过氧化物酶同工酶的提取、分离过氧化物酶同工酶的提取、分离实实 验验 四四学时：学时：9 91 1、掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理和方法；、掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理和方法；2 2、掌握过氧化物酶掌握过氧化物酶(POD)(POD)活性测定的原理及方法。活性测定的原理及方法。3 3、了解过氧化物酶、了解过氧化物酶(POD)(POD)的生物学功能。的生物学功能。 一、实验一、实验目的目的： 1 1、过氧化物酶：、过氧化物酶：过过氧氧化化物物酶酶广广泛泛存存在在于于植植物物体体中中，是是活活性性较较高高的的一一种种酶酶。它它与与呼呼吸吸作作用用、光光合合作作用用及及生生长长素素的的氧氧化化等等都都有有关关系系。在在植植物物生生长长发发育育过过程程中中它它的的活活性性不不断断发发生生变变化化。一一般般老老化化组组织织中中活活性性较较高高，幼幼嫩嫩组组织织中中活活性性较较弱弱。这这是是因因为为过过氧氧化化物物酶酶能能使使组组织织中中所所含含的的某某些些碳碳水水化化合合物物转转化化成成木木质质素素，增增加加木木质质化化程程度度，而而且且发发现现早早衰衰减减产产的的水水稻稻根根系系中中过过氧氧化化物物酶酶的的活活性性增增加加，所所以以过过氧氧化化物物酶酶可可作作为为组组织织老老化化的的一一种种生生理理指指标标。此此外外，过过氧氧化化物物同同工工酶酶在在遗遗传传育育种种中中的的重重要要作作用用也也正正在在受到重视。受到重视。二、实验原理二、实验原理: : 2 2、同工酶概念：、同工酶概念： 同同工工酶酶指指催催化化同同一一种种化化学学反反应应，但但其其酶酶蛋蛋白白本本身身的的分分子子结构组成却有所不同的一组酶。结构组成却有所不同的一组酶。 同同工工酶酶与与生生物物的的遗遗传传，生生长长发发育育，代代谢谢调调节节及及抗抗性性等等都都有有一一定定的的关关系系，如如PODPOD在在细细胞胞代代谢谢过过程程中中与与呼呼吸吸作作用用，光光合合作作用用，及及生生长长素素的的氧氧化化等等都都有有关关系系，测测定定PODPOD活活性性或或其其同同工酶，可以反映某一时期植物体内代谢变化工酶，可以反映某一时期植物体内代谢变化。二、实验原理二、实验原理: :(1)(1)定义：定义：是指带电粒子在电场中向与其自身所带电荷是指带电粒子在电场中向与其自身所带电荷相反的电极方向移动的现象。相反的电极方向移动的现象。(2)(2)影响电泳效果的因素：影响电泳效果的因素：带电颗粒的大小和形状：带电颗粒的大小和形状：颗粒越大，电泳速度越慢，反之越快；颗粒越大，电泳速度越慢，反之越快；颗粒的电荷数：颗粒的电荷数：电荷越少，电泳速度越慢，反之越快；电荷越少，电泳速度越慢，反之越快；溶液的粘度：溶液的粘度：粘度越大，电泳速度越慢，反之越快；粘度越大，电泳速度越慢，反之越快；3 3、电泳：、电泳： 溶液的溶液的pHpH值：值：影响被分离物质的解离度，离等电点越近，电泳速度越慢，影响被分离物质的解离度，离等电点越近，电泳速度越慢，反之越快；反之越快；电场强度：电场强度： 电场强度越小，电泳速度越慢，反之越快；电场强度越小，电泳速度越慢，反之越快；离子强度：离子强度： 离子强度越大，电泳速度越慢，反之越快；离子强度越大，电泳速度越慢，反之越快；电渗现象：电渗现象： 电场中，液体相对于固体支持物的相对移动；电场中，液体相对于固体支持物的相对移动；支持物筛孔大小：支持物筛孔大小： 孔径小，电泳速度慢，反之则快。孔径小，电泳速度慢，反之则快。 续续(2)(2)影响电泳效果的因素影响电泳效果的因素：聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶电电泳泳是是以以聚聚丙丙烯烯胺胺凝凝胶胶作作为载体的一种为载体的一种区带电泳区带电泳。4 4、聚丙烯酰胺凝胶电泳（、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGEPAGE）聚聚丙丙烯烯胺胺凝凝胶胶由由丙丙烯烯酰酰胺胺单单体体（AcrAcr）和和N N，N-N-甲甲叉叉双双丙丙烯烯酰酰胺胺（BisBis）在在催催化化剂剂作作用用下下聚聚合合而而成成。在在具具有有自由基自由基时，时，AcrAcr和和BisBis就会聚合。就会聚合。 引发产生自由基的方法有两种：引发产生自由基的方法有两种： 化学法化学法 光聚合法光聚合法 (1)聚丙烯胺凝胶的生成：聚丙烯胺凝胶的生成：化学聚合：化学聚合： 引引发发剂剂是是过过硫硫酸酸铵铵( (APAP) )，催催化化剂剂N N、N N、NN、NN四四甲甲基基乙乙二二胺胺（TEMEDTEMED），它它的的碱碱基基催催化化APAP产产生生氧氧自自由由基基，激激活活单单体体形形成成自自由由基基，发发生生聚聚合合。化化学学聚聚合合形形成成的的凝凝胶胶孔孔径较小，且重复性好，用来制备径较小，且重复性好，用来制备分离胶分离胶；光聚合：光聚合： 催催化化剂剂是是核核黄黄素素（VBVB2 2），在在痕痕量量氧氧存存在在下下，核核黄黄素素光光解解形形成成无无色色基基，无无色色基基再再被被氧氧氧氧化化成成自自由由基基，激激活活单单体体发发生生聚聚合合。光光聚聚合合形形成成的的凝凝胶胶孔孔径径较较大大，且且不不稳稳定定，适适于于制制备大孔径的备大孔径的浓缩胶浓缩胶。 聚合反应：架桥物造成分枝端点自由基 可再延续freeradicalBisBis聚合反应交错连结自由基形成聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺的的基基本本结结构构为为丙丙烯烯酰酰胺胺单单体体构构成成的的长长链，链与链之间通过甲叉桥联结在一起；链，链与链之间通过甲叉桥联结在一起；链链的的纵纵横横交交错错形形成成三三维维网网状状结结构构，使使凝凝胶胶具具有有分分子筛的性质；子筛的性质；网网状状结结构构还还能能限限制制蛋蛋白白质质等等样样品品的的扩扩散散运运动动，使使凝胶具有抗对流的作用；凝胶具有抗对流的作用；长链富含酰胺基团，使其成为稳定的亲水凝胶；长链富含酰胺基团，使其成为稳定的亲水凝胶；该结构不带电荷，在电场中电渗现象极为微小。该结构不带电荷，在电场中电渗现象极为微小。(2)(2)聚丙烯酰胺凝胶结构上的特点：聚丙烯酰胺凝胶结构上的特点：（1 1）凝胶度：）凝胶度： 是指是指100mg100mg凝胶溶液中含有单体（凝胶溶液中含有单体（AcrAcr）和交联剂和交联剂 （BisBis）的总克数，用的总克数，用T%T%表示。表示。（2 2）交联度：）交联度： 是指凝胶溶液中，交联剂占单体和交联剂总量的是指凝胶溶液中，交联剂占单体和交联剂总量的 百分数，用百分数，用C%C%表示。表示。 一般浓缩胶的浓度为一般浓缩胶的浓度为7.5%7.5%，分离胶的浓度为，分离胶的浓度为10%10%。 (3)(3)凝胶的质量决定因素：凝胶的质量决定因素： 聚丙烯酰胺凝胶的强度、弹性、透明度、粘度和孔径大小均取决于两个重要参数T(总百分浓度)和C(交联百分浓度)。 上式中：a为丙烯酰胺的克数，b为甲叉双丙烯酰胺的克数，m为缓冲液体积（ml）。 当C保持恒定时，凝胶的有效孔径随着T的增加而减小，当T保持恒定，C为4时，有效孔径最小，C大于或小于4时，有效孔径均变大，C大于5时凝胶变脆，不宜使用，实验中最常用的C是2.6和3 。 a与b的比例很重要。富有弹性，且完全透明的凝胶，a与b的重量比应在30左右。常用29 ： 1第一、三个不连续性：第一、三个不连续性： 凝胶孔径的不连续；凝胶孔径的不连续； 缓冲液离子组成及各层凝胶缓冲液离子组成及各层凝胶pHpH的不连续；的不连续； 在电场中形成的电位梯度的不连续。在电场中形成的电位梯度的不连续。第二、不连续系统中的三种物理效应：第二、不连续系统中的三种物理效应： 电荷效应：电荷效应： 分子筛效应分子筛效应: : 浓缩效应浓缩效应: : (4)(4)不连续不连续PAGEPAGE的原理：的原理：不连续PAGE电泳胶体系统的组成：1电泳系统pH胶体浓度缓冲液上层 (负极) 缓冲液 2样本溶液 3浓缩胶 6.7 4分离胶 胶体 5下层 (正极)缓冲液 Tris-HClTris-HClTris-glycine Tris-glycine Tris-glycine 8.3 8.3 8.9 8.3 5% 7% - - - 在浓缩胶中的三个主要作用角色：甘氨酸: pH=8.9 负电荷 pI=6.7 不带电荷Cl-1:蛋白质蛋白质(酶酶):小分子大分子 浓缩效应浓缩效应：分离胶浓缩胶样本8.96.7离子缺乏空间ABC+8.0v以邻甲氧基苯酚（即愈创木酚）为过氧化物酶的底物，以邻甲氧基苯酚（即愈创木酚）为过氧化物酶的底物，在此酶存在下，在此酶存在下，H H2 2O O2 2可将邻甲氧基苯酚氧化成红棕色可将邻甲氧基苯酚氧化成红棕色的的4-4-邻甲氧基苯酚，其反应为：邻甲氧基苯酚，其反应为：v该红棕色的物质可用分光光度计在该红棕色的物质可用分光光度计在470nm470nm处测定其消光值，处测定其消光值，即可求出该酶的活性。即可求出该酶的活性。5、过氧化物酶活性测定过氧化物酶活性测定三、实验材料、主要仪器和试剂三、实验材料、主要仪器和试剂v1材料：小麦幼苗材料：小麦幼苗v2仪器：仪器：（1）分光光度计；）分光光度计；（2）移液管）移液管（3）离心机（）离心机（4000r/min）；）；（4）研钵）研钵 (5)(5)垂直板电泳装置（电泳槽，玻璃板，胶条，电泳梳子，制胶架等）；垂直板电泳装置（电泳槽，玻璃板，胶条，电泳梳子，制胶架等）； (6)(6)稳流稳压电泳仪；稳流稳压电泳仪； （7 7）高速冷冻离心机；）高速冷冻离心机； （8 8）电子天平；）电子天平； （9 9）电冰箱；）电冰箱； （1010）瓷盘、微量进样器；）瓷盘、微量进样器； （1111）电热恒温水浴锅；）电热恒温水浴锅； （1212） S-22pCS-22pC可见分光光度计；（可见分光光度计；（1313）电炉等）电炉等3、试剂：试剂： （1 1）1N 1N HClHCl：用用12N12N的浓盐酸来配制；的浓盐酸来配制； （2 2）分离胶缓冲液（）分离胶缓冲液（pH8.9pH8.9的的Tris-HClTris-HCl缓冲液）：缓冲液）： （3 3）浓缩胶缓冲液（浓缩胶缓冲液（pH6.7 pH6.7 Tris-HClTris-HCl缓冲液）：缓冲液）： （4 4）分离胶丙胶贮液（分离胶丙胶贮液（Acr-BisAcr-Bis贮液贮液）：）： （5 5）浓缩胶丙胶贮液（）浓缩胶丙胶贮液（Acr-BisAcr-Bis贮液贮液）：）： （6 6）过硫酸铵溶液（过硫酸铵溶液（NH4NH4）2S2O82S2O8简写简写ApAp：（：（当天配制）；当天配制）； （7 7）核黄素溶液：）核黄素溶液：8%8% （8 8）电极缓冲液：（电极缓冲液：（pH8.3Tris-pH8.3Tris-甘氨酸缓冲液）甘氨酸缓冲液） （9 9）40%40%蔗糖：蔗糖： （1010）pH4.7pH4.7乙酸缓冲液乙酸缓冲液： （1111）样品提取液：样品提取液： （1212）0.5%0.5%的溴酚蓝：的溴酚蓝：0.5g0.5g溶于溶于100ml100ml无离子水；无离子水； （1313）过氧化物酶同工酶联苯胺染色液：）过氧化物酶同工酶联苯胺染色液： 1g1g联联苯苯胺胺加加9ml9ml冰冰醋醋酸酸，溶溶解解后后加加36ml36ml水水用用时时加加160ml160ml水水加加Vc140.8mgVc140.8mg加加几几滴滴30%30%过过氧氧化化氢氢原原液液。联联苯苯胺胺是是致致癌癌物物质质，称取时应戴手套；称取时应戴手套； （1414）0.05M pH5.50.05M pH5.5磷酸缓冲溶液；磷酸缓冲溶液； （1515）0.05M 0.05M 愈创木酚；愈创木酚； （1616）2%H2%H2 2O O2 2 ； 1 1、贮液的配制：贮液的配制： 2 2、凝胶的制备：凝胶的制备： 2.12.1 胶板的制备：胶板的制备： 2.22.2 分离胶的制备：分离胶的制备： 2.32.3 浓缩胶的制备：浓缩胶的制备： 3 3、酶液的制备：酶液的制备： 4 4、装槽装槽、点样：点样： 5 5、电泳：电泳： 6 6、剥胶、固定、染色：剥胶、固定、染色：四、实验步骤：四、实验步骤： 2.1 2.1 胶板的制备：胶板的制备： 2.2 2.2 分离胶的制备：分离胶的制备： 按下表制备分离胶按下表制备分离胶试剂名称试剂名称分离胶缓分离胶缓冲液冲液分离胶丙分离胶丙胶贮液胶贮液ApAp无离子水无离子水体积比体积比1 12 24 41 1取用量取用量（mlml）3 36 612123 3 胶灌至距梳子齿下端胶灌至距梳子齿下端1cm1cm 灌毕灌毕封上一层水加速聚封上一层水加速聚合合当胶与水出现清晰界限时表明聚合好。当胶与水出现清晰界限时表明聚合好。 2.3 2.3 浓缩胶的制备：浓缩胶的制备： 按下表制备浓缩胶按下表制备浓缩胶 试剂名称试剂名称 浓缩胶缓浓缩胶缓冲液冲液浓缩胶丙胶浓缩胶丙胶贮液贮液ApAp蔗糖蔗糖体积比体积比1 12 22 22 2取用量取用量1 12 22 22 2 用滤纸吸干水用滤纸吸干水倒入浓缩胶倒入浓缩胶插入梳子插入梳子封水，封水，照光照光当胶色由黄变为乳白色表明聚合好。当胶色由黄变为乳白色表明聚合好。3 3、酶液的制备：、酶液的制备： 称称取取大大麦麦幼幼苗苗茎茎部部1g 1g 加加样样品品提提取取液液1ml 1ml 于于冰冰浴浴中中研研成成匀匀浆浆然然后后以以2ml2ml提提取取液液分分几几次次洗洗入入离离心心管管在在高高速速离离心心机机上上以以40004000转转/ /每每分分钟钟，离离心心10min 10min 倒倒出出上上清清液液，以以等等量量40%40%蔗蔗糖糖混混合合低低温温放置待用。放置待用。4.1 4.1 装槽：装槽： 取取出出胶胶板板下下端端胶胶条条用用滤滤纸纸擦擦净净凡凡士士林林油油将将胶胶板板固固定定在在电电泳泳槽槽上上（凹凹板板一一侧侧向向内内） 上下槽装电极缓冲液。上下槽装电极缓冲液。4.2 4.2 点样：点样： 轻拔电泳梳子轻拔电泳梳子用微量进样器点样用微量进样器点样每孔约每孔约30l30l。5 5、电泳：、电泳： 接接通通电电源源稳稳流流调调节节电电流流到到每每孔孔1mA1mA左左右右当当溴溴酚酚蓝蓝前前沿沿进进入入分分离离胶胶后后，可可适适当当加加大大电电流流待待前前沿沿下下行行到到距距胶胶末末1cm1cm处处，停止电泳。停止电泳。 6 6、剥胶、固定、染色：、剥胶、固定、染色： 将将凝凝胶胶板板取取下下放放入入装装水水瓷瓷盘盘中中剥剥下下胶胶片片并并浸浸洗洗二二次次倒倒去去水水加加入入固固定定液液1010分分钟钟倒倒去去固固定定液液加加显显色色液液（联联苯苯胺），显色胺），显色观察记录。观察记录。 绘制酶谱，计算出迁移率；绘制酶谱，计算出迁移率；五、结果与计算：五、结果与计算：六、思考题：六、思考题： 1 1、影响电泳的主要因素有哪些？、影响电泳的主要因素有哪些？ 2 2、简答不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳中的三个、简答不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳中的三个 不连续，及三种物理效应。不连续，及三种物理效应。