境敏感，结合力弱，生物对周围环境敏感，结合力弱，生物组分容易脱落组分容易脱落。 16（二）离子交换吸附法（二）离子交换吸附法 选用具有离子交换的载体，使生物组选用具有离子交换的载体，使生物组分与离子交换剂通过分与离子交换剂通过离子键离子键结合，形成固结合，形成固定化层。定化层。 常用载体有离子交换树脂、二乙胺乙常用载体有离子交换树脂、二乙胺乙基纤维素、四乙胺乙基纤维素、氨乙基纤基纤维素、四乙胺乙基纤维素、氨乙基纤维素、羧甲基纤维素等。维素、羧甲基纤维素等。 制备的固定化酶有葡萄糖淀粉酶、胆制备的固定化酶有葡萄糖淀粉酶、胆固醇氧化酶等。固醇氧化酶等。离子交换树脂的结构n具有三维空间立体结构的网络骨架具有三维空间立体结构的网络骨架n联接在骨架上的活性基团联接在骨架上的活性基团n活性基团带有可交换的活性离子活性基团带有可交换的活性离子二、夹心法二、夹心法 将生物活性材料封闭在双层滤膜之间。将生物活性材料封闭在双层滤膜之间。特点：特点： 操作简单，不需要任何化学处理，固定操作简单，不需要任何化学处理，固定生物量大，响应速度快，重现性好，尤其适生物量大，响应速度快，重现性好，尤其适用于微生物和组织膜的制作。用于微生物和组织膜的制作。 举例举例微生物膜制备的一般步骤微生物膜制备的一般步骤: : 将微生物培养离心，洗涤，悬浮；将微生物培养离心，洗涤，悬浮； 测定菌体浓度；测定菌体浓度； 取一定量的菌悬液滴到滤膜上；取一定量的菌悬液滴到滤膜上； 将水抽干，使菌体成一薄层均匀附着于膜表面；将水抽干，使菌体成一薄层均匀附着于膜表面； 在菌体层上覆盖一层透气膜或微孔滤膜，让微生在菌体层上覆盖一层透气膜或微孔滤膜，让微生物夹在两层膜之间。物夹在两层膜之间。BODBOD（生化需氧量）微生物传感器结构示意图（生化需氧量）微生物传感器结构示意图 BODBOD微生物传感器的电流响应微生物传感器的电流响应 22三、包埋法三、包埋法 包埋法是将生物组分包埋并固定在包埋法是将生物组分包埋并固定在高分子聚合物三维空间网状结构基质中，高分子聚合物三维空间网状结构基质中，形成稳定生物组分敏感膜。形成稳定生物组分敏感膜。 23优点：优点： 可采用温和的实验条件及多种凝胶聚可采用温和的实验条件及多种凝胶聚合物；合物； 对生物组分的活性影响较小；对生物组分的活性影响较小； 可固定高浓度的生物组分可固定高浓度的生物组分, ,被包埋物不被包埋物不易渗漏等。易渗漏等。24缺点：缺点： 分子量大的底物在凝胶网格内扩散较分子量大的底物在凝胶网格内扩散较困难，响应速度较慢；困难，响应速度较慢； 若载体是合成凝胶，在聚合物形成过若载体是合成凝胶，在聚合物形成过程中对生物组分的活性可能产生影响。程中对生物组分的活性可能产生影响。25包埋法包括三种：包埋法包括三种： 聚合物膜包埋法聚合物膜包埋法 电聚合物膜包埋法电聚合物膜包埋法 溶胶溶胶-凝胶包埋法凝胶包埋法26聚合物膜包埋法聚合物膜包埋法 将生物组分与聚合物单体混合而将生物组分与聚合物单体混合而使生物组分包埋于其中，制备成具有使生物组分包埋于其中，制备成具有生物活性的敏感膜。生物活性的敏感膜。 27电聚合物膜包埋法电聚合物膜包埋法 将聚合物单体和生物活性物质同时混合于将聚合物单体和生物活性物质同时混合于电解液中，通电使单体在电极表面氧化而聚合电解液中，通电使单体在电极表面氧化而聚合成膜，同时将生物活性物质包埋于聚合物膜内，成膜，同时将生物活性物质包埋于聚合物膜内，直接固定于电极表面，构成生物传感器。直接固定于电极表面，构成生物传感器。 28优点：优点： 聚合层厚度和酶量容易控制聚合层厚度和酶量容易控制 修饰层重现性好。修饰层重现性好。29溶胶溶胶-凝胶膜包埋法凝胶膜包埋法溶胶溶胶-凝胶凝胶( (sol-gel)技术技术 指有机或无机化合物经过溶液、指有机或无机化合物经过溶液、溶胶、溶胶、凝胶凝胶而固化，再经过热处理制得氧化物或而固化，再经过热处理制得氧化物或其它化合物固体的方法。其它化合物固体的方法。 30 溶胶（溶胶（Sol）：是）：是具有液体特征的胶体体具有液体特征的胶体体系，分散的粒子是固体或者大分子，系，分散的粒子是固体或者大分子，直径直径在在1-100nm之间。之间。 凝胶（凝胶（Gel）：）：是具有固体特征的胶体体是具有固体特征的胶体体系，被分散的物质形成三维网状结构。系，被分散的物质形成三维网状结构。31溶胶溶胶无固定形状无固定形状粒子自由运动粒子自由运动凝胶凝胶固定形状固定形状粒粒子子按按一一定定网网状状结结构构固定不能自由运动固定不能自由运动溶胶与凝胶的结构比较溶胶与凝胶的结构比较溶胶溶胶- -凝胶的典型例子：凝胶的典型例子：豆浆（豆浆（sol）豆腐（豆腐（gel）33（2 2）溶胶）溶胶凝胶的制备凝胶的制备 金属或半金属醇盐在水、互溶剂（一般为醇）金属或半金属醇盐在水、互溶剂（一般为醇）及催化剂（酸或碱）发生及催化剂（酸或碱）发生水解反应水解反应，形成羟基化，形成羟基化的产物和相应的醇。的产物和相应的醇。 未羟基化的烷氧基与羟基或两羟基间发生缩未羟基化的烷氧基与羟基或两羟基间发生缩合形成胶体状的混合物，即合形成胶体状的混合物，即溶胶溶胶，水解和缩合过，水解和缩合过程同时进行；程同时进行； 最后胶粒间发生聚合、交联，使溶胶黏度逐最后胶粒间发生聚合、交联，使溶胶黏度逐渐增大，形成渐增大，形成凝胶凝胶。34 35 硅烷聚合物凝胶的立体构造硅烷聚合物凝胶的立体构造 37 图图 溶胶溶胶-凝胶法包埋活性分子的过程凝胶法包埋活性分子的过程 溶胶溶胶凝胶法包埋生物活性分子通常只是物理凝胶法包埋生物活性分子通常只是物理结合过程。结合过程。a)a)溶胶溶液溶胶溶液b)b)将活性分子加入溶胶溶液将活性分子加入溶胶溶液c)c)凝胶开始形成凝胶开始形成d)d)活性分子被包埋在凝胶中。活性分子被包埋在凝胶中。 38（3 3）溶胶）溶胶凝胶法的特点凝胶法的特点光学透光性强；光学透光性强；无电化学降解，具有导电性且易控制；无电化学降解，具有导电性且易控制；热稳定性好，具有化学惰性；热稳定性好，具有化学惰性；具有一定的刚性；具有一定的刚性；有足够的水，为生物组分提供水溶液的微有足够的水，为生物组分提供水溶液的微环境；环境；能均匀地掺入生物组分，实现分子水平上能均匀地掺入生物组分，实现分子水平上的均匀掺杂。的均匀掺杂。39四、共价键固定法四、共价键固定法 将生物组分通过共价键与不溶性载体将生物组分通过共价键与不溶性载体（转换器探头）结合而固定的方法称共价键（转换器探头）结合而固定的方法称共价键固定法，或称载体结合法。固定法，或称载体结合法。包括包括3 3个步骤：个步骤： 基底电极表面的基底电极表面的活化活化 生物分子的生物分子的偶联偶联 剩余价键的剩余价键的封闭封闭及除去键合疏松的组分。及除去键合疏松的组分。载体修饰需满足：载体修饰需满足： 化学连接稳定化学连接稳定 连接长度足够长，减小固相表面的空间位阻连接长度足够长，减小固相表面的空间位阻 不产生非特异性结合不产生非特异性结合41 (1)(1)直接化学固定法直接化学固定法 将基体表面先经过化学处理或修饰，将基体表面先经过化学处理或修饰，然后将生物功能物质以共价、离子或配位然后将生物功能物质以共价、离子或配位等方式结合固定于电极表面。等方式结合固定于电极表面。 42（2 2）硅烷化）硅烷化- -双功能基团试剂偶联法双功能基团试剂偶联法 采用硅烷化试剂修饰采用硅烷化试剂修饰基体表面，使其基体表面，使其带上氨基或羟基，然后用双功能偶联剂带上氨基或羟基，然后用双功能偶联剂（如戊二醛）与生物活性分子相结合而使（如戊二醛）与生物活性分子相结合而使生物组分固定的方法。生物组分固定的方法。43硅烷化硅烷化双功能基团试剂偶联法双功能基团试剂偶联法44自组装自组装（Self assembling，SA）膜法膜法 基于分子的自组装作用，在固体表基于分子的自组装作用，在固体表面上自然地形成高度有序的单分子层的面上自然地形成高度有序的单分子层的方法。方法。 有些分子通过化学键相互作用能自有些分子通过化学键相互作用能自发吸附在固发吸附在固/ /液和固液和固/ /气表面，形成热力气表面，形成热力学稳定和能量最低的有序膜。学稳定和能量最低的有序膜。 发生自组装的条件：发生自组装的条件： 动力动力：提供能量：提供能量 导向作用导向作用：分子在空间的大小和方向上达：分子在空间的大小和方向上达到分子重新排列的要求，从无序到有序的重新到分子重新排列的要求，从无序到有序的重新重组。重组。自组装单层膜的形成示意图自组装单层膜的形成示意图46自组装膜的类型：自组装膜的类型： 脂肪酸在金属氧化物表面脂肪酸在金属氧化物表面 有机硅烷在羟基化有机硅烷在羟基化表面表面(Si0(Si02 2SiSi、A1A12 2O O3 3AlAl、玻璃等、玻璃等) ) 硫醇、二硫化物和硫化物在金属（金、硫醇、二硫化物和硫化物在金属（金、银、铜）表面或半导体表面银、铜）表面或半导体表面 47自组装膜的结构：自组装膜的结构： 头基：与基底表面上的反应以共价键头基：与基底表面上的反应以共价键或离子键结合。或离子键结合。 烷基链：表面活性物质在固体表面有烷基链：表面活性物质在固体表面有序紧密地排列。序紧密地排列。 末端基团：如末端基团：如-CH-CH3 3，-COOH,-OH,-COOH,-OH,-NH-NH2 2，-SH-SH。载体活化的方法载体活化的方法48n重氮法重氮法n叠氮法叠氮法n溴化氰法溴化氰法n缩合法缩合法n烷基化法烷基化法49(1)(1)重氮法重氮法 芳香族伯胺芳香族伯胺和亚硝酸作用（在强酸介和亚硝酸作用（在强酸介质下）生成重氮盐的反应称为重氮化。质下）生成重氮盐的反应称为重氮化。 重氮基再与酶分子中的重氮基再与酶分子中的 -NH-NH2 2、-OH-OH、- -SHSH、咪唑基等发生重氮偶联反应，从而制、咪唑基等发生重氮偶联反应，从而制成固定化酶。成固定化酶。 51对纤维素等多糖类不溶性载体对纤维素等多糖类不溶性载体, ,可利用于可利用于硫酸酯乙砜基苯胺硫酸酯乙砜基苯胺(SESA)(SESA)，一端与纤维素，一端与纤维素上的羟基进行醚化，另一端上的上的羟基进行醚化，另一端上的-NH-NH2 2，经，经NaNONaNO2 2与与HClHCl重氮化，重氮基再与酶偶联。重氮化，重氮基再与酶偶联。 53（2）叠氮法叠氮法 将含将含羧基羧基的不溶性载体的不溶性载体( (如羧甲基纤维如羧甲基纤维素、胶原蛋白等素、胶原蛋白等) )进行甲酯化，再与肼基进行甲酯化，再与肼基作用生成含有酰肼基团的载体，再与亚硝作用生成含有酰肼基团的载体，再与亚硝酸活化，生成叠氮化合物酸活化，生成叠氮化合物, , 最后与酶上的最后与酶上的-NH-NH2 2偶联。偶联。55(3)(3)溴化氢法溴化氢法 将具有将具有-OH-OH的不溶性载体，首先用的不溶性载体，首先用CNBrCNBr活化，形成具有活性的亚胺碳酸衍生活化，形成具有活性的亚胺碳酸衍生物，再与酶上的物，再与酶上的-NH-NH2 2偶联。偶联。 56(4)(4)缩合法（肽键法）缩合法（肽键法） 酶的酶的-NH-NH2 2或或-COOH-COOH与载体的与载体的-COOH-COOH或或-NH-NH2 2形成肽键，从而制得固定化酶。形成肽键，从而制得固定化酶。58(5)(5)烷基化法烷基化法 使酶分子中使酶分子中-NH-NH2 2、-SH-SH、酚基与、酚基与不溶性载体上的卤素或乙烯磺酰基发不溶性载体上的卤素或乙烯磺酰基发生反应，制成固定化酶；也可以使聚生反应，制成固定化酶；也可以使聚酰胺类化合物先经硫酸二甲酯烷基化酰胺类化合物先经硫酸二甲酯烷基化后，烷氧基再与酶中的后，烷氧基再与酶中的-NH-NH2 2、-SH-SH、酚基等作用，制备固定化酶。酚基等作用，制备固定化酶。 n含羟基的载体可用卤代物进行活化，形成含羟基的载体可用卤代物进行活化，形成含有卤素基团的活化载体。含有卤素基团的活化载体。60交联共聚法交联共聚法 借助于交联剂借助于交联剂( (具有两个或两个以上具有两个或两个以上功能基的试剂功能基的试剂) )的作用，使酶分子间发生的作用，使酶分子间发生共价结合，形成不溶性网状结构的固相酶，共价结合，形成不溶性网状结构的固相酶，也可将酶分子直接与载体共价交联。也可将酶分子直接与载体共价交联。 61 共价键结合法的特点是结合牢固，共价键结合法的特点是结合牢固，蛋白质分子不易脱落，载体不易被生蛋白质分子不易脱落，载体不易被生物降解，使用寿命长。物降解，使用寿命长。 缺点是操作步骤比较麻烦，酶活缺点是操作步骤比较麻烦，酶活性可能因为发生化学修饰而降低，制性可能因为发生化学修饰而降低，制备具有高活性的固定化酶比较困难。备具有高活性的固定化酶比较困难。62尼龙网酶膜的制备：尼龙网酶膜的制备：1）活化尼龙网活化尼龙网 在硫酸二甲酯中煮在硫酸二甲酯中煮沸沸5分钟；分钟；2）洗涤洗涤 移入无水甲醇移入无水甲醇3）连接氨基连接氨基 转移到赖氨酸溶液中反转移到赖氨酸溶液中反应应2h，用，用NaCl清洗；清洗；4）加交联剂加交联剂 戊二醛；戊二醛；5）与酶交联与酶交联。63五、五、LB(Langmuir-Blodgett)LB(Langmuir-Blodgett)膜法膜法（一）（一）LBLB膜膜 把液面上有序排列的有机化合物逐层把液面上有序排列的有机化合物逐层地转移到固定基片上，在分子水平上制造地转移到固定基片上，在分子水平上制造出按有序排列的分子组合体，成为单分子出按有序排列的分子组合体，成为单分子层或几个多分子层的修饰薄膜。层或几个多分子层的修饰薄膜。 64（二）（二）LBLB膜的特点膜的特点 1. 1.膜厚度可精确控制，可精确到纳米级；膜厚度可精确控制，可精确到纳米级； 2. 2.膜内分子排列有序而致密，均一性好；膜内分子排列有序而致密，均一性好； 3. 3.脂质双层膜同生物膜结果相似，是理想的脂质双层膜同生物膜结果相似，是理想的仿生膜，具有极佳的生物相容性；仿生膜，具有极佳的生物相容性； 4. 4.可把活性物质固定在可把活性物质固定在LBLB膜的预定位置，制膜的预定位置，制成具有特殊功能的生物传感器。成具有特殊功能的生物传感器。制备LB膜的装置示意图 （三）（三）LBLB膜的制备过程及制备方式膜的制备过程及制备方式制膜过程示意图67 按照转移（挂膜）式电极表面相对于水按照转移（挂膜）式电极表面相对于水面的相对运动方向，可将面的相对运动方向，可将LBLB膜的制备分为膜的制备分为X,YX,Y和和Z Z三种方式。三种方式。 68X X法：将电极表面垂直于水面向下插入挂膜，使法：将电极表面垂直于水面向下插入挂膜，使 成膜分子的疏水端指向电极。成膜分子的疏水端指向电极。 69Y Y法：将电极上下作往返运动挂膜，使各层分子法：将电极上下作往返运动挂膜，使各层分子的亲水端和疏水端依次交替指向电极。的亲水端和疏水端依次交替指向电极。 7071Z Z法：将电极从水下提出挂膜，使成膜分子的亲水法：将电极从水下提出挂膜，使成膜分子的亲水 端指向电极。端指向电极。 72（四）（四）LBLB酶膜的制作过程酶膜的制作过程 若把酶溶于水中，在水面上展开的若把酶溶于水中，在水面上展开的脂质单分子膜将吸引水中的酶分子，沿脂质单分子膜将吸引水中的酶分子，沿水平面对其表面积的压缩会使单位面积水平面对其表面积的压缩会使单位面积上的酶密度增加，然后经过挂膜，随着上的酶密度增加，然后经过挂膜，随着LBLB膜在电极上的沉积，酶就被固定在电膜在电极上的沉积，酶就被固定在电极表面上。极表面上。73LBLB酶膜的制作过程酶膜的制作过程74（五）单层、多层和混合型（五）单层、多层和混合型LBLB膜修饰电极膜修饰电极 若在电极表面挂一单分子层膜，表现出准若在电极表面挂一单分子层膜，表现出准二维特性，称单分子层二维特性，称单分子层LBLB膜修饰电极；膜修饰电极； 将相同或不同的成膜分子在电极表面重复将相同或不同的成膜分子在电极表面重复挂膜积叠成多层膜，具有三维的超结构，称多挂膜积叠成多层膜，具有三维的超结构，称多分子层分子层LBLB膜修饰电极；膜修饰电极； 将两种或两种以上的不同分子按一定比例将两种或两种以上的不同分子按一定比例混合后形成混合后形成LBLB膜，再挂在电极上称混合型膜，再挂在电极上称混合型LBLB膜膜修饰电极。修饰电极。75 用用LBLB膜制成的敏感器件响应时间快且灵膜制成的敏感器件响应时间快且灵敏度高，光电转换效率也高，所以特别适合敏度高，光电转换效率也高，所以特别适合于制备化学、生物或仿生传感器件用于分子于制备化学、生物或仿生传感器件用于分子识别。识别。 LBLB膜法已成功地用于发展仿生传感器、膜法已成功地用于发展仿生传感器、酶、免疫等生物传感器。酶、免疫等生物传感器。 76思考题：思考题：1. 1. 什么是什么是LBLB膜，膜，LBLB膜的制备方式有哪些？膜的制备方式有哪些？