感染性疾病标志物及快速诊断感染性疾病标志物及快速诊断技术技术概 述1.感染性疾病：由某种病原体所致，通过不同方式引起人体发生感染并出现临床症状的疾病,主要表现为发热。 2.病原体：细菌（含TB）、真菌、支原体、衣原体、病毒、原虫等感染的诊断依据临床表现：感染的全身中毒症状： 畏寒、发热、皮疹等实验室常规检查：血常规：WBC、DC影像学检查：X-RAY、B超病原学检查：染色、培养血清学检查：抗原或抗体检测危重病人：临床表现、危重病人：临床表现、WBC+DC不典型不典型感染的分类按病原学分类：1.细菌感染（包括结核）2.真菌感染3.病毒感染4.支原体、衣原体按部位分类：1.局部感染2.全身感染临床希望第一时间知道的信息感染或非感染细菌感染或非细菌感染结核感染或普通细菌感染酵母样真菌感染或丝状真菌感染白色假丝酵母或其他念珠菌感染曲菌感染或毛霉菌感染因为上述感染治疗方法不同一、免疫学方法一、免疫学方法（一）降钙素原降钙素原是正常人血清中存在的含116个氨基酸组成的糖蛋白，最初由甲状腺细胞产生，血清水平很低。在非感染或病毒性感染疾病时保持非常低的血清水平，在细菌性感染时含量升高，并与感染程度和预后呈正相关。 PCT含量的变化稳定，并出现在疾病的早期（3-4h）。短半衰期(24h)国外把 PCT作为最敏感的感染标志。降钙素原 PCT : 分子结构血清降钙素(CT)的前肽物质分子量：14.5 kDa由116个氨基酸组成的糖蛋白质无激素活性11 11号染色体上号染色体上的单拷贝基因的单拷贝基因转录转录甲状腺滤泡细胞甲状腺滤泡细胞降钙素原前降钙素原前体体内源多肽酶内源多肽酶降钙素原降钙素原 PCTPCT分解分解细胞内特殊细胞内特殊蛋白酶蛋白酶正常情况下正常情况下正常情况下正常情况下降降钙钙素素LinscheidLinscheid P, et al P, et al CritCrit Care Med 04; 32: 1715-21 Care Med 04; 32: 1715-21Endocrinology 03; 144: 5578-84 & 05; 146: 2699-708Endocrinology 03; 144: 5578-84 & 05; 146: 2699-708 在病毒感染时，大量产生的IFN-，将会抑制PCT的激活及产生.因此，病毒感染时，PCT的浓度将会保持在较低的水平Bacterial InfectionBacterial Infection(e.g.Endotoxin(e.g.Endotoxin) )IL-6IL-6IL-6IL-6细菌感染后PCT快速升高KineticsofprocalcitonininiatrogenicsepsisBrunkhorstF.Metal,IntensCareMed1998,24:888-892PCT来源Left Lane:正常组, 在不存在感染的情况下，甲状腺外CT表达被抑制，而主要局限于甲状腺和肺的神经内分泌细胞有一定程度的表达Right Lane: 脓毒症组,在细菌感染时可诱导全身各种组织多种类型细胞CT表达和PCT连续性释放PCT动力学2-3h开始增加； 6-8h快速升高；12h-48到达峰值； 2-3d 正常血浆浓度在0.05ng/ml-1000ng/ml半衰为15-20h左右,且不受肾功能影响PCT检测方法快速半定量法（PCT-Q）全自动快速定量法（VIDAS)快速半定量法（PCT-Q）样本：样本：200200l l血清血清/ /血浆血浆结果：结果：30min30min同胶体金免疫层析法，即在标准品上结合有胶体金的小鼠单克隆抗降钙素抗体和绵羊多克隆抗降钙素抗体，待检标本加上后，示踪元素即与标本中的PCT结合，形成一个“三明治式”的复合物，然后通过发光比色判断PCT浓度当PCT浓度0.5g/ml时，夹心复合物呈红色带，颜色深浅与样品中的PCT浓度成正比例，未结合的示踪物扩散到对照区，结合并产生了红色的对照带。 全自动快速定量法酶联荧光法、化学发光法标本要求：静脉抗凝血注意无菌操作，使用新鲜标本，如果4小时内不使用，应将标本放置-20保存。血浆中的PCT非常稳定，收集标本24h后，PCT浓度在室温下大约下降12，在4大约下降6 PCT临床意义细菌感染/脓毒症诊断及严重程度判断 脓毒症治疗效果监测及预后评估 抗生素的有效管理细菌感染诊断及严重程度判断脓毒性休克严重脓毒症系统性感染(脓毒症)局部感染正常值 PCT的浓度随感染的扩散和感染严重程度的加重而升高脓毒症患者治疗效果及预后监测(n=109)F. Stber, University Bonn, Lecture at ISICEM, Brussels 2001通过PCT不断在体内衰减，反映出抗生素治疗策略的成功随着患者对抗生素治疗的响应，引起了PCT血中浓度水平的典型变化过程AB-antibioticsAB-antibiotics抗生素有效管理抗生素有效管理PCT浓度（ng/ml）临床意义0.05无细菌感染0.05-0.1非细菌感染0.1-0.25可能是局部细菌感染，不建议使用抗生素，6-24小时内复查0.25-0.5局部细菌感染，建议使用抗生素0.5-2.0严重细菌感染、脓毒症2.0-10.0重症脓毒症10.0 重度脓毒症、脓毒性休克或MODSPCT的临床应用急诊住院病房外科手术血液科内科ICU外科ICU儿科急诊儿科病房儿科ICU新生儿科严重细菌感染或脓毒症的检测（鉴别诊断）疾病或治疗反应的监测局部与全身性感染脓毒症的诊断和监测新生儿脓毒症的检测 48hr 生理性一过性峰值创伤后炎症综合症创伤后炎症综合症: 多发性创伤, 大面积烧伤, 大手术后 ( (心脏心脏, , 移植移植, , 腹部腹部) )使用致炎细胞因子治疗后使用致炎细胞因子治疗后 (OKT3, 注射 TNF, IL-2, 抗淋巴细胞球蛋白)某些肿瘤某些肿瘤 (甲状腺髓样细胞癌, 肺小细胞癌和支气管癌)长时间循环衰竭长时间循环衰竭 (心源性休克, 出血性休克, 热休克)PCT水平增加但没有系统细菌感染的几种情况感染早期 (- 6-12 小时后重复检测!)亚急性心内膜炎局部感染细菌感染而PCT不升高的情况 PCT检测影响因素受以下因素影响 * 甲状腺功能 是功能性甲状腺髓样癌的肿瘤标志物* 肾功能 严重肾功能受损者中水平较高不受以下因素影响* 类固醇药物* 自身免疫性疾病* 年龄、性別* 免疫功能低下状态:肝硬化、HIV感染（二）细菌内毒素革兰氏阴性菌细胞壁上的一种脂多糖（LPS）和蛋白的复合物，细菌死亡或自溶后释放进入机体将会出现发热、血压降低、寒颤、引起DIC、内毒素败血症等一系列临床反应。细菌内毒素检测原理：仪器检测试管内反应物的光密度OD值，取当OD上升到0.02的点的时间作为反应时间，该点在反应曲线上的位置为浊度开始快速变化的时期，该取值能够快速、稳定的获得反应时间，从而判断内毒素的含量动态浊度法仪器和试剂BET-24A细菌内毒素分析仪 MB-80微生物快速动态监测系统 标本要求患者早上尚未进行药物静脉治疗时: MB-80：“无热源真空采血管”,静脉抗凝血 ，采血量2-4ml ，30min内送检BET-24A：抽取1mL静脉抗凝血，配1mL1号处理液其它体液如脑脊液胸腹水与血标本要求相同。注意无菌操作内毒素活性定量检测意义G-所致脓毒症早期鉴别诊断指导抗生素正确使用判定抗感染治疗效果帮助判断患者的预后内毒素定量检测的适应症各种急、慢性病理性发热患者各种类型“中重度感染、肝病、休克、肠道疾病、脏器功能衰竭、大手术术后”患者慢性疾病长期卧床、免疫力低下患者急诊及ICU病房收治的生命体征不稳定的患者1.1,3-D-葡聚糖-G试验1，3-D-葡聚糖是酵母和丝状真菌细胞壁的多聚糖成分，以假丝酵母菌属含量最高，而其他微生物动物及人的细胞成分和细胞外液都不含这种成分。因此，血液及无菌体液中检出1，3-D-葡聚糖在很大程度上可以视为IFI 的标志，如念珠菌、曲霉、镰刀霉、酵母和丝孢酵母感染等。目前的检测方法为G试验，其 原 理 是 1，3-D-葡聚糖有特异性激活鲎变形细胞裂解物中的G因子引 起裂解物凝固，故称为G试验。 国内已经使用微生物快速动态检测系统检测。标本要求采样过程要求无菌操作常规病人早上用药治疗前空腹采血取样（血透患者透析前采血）标本类型：抗凝静脉血，使用无热原真空采血管采血量：2-3ml，立即混匀半小时内送检。实验前未打开标本在2-8可保存5天。打开后标本需在48小时内完成检测。如需长时间储存，存储温度应为-70。血清标本最多可冻融四次。解冻标本检测之前要充分混匀G试验的临床意义早期、快速诊断侵袭性真菌感染可用于真菌感染早期筛查，适用于念珠菌、曲霉、肺孢子菌、镰刀菌、地霉、组织胞浆菌和毛孢子菌等，不能用于检测隐球菌和接合菌感染。对真菌感染症状进行诊断，阳性结果代表存在侵袭性真菌感染（三）半乳甘露聚糖(GM)半乳甘露聚糖(GM) 是一种对热稳定的水溶性的物质，是广泛存在于曲霉和青霉细胞壁中的一类多糖。一般在曲霉感染者出现临床症状和影像学检查异常前数天，其体内循环中GM 即可呈阳性表达，其灵敏度和特异度均可达到80% 以上。原理：是一种微孔板双抗体夹心法，采用小鼠单克隆抗体EBA-2，检测人血清中的曲霉菌半乳甘露聚糖。标本要求标本采集：静脉采血5ml（红帽管）。检测标本：血清标本，密封，无菌操作。实验前未打开标本在2-8可保存5天。打开后标本需在48小时内完成检测。如需长时间储存，存储温度应为-70。血清标本最多可冻融四次。解冻标本检测之前要充分混匀20mg/L胆红素，或2g/L甘油三酯的脂血，或165mg/L血红蛋白的溶血标本不影响检测结果GM试验临床意义1.诊断侵袭性真菌感染2.血清GM检测能区分侵袭性肺曲霉感染与白色假丝酵母菌、毛霉、肺炎链球菌感染和烟曲霉口咽定植。但不能区分曲霉菌种。3. 评价疗效的可靠指标G G试验和试验和GMGM试验提高对试验提高对IFI IFI 的诊断。的诊断。阳性预测值可达阳性预测值可达100%100%。其它新生隐球菌： 循环夹膜抗原是新生隐球菌病,尤其是新生隐球菌脑膜炎的诊断手段。乳胶法: 5min即可出结果,特异性达90-100%,可检测35ng/ul的抗原ELISA:敏感性高于LA(乳胶凝集),可检测6ng/ul（四）结核分枝杆菌的快速诊断结核病至今仍为重要的传染病。估计世界人口中1/3感染结核分枝杆菌。结核分枝杆菌生长缓慢，一般需2-4周长成肉眼可见的落菌。抗酸染色法是检测TB的传统方法，但存在假阳性因此，快速诊断对TB至关重要。结核感染现状全球范围内结核病疫情急剧恶化全球范围内结核病疫情急剧恶化结核病与艾滋病同时流行结核菌耐药现象益发严重人口大规模流动我国是世界上仅低于印度的第二结核病大国我国是世界上仅低于印度的第二结核病大国结核菌感染率44.5%新发活动性结核患者130万/年死亡13万/年早期快速诊断与治疗成为制约结核病控制的关早期快速诊断与治疗成为制约结核病控制的关键键常规实验室诊断结核病方法阳性率不到60%全球结核疫情结核检测方法一、现有实验室常规检测技术一、现有实验室常规检测技术细菌学诊断 涂片、培养免疫学诊断 抗原、抗体胶体金分子生物学诊断 PCR二、其它检测技术二、其它检测技术结核菌素纯蛋白衍生物PPD（TST）实验影像学检查结核夹层杯技术结核感染T细胞检测技术分子生物学技术结核分枝杆菌的快速诊断结核夹层杯技术原理原理：通过专用消化灭活液消化组织细胞和粘蛋白等，将结核杆菌裸露出来，并结合高速震荡，使痰标本充分液化而有利于其中的抗酸杆菌沉淀于特制彭氏杯底部的菌膜上，在夹层杯中直接抗酸染色、干燥，并用取片针顶出内底，经封片等步骤后，镜下检测抗酸杆菌。检测流程示意图镜下比较图2. 夹层杯法（新方法）：菌量多，背景清晰，易于观察 图1. 直接涂片法（传统方法）：菌量少，背景不清晰夹层杯诊断技术的优点阳性率高背景清晰，易于观察易于标准化检测速度快生物安全性好夹层杯诊断夹层杯诊断技术的优点技术的优点结核夹层杯技术标本要求：（1）痰液要求新鲜，留取清晨深咳出的第一口痰液，留痰时，患者以清水漱口次，然后用力咳出气管深处的痰（2）用氢氧化钠处理完全。临床应用：用于结核分枝杆菌的初筛结核感染T细胞检测技术是以ELISPOT技术 检测结核感染的新方法 ，ELISPOT是近20 年发展起来的检测抗原特异性T细胞的技术，是目前最敏感的检测抗原特异性T细胞的方法之一。-干扰素释放实验（IGRA，interferon- gamma release assay）酶联免疫斑点技术（ELISPOT，Enzyme-Linked ImmunoSpot assay）结核杆菌特异抗原 早期抗原靶6（ESAT-6） early secreted antigenic target 6 培养滤液蛋白10（CFP 10） culture filtrate protein 10 ）技 术 背 景结核感染者体内存在特异的效应T淋巴细胞，效应T淋巴细胞再次受到结核抗原刺激时会分泌多种细胞因子（IFN-）。因此，检测效应T淋巴细胞可用于结核病或结核潜伏感染者的诊断。由于效应T细胞存活时间很短，而且具有特异性，因此可以作为机体是否正处于被感染的指标，无论是否有临床症状。基于IGRA原理的检测项目目前已被美国、加拿大、英国、德国、意大利、瑞士、法国、荷兰、日本等二十余个国家写入本国的结核诊疗指南中-干扰素释放实验（IGRA）酶联免疫斑点技术（ELISPOT）酶联免疫斑点技术（ELISPOT）近二十多年来，随着技术改良，ELISPOT 分析技术已经是当世公认的最灵敏的抗原特定T细胞的体外检测技术结合了细胞培养技术与酶联免疫吸附技术（即ELISA 技术），能够在单细胞水平检测细胞因子的分泌情况，灵敏度高。其技术原理：用抗体捕获培养中细胞所分泌的细胞因子，并以酶联斑点显色方式将其表现出来（Sedgwick JD 2005）。结核杆菌特异抗原ESAT-6ESAT-6与与CFP10CFP10抗原抗原由结核杆菌基因组RD1区相同的操纵子编码的蛋白所有的卡介苗（BCG）均丢失该基因序列绝大多数的环境分枝杆菌也不存在RD1区操作步骤操作步骤孵育1小时实 际 效 果 图阴性结果阴性结果阳性结果阳性结果空白对照抗原 AESAT-6抗原 BCFP10阳性对照（PHA）T-SPOT.TB 特点特异性好，不受卡介苗（BCG）接种和环境分枝杆菌影响灵敏度高，在免疫力低下/受抑制人群中有很高的检出率快速，24小时报告结果写入诊疗指南的国家（Guidelines）美国（CDC和儿科学会）；加拿大 （加拿大结核病委员会）；巴西（卫生部）英国（国家卫生和临床协会）；法国（国家卫生局）；西班牙（西班牙肺病和胸部手术协会）；德国（德国抗结核病中央委员会）； 意大利；瑞士（瑞士肺科协会）；荷兰（实用结核病控制委员会）；丹麦（丹麦肺部医学会）；挪威（挪威公共卫生协会）；芬兰（国家卫生和福利协会）；爱尔兰（国家结核病咨询委员会）；葡萄牙；捷克共和国； 斯洛伐克；波兰；保加利亚；克罗地亚澳大利亚（国家结核病咨询委员会、传染病协会和澳大利亚风湿病协会）；沙特阿拉伯；南朝鲜；日本（日本结核病预防协会） WHO和ECDC 中国（专家组推荐）1、结核病辅助诊断结核病辅助诊断/ /疗效评价疗效评价“菌阴”结核病患者的辅助诊断肺外结核的鉴别诊断抗痨治疗的疗效评价2、免疫力低下免疫力低下/ /受抑制患者的结核诊断受抑制患者的结核诊断/ /感染筛感染筛查查使用生物制剂/免疫抑制剂患者的结核感染筛查HIV感染者/肾透析患者/器官移植患者3 3、儿童结核病的辅助诊断、儿童结核病的辅助诊断4、结核密切接触者结核密切接触者/ /高危人群的结核感染筛查高危人群的结核感染筛查结核病患者的家属/医务工作者/监狱囚犯5、接触追踪接触追踪临床应用结核相关疾病肺结核菌阳（痰涂片、痰培养）-结核专科医院菌阴-感染科、呼吸科、胸外科、结核科肺外结核淋巴结结核-外科、血液科、感染科结核性胸膜炎-感染科、呼吸科、结核科结核性腹膜炎-外科、消化科、感染科结核性脑膜炎-感染科、神经科骨关节结核-骨科、风湿科、感染科泌尿生殖系统结核-泌尿外科、肾脏科、感染科、性病科其他：如结核性心包炎、脾结核、胰腺结核等评 价不能够提示临床患者的病变部位不能够根据斑点数量的多少来判断受试者是活动性结核病患者或是潜伏感染者儿童结核的辅助诊断，需要结合临床(五)荧光抗体技术常用于呼吸道合胞病毒、流感病毒、副流感病毒、腺病毒等微生物抗原/抗体快速检查。直接法、间接法。常用荧光染料：异硫氰酸荧光素（FITC）、四乙基罗丹明（RIB200）、藻红蛋白（PE）、稀土镧系元素等。 1.1.直接荧光抗体法直接荧光抗体法荧光素标记的特异荧光素标记的特异性抗体直接与相应性抗体直接与相应抗原反应。抗原反应。直接荧光抗体染色法示意图直接荧光抗体染色法示意图病毒抗原检测病毒抗原检测1.标本收集和处理标本收集和处理由专职护士将塑料导管经鼻腔插入7-8cm达到咽部以下诱导吸取1-2ml分泌物,洗涤标本，离心，调节上皮细胞浓度到1.0106/ml。2.免疫荧光染色（免疫荧光染色（Chemicon试剂）试剂）用直接免疫荧光试剂对所有标本进行检测。荧光显微镜下观察。检测多种病毒：腺病毒（ADV）、流感病毒A(IFVA)、B型(IFVB)、副流感病毒1、2、3型(PIV1、2、3)及呼吸道合胞病毒(RSV)。标本送到实验室2h内就可得出结果,普通实验室即可开展，特异性达86%，敏感性达95%。特异性抗体与相应特异性抗体与相应抗原反应，荧光素抗原反应，荧光素标记的抗抗体再与标记的抗抗体再与第一抗体结合。第一抗体结合。 间接荧光抗体染色法示意图间接荧光抗体染色法示意图 2.间接荧光抗体法间接荧光抗体法(1)(1)呼吸道病原体呼吸道病原体IgM抗体检测抗体检测西班牙Vircell生物公司生产的呼吸道感染病原体IgM九联检测卡可早期、快速、准确地检出引起呼吸道感染的主要病原体的IgM抗体。检出的病原体包括：嗜肺军团菌血清型、肺炎支原体、Q热立克次体、肺炎衣原体、肺炎支原体、腺病毒、呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒和副流感病毒、型。九项呼吸道感染病原体九项呼吸道感染病原体IgM抗体检测试剂盒抗体检测试剂盒(2)载玻片结合抗原载玻片结合抗原l含有下列抗原：含有下列抗原：1. 1. 嗜肺军团菌血清嗜肺军团菌血清1 1型（悬浮于型（悬浮于0.5%0.5%正常鸡卵黄正常鸡卵黄囊中以增强抗原吸附性和避免细菌聚集）囊中以增强抗原吸附性和避免细菌聚集）2. McCoy2. McCoy细胞中的肺炎支原体细胞中的肺炎支原体3. Q3. Q热立克次体热立克次体IIII期（悬浮于期（悬浮于0.5%0.5%正常鸡卵黄囊正常鸡卵黄囊中以增强抗原吸附性和避免细菌聚集）中以增强抗原吸附性和避免细菌聚集）4. 4. 肺炎衣原体（原生小体）肺炎衣原体（原生小体）5. HEp-25. HEp-2细胞中的腺病毒细胞中的腺病毒6. HEp-26. HEp-2细胞中的呼吸道合胞病毒细胞中的呼吸道合胞病毒7. LLC-MK27. LLC-MK2细胞中的甲型流感病毒细胞中的甲型流感病毒8. LLC-MK28. LLC-MK2细胞中的乙型流感病毒细胞中的乙型流感病毒9. LLC-MK29. LLC-MK2细胞中副流感病毒细胞中副流感病毒1 1、2 2和和3 3型型10. 10. 质控孔。质控孔。（3）九联检的检测价值）九联检的检测价值特点：1.取材方便：空腹采集非抗凝静脉血3ml。2.检测全面：一卡九项，避免漏检；3.灵敏度93.8%，特异性96.3%，性能稳定，无交叉反应；4.IgM抗体一般1-2周出现；2-3月消失。不能区分特别早期及重复感染。临床意义：呼吸道感染性疾病的早期、快速、准确诊断；对病原体的鉴别诊断提供导向性依据；指导临床合理用药。 （三）酶联免疫技术（三）酶联免疫技术1.GM试验：检测人血清中的曲霉菌半乳甘露聚糖，用于侵袭性曲霉菌感染辅助诊断。2.斑点ELISA技术：单克隆抗体结合硝酸纤维膜，检测患者的咽拭标本中肺炎支原体、流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒和腺病毒等病原体。二、分子生物学技术二、分子生物学技术分子诊断技术检测致病菌PCR技术扩增16srRNA基因鉴定常见致病菌革兰阳性球菌革兰阴性杆菌mecA基因VanA/VanB基因 PBP2b基因PCR扩增耐药基因特异性基因ESBLs基因 AmpC基因碳青霉烯酶基因mecA：耐甲氧西林葡萄球菌属（MRS）特异性基因Van A VanB ：耐万古霉素肠球菌（VRA）特异性基因PBP2b ：青霉素不敏感肺炎链球菌（pNSSp）特异性基因ESBLs基因：主要包括TEM、SHV、CTX-M、OXAAmpC基因包括质粒介导型和染色体诱导型。其中前者主要包括MOX、CMY、DHA、ACC、ACT、FOX等亚型，后者主要包括： ADC。碳青霉烯酶基因：A类酶，以KPC为代表；金属酶，以IMP、VIM、NDM为代表；D类酶，以OXA-23、OXA-24、OXA-51和OXA-48为主。（一）（一）DNA分子中分子中G+C百分含量的测定百分含量的测定遗传物质DNA中四种碱基G、C、A、T的排列和比例是DNA特性的决定因素。细菌DNAG+C或A+Tmol%能反映细菌间DNA分子同源程度。不同种属间G+Cmol%范围在25%-75%之间。同一种细菌G+Cmol%相当稳定，不受菌龄、培养条件和其他外界因素影响,成为细菌分类和菌种鉴定的重要指标。亲缘关系越近的细菌G+Cmol%越相近，但G+Cmol%相同或近似，其亲缘关系不一定相近。常用方法：热变性温度法、高效液相色谱法、浮力密度法和荧光法。（二）（二）DNA-DNA杂交杂交原理：基于DNA解链的可逆性和碱基配对的专一性，将不同来源的DNA在体外变性（高温或pH)，并在合适的条件下(盐类浓度和温度），使互补的碱基重新配对，测量杂交百分数。常用方法：固相杂交法。将待测菌株双链核酸解成单链固定在硝酸纤维素滤膜等固相支持物上，置入含有经标记的并解链的参照菌株的单链核酸(探针)液中复性，形成新的双链核酸，测定杂合双链的相对放射性强度来确定菌株间的同源性程度。同一菌：100%同源性。同一种内同一亚种的细菌：80%-90%同源性。同一种内不同亚种的细菌：60%-70%同源性。同一属中的不同菌种的细菌：20%-60%同源性。（三）核酸扩增技术（三）核酸扩增技术1985年发明PCR技术。常用检测方法：逆转录PCR、多重PCR、巢式PCR、通用引物PCR、PCR单链构象多态性分析、随机引物DNA多态性扩增、限制性长度多态性分析、实时荧光定量PCR等。目的基因包括16SrRNA、23SrRNA、16S-23SrRNA基因间隔区、热休克蛋白基因、膜蛋白基因、DNA解旋酶B亚基的gyrB基因、细菌毒力基因等。16SrRNA、23SrRNA及16S-23SrRNA序列应用最为广泛。1.16SrDNA鉴定细菌的rRNA按沉降系数分可分为5S、16S和23S三种，其编码基因(rDNA)的链长依次为120bp、1540bp和3300bp。20世纪60年代末，Woese等学者开始采用寡核苷酸编目法对生物进行分类，通过比较各类生物细胞的rRNA特征序列，认为16srRNA及其类似的rRNA基因序列作为生物系统发育指标最为合适。1.16SrDNA鉴定16SrDNA是细菌染色体上编码16SrRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌染色体基因中，它们相对稳定且有较高的拷贝数，其序列中含可变区及高度保守区，因此可设计群、属、种特异性的探针。16SrDNA测序:细菌基因组DNA提取、16SrDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA测序、序列比对等步骤。采用探针杂交或PCR等方法检测血液、脑脊液等无菌体液中16SrRNA基因,即表明有细菌感染。16SrDNA具有高度保守性，且分子小、包含的信息量较少，对于亲缘关系较近的细菌，其分辨率不高，16SrDNA序列分析只能在属的水平上区分细菌，仍然需要借助其他手段加以辅助分析。16S rRNA具有多拷贝多信息的特点2. 16s-23s rDNA2. 16s-23s rDNA鉴定鉴定16S-23SrDNA区间序列的进化速度是16SrDNA的10倍。16S、23SrDNA端序列高度保守。可用于菌种间的鉴别,还可以用来分辨16SrDNA不能鉴别的非常接近的菌种和种内细菌之间的鉴别3.核酸探针技术核酸探针技术原理：用带有酶、化学荧光物、放射性核素或生物素标记的已知序列特定DNA片段，称为探针。在一定条件下按碱基互补原则探针与待测标本中的核酸杂交，通过对杂交信号的检测，从而鉴定标本中有无相应的病原微生物基因及其分子大小。常用核酸探针技术：液相杂交、固相杂交、斑点杂交、原位杂交、Southern印迹、Northern印迹等。核酸探针可检测任何特定病原微生物，目前已广泛用于常见病毒感染的诊断和研究.4.4.环介导等温扩增技术环介导等温扩增技术（1）LAMP技术来源：环介导等温扩增法(loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)。1）2000年日本学者NotomiT等首先报道一种新的核酸扩增技术。2）针对靶基因的6个区域设计4条特异引物，利用1种链置换聚合酶，在恒温条件(60-65)保温约60min即可完成核酸扩增反应，还可通过设计两条环引物可使反应速度提升l/2l/3。3）LAMP技术可用于病毒、细菌、寄生虫等病原微生物的现场快速检测、战时野外、食品化妆品安全及基层医疗机构广泛应用。（2）扩增原理）扩增原理DNA在65左右处于动态平衡状态，任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，变成单链。在链置换型DNA聚合酶的作用下，以FIP引物F2区段的3末端为起点，与模板DNA互补序列配对，启动链置换DNA合成。（3 3）检测方法）检测方法荧光定量法：利用SYBRGreenI荧光染料只与双链DNA小沟结合，当它与DNA双链结合时，发出较原先强8001000倍的荧光的原理，其信号强度代表了双链DNA分子的数量。获取Ct值，比照标准曲线，可确定模板DNA的起始拷贝数。颜色变化：产物中加SYBRGreenI或Goldview，肉眼观察颜色反应；呈绿色的为阳性反应，橙红色为阴性反应。浊度检测：在核酸大量合成时，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg结合，产生副产物焦磷酸镁沉淀。肉眼观察或浊度仪在400nm光下，检测沉淀浊度就能够判断扩增与否。（4）LAMP试验缺陷试验缺陷与常规PCR相比，不需要模板的热变性、温度循环、电泳观察等过程，具有简便、快速、灵敏度高、特异性强、低价等特点。缺点：1.引物设计比传统的PCR复杂，为单链DNA的分离增加了难度。2.LAMP为定性试验，且只能检测一种细菌，无法提供药敏信息。3.反应的条件需要摸索：引物的长度与浓度、反应条件、目的序列的大小、茎环结构的大小等方面进行优化，提高扩增效率和特异性。4.LAMP反应易污染，最好分区操作。三、生物传感器三、生物传感器生物传感器利用生物化学和电化学反应原理，将生化反应信号转换为电信号，通过对电信号进行放大和模数转换，测量出被测物质及其浓度。固定化的生物敏感材料作识别元件（包括酶、抗体、抗原、微生物、细胞、组织、核酸等生物活性物质）与适当的理化换能器（如氧电极、光敏管、场效应管、压电晶体等等）及信号放大装置构成的分析工具或系统。由于生物传感器检测准确、操作简便、高度自动化、微型化与集成化的特点，近年来已经在感染性疾病诊断、药物筛选、生物武器监测等领域获得了广泛的应用。检测病原体的DNA生物传感器最为常见，监测多种细菌、病毒及其毒素，如炭疽芽胞杆菌、鼠疫耶尔森菌、埃博拉出血热病毒、SARS病毒、肉毒杆菌类毒素等。生生物物传传感感器器按所用分子识按所用分子识别元件的不同别元件的不同按信号转换元件的不同按信号转换元件的不同按对输出电信号按对输出电信号的不同测量方式的不同测量方式酶传感器酶传感器微生物传感器微生物传感器组织传感器组织传感器细胞传感器细胞传感器免疫传感器免疫传感器DNA传感器传感器电化学生物传感器电化学生物传感器半导体生物传感器半导体生物传感器测热型生物传感器测热型生物传感器测光型生物传感器测光型生物传感器测声型生物传感器测声型生物传感器电位型生物传感器电位型生物传感器电流型生物传感器电流型生物传感器伏安型生物传感器伏安型生物传感器微生物传感器微生物传感器 微生物传感器由微生物传感器由固定化微生物固定化微生物、换能器换能器和和信号输出装置信号输出装置组成组成, ,利用固定化微生物代谢消耗溶液中的溶解氧或产生利用固定化微生物代谢消耗溶液中的溶解氧或产生一些电活性物质并放出光或热的原理实现待测物质的定量一些电活性物质并放出光或热的原理实现待测物质的定量测定测定, ,原理见下图：原理见下图：微生物传感器原理示意图微生物传感器原理示意图Schematic diagram of BOD monitoring system for anaerobic wastewater treatment process影响传感器响应的因素影响传感器响应的因素1 1） PHPH值：值：微生物传感器中细菌生长于转换器电极要求的微生物传感器中细菌生长于转换器电极要求的PHPH值不一值不一致时，需要找出一个折衷值致时，需要找出一个折衷值2 2） 缓冲溶液的种类和用量缓冲溶液的种类和用量：TrisTris缓冲液可产生氨，而焦磷酸盐缓缓冲液可产生氨，而焦磷酸盐缓冲液对微生物有抑制作用，这两种缓冲液均不能用于用氨气敏电极冲液对微生物有抑制作用，这两种缓冲液均不能用于用氨气敏电极作为转换器而组成的组氨酸微生物传感器。另外缓冲剂的缓冲容量作为转换器而组成的组氨酸微生物传感器。另外缓冲剂的缓冲容量不足时也会造成电极不符合能斯特响应。不足时也会造成电极不符合能斯特响应。3 3） 微生物的用量微生物的用量：增加细菌细胞的用量可使能斯特响应区增宽，：增加细菌细胞的用量可使能斯特响应区增宽，但增加得太多又会导致响应减慢，而且传感器浸泡在缓冲液恢复到但增加得太多又会导致响应减慢，而且传感器浸泡在缓冲液恢复到原来响应值的时间也相应增长。原来响应值的时间也相应增长。4 4） 温度温度：微生物传感器虽也要求最适温度，但不像酶电极那样敏：微生物传感器虽也要求最适温度，但不像酶电极那样敏感。适当提高温度可使细菌细胞新城代谢以及底物的扩撒加快，从感。适当提高温度可使细菌细胞新城代谢以及底物的扩撒加快，从而使响应时间缩短。而使响应时间缩短。5 5） 活化剂与稳定剂活化剂与稳定剂6 6） 气体的影响气体的影响四、生物芯片四、生物芯片生物芯片是20世纪90年代中期发展起来的一项技术。以玻片、尼龙膜等为载体,将大量基因基因片段、多肽多肽、蛋白质蛋白质等探针分子固定于支持物上后与带荧光标记的DNA、蛋白质或小分子等进行杂交，检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息，从而实现对核酸、蛋白质及其他生物成分的高通量快速检测。病原微生物感染的快速诊断、变异及耐药机制的研究；基因分型、分子流行病学调查和抗感染药物的研制等。制备成本高，检测仪器昂贵，特异性、敏感性有待进一步提高等因素,目前还未在临床病原微生物检测中广泛应用。生物芯片基本类型生物芯片基本类型生物芯片生物芯片biochip芯片实验室芯片实验室分析生物芯片分析生物芯片DNA芯片芯片蛋白质芯片蛋白质芯片细胞芯片细胞芯片组织芯片组织芯片lab on chip生物计算机芯片生物计算机芯片蛋白质计算机芯片蛋白质计算机芯片DNA计算机芯片计算机芯片biocomputeranalytical biochip五、质谱分析技术五、质谱分析技术质谱法质谱法 (mass spectrometry, MS)：是在高真空系统中将样品分子离解成带电的离子，并通过对生成离子的质量和强度的测定，而进行样品成分和结构分析的方法。应用：1.适用于高通量蛋白质组学研究，包括蛋白质/肽质量指纹谱测定，多肽序列分析等研究；2.适用于临床微生物快速准确鉴定。研究者研究者时间时间 贡献贡献J. J Thomson1912 第一台质谱仪第一台质谱仪Gohlke and McLafferty1956 气相质谱气相质谱Biemann, Seibl et al.1959 肽序列分析肽序列分析McLafferty, Jennings et al.1967 串联质谱串联质谱McLafferty1973 液相质谱液相质谱Comisarow and Marshall1974 傅立叶回旋共振质谱傅立叶回旋共振质谱Barber, Bordoli et al.1981 快原子轰击快原子轰击Yamashita, Fenn et al.1984 电喷雾离子化用于生物大分子电喷雾离子化用于生物大分子Tanaka, Karas et al.1988 基质辅助激光解吸离子化用于基质辅助激光解吸离子化用于生物大分子生物大分子质谱技术发展历史简介质谱技术发展历史简介MALDI-TOFMS技术1.不同属种的细菌具有不同的蛋白指纹图谱，根据细菌蛋白指纹图谱可对细菌进行快速鉴定。2.1996年，Claydon等采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪（MALDI-TOFMS）鉴定革兰阴性和革兰阳性细菌。3.激光照射样品与基质（-氰基-4-羟基肉桂酸，CHCA)形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量传递给生物分子，而电离过程是将质子转移到生物分子或从生物分子得到质子，而使生物分子电离的过程。离子在电场作用下加速飞过飞行管道到达检测器，被测离子的飞行时间与离子的质荷比与成正而达到检测目的；再通过专用软件分析比较，确定出病原菌特征性的指纹图谱，质量范围为2-20KDa。每种微生物都有自身独特的蛋白质组成，因而拥有独特的蛋白质指纹图谱。MALDI-TOF:基质辅助激光解吸/电离-飞行时间质谱分析法(MS)VITEK MSMicroflexMALDI-TOFMS概述( (MMatrix atrix A Assisted ssisted L Laser aser D Desorptionesorption/ /I Ionization onization T Time ime o of f F Flight light ) )解吸附解吸附离子化离子化加速加速分离分离检测离子离子检测器器+靶板靶板基基质/样本本结晶晶加速加速场飞行行时间MALDI-TOF MS: 基本原理基本原理标本分子与基质形成基质/标本结晶in vacuum每个每个Bin的的权重重:+:高度菌种特异性高度菌种特异性(+15,+20.)+:中度菌种特异性中度菌种特异性(+3,+4.)-:无峰无峰(-3,-4.)-:无峰或者无峰或者质量峰量峰对应其他菌种其他菌种(-15)VITEKMS从质量分布到Bin矩阵Peaks12345678910.129812991300Bins12345678910S1S2S3S1S2S312345678910+Presence/AbsenceBin 1Bin 2Bin 3Bin 4Bin 5Bin 1300Abiotrophia defectiva00+4+150+4Acinetobacter haemolyticus0-3+40+40Acinetobacter johnsonii0-3000+4Acinetobacter junii00+40-30E. Coli+15-8+3000S.aureus0+200-15+4-3Salmonella group+13-11+40-20q每一台商品化每一台商品化VITEKMS都使用都使用Bin矩矩阵q每次数据每次数据库更新都会更新都会对Bin矩矩阵进行更新行更新.ProbabilitycurvesVITEKMSBin矩阵的发展112同同Bin矩矩阵比比对为所有菌种所有菌种计算算bin值(score)将将Bin值转换为置信度置信度发送送结果果从从谱图获取到取到结果果报告的全自告的全自动化化VITEKMS结果计算VITEK MS (IVD)基于种群SARAMIS (RUO)基于菌株Bruker BioTyper质谱 不同的数据分析理念不同的数据分析理念基于种群基于种群 菌种之间的差异得到了体现需要使用很多参考菌株基于单个菌株基于单个菌株建库快菌株并不可代表很多常见分离株标本准备的简单步骤1.扫描标本序列号2.扫描测试靶板显示空靶点3.将病原菌放在测试靶板上，并添加基质4.扫描VITEK2药敏卡VITEKMS:pendingFDAclearance灵活性灵活性:多个操作台(可达10个)尽可能单独放置每批检测可以分析14张靶板高通量高通量:4x48=192标本/测试节省大量时间节省大量时间:无需进行各种测试多张芯片可以允许进行不同测试VITEK MS 简化的操作流程化的操作流程WorkStation1WorkStation2WorkStation3WorkStation4VITEK MS: pending FDA clearance一次性测试靶板条形码可溯源每个测试靶板有3个测试区每组116个样本每个区域有校准孔验证操作正确性(调整、对齐等)无需清洗VITEKMS测试靶板产气气肠杆菌杆菌DSM 30053在三种不同培养基上在三种不同培养基上生生长24小小时之后的之后的谱图所有所有样本都具有主要特征峰本都具有主要特征峰所有培养基上的所有培养基上的样本都得到了本都得到了正确正确鉴定定 培养基培养基对鉴定没有影响定没有影响对各种培养基兼容在哥在哥伦比比亚培养基上的奇异培养基上的奇异变形杆菌形杆菌DSM 4479谱图经过120小小时培养后，主要特培养后，主要特征峰依然存在征峰依然存在所有所有时间段段样本均得到了正本均得到了正确确坚定定培养培养时间不影响不影响鉴定定结果果不同培养时间的鉴定结果1. 挑取克隆挑取克隆2. 涂在涂在测试靶板上靶板上3. 加基加基质: 1 l 基基质(CHCA) -cyano-4-hydroxycinnamic acid(甲酸甲酸 酵母菌酵母菌) 4. 装入装入VITEK MS对细菌和酵母菌无需裂解或提取的步菌和酵母菌无需裂解或提取的步骤MALDI-TOF鉴定操作流程在在259个血培养瓶的个血培养瓶的检测中，中，VITEKMS(Saramisdatabase)鉴定定结果一共有果一共有202个，个，其中其中189例例(93.6%)在属的水平在属的水平鉴定正确定正确,而只有而只有7个个(3.5%)是是错误的的（）操作简单、快速单个微生物菌落或其它生物材料经简单的样品前处理后，使用MALDITOF质谱仪进行测定。所获得的质谱图可直接送到数据库进行检索。这个简单而独特的工作流程可以满足绝大多数微生物的鉴定，而且不需要进行革兰氏染色、氧化酶试验或选择PCR引物。一个样品从获得单克隆开始，到样品处理、谱图采集和获得鉴定结果可以在几分钟内完成，操作简单、快速，通量高。（）灵敏度高使用经久耐用且性能可靠的布鲁克道尔顿的MALDITOF系列质谱仪，可以实现高重现性的快速可靠检测。由于仪器的高灵敏度，可以检测到低至5000个细胞。（）准确性度好MALDITOF获得的蛋白指纹图谱用作模式匹配，匹配分值用作鉴定结果的分级和归类。软件对所得的图谱进行归一化分析，其精巧的算法保证了鉴定的精确性。蛋白指纹图主要集中在2-20kDa受到微生物生长环境和状态影响很小的稳定高表达的那些蛋白。靳颖靳颖,等等.应用基质辅助激光电离飞行时间质谱快速鉴定临床酵母菌应用基质辅助激光电离飞行时间质谱快速鉴定临床酵母菌.中国真菌学杂志中国真菌学杂志 2012得分得分 2.02.0的菌株的菌株: :种的水平上的鉴定被完全接受，种的水平上的鉴定被完全接受，得分在得分在1.8 -2.0 1.8 -2.0 之间的菌株之间的菌株: :种水平上种水平上的鉴定已经足够准确，的鉴定已经足够准确，得分在得分在1.7 以上的菌株以上的菌株:属的水平上被接受。属的水平上被接受。六、六、DNA测序技术杂交测序法杂交测序法质谱法质谱法单分子测序法单分子测序法原子探针显微镜测序法原子探针显微镜测序法流式细胞仪测序法流式细胞仪测序法大规模平行实测法、大规模平行实测法、DNADNA芯片法芯片法 经典方法经典方法新技术方法新技术方法SangerSanger双脱氧链终止法双脱氧链终止法(Sanger(Sanger和和Coulson1977)Coulson1977)Maxam-Gilbert DNAMaxam-Gilbert DNA化学降解法化学降解法(Maxam (Maxam 和和Gilbert,1977)Gilbert,1977)第二代DNA测序技术特点：边合成边测序（SequencingbySynthesis)，即通过捕捉新合成的末端的标记来确定DNA的序列。主要技术平台：Roche/454FLXIllumina/SolexaGenomeAnalyzerAppliedBiosystems/SOLIDsystem第二代测序技术缺陷成本仍十分高昂，仪器普遍高达40-70万美元，而一个全基因组测序至少需要2000-5000美元，同时花费几周的时间；依赖基因样品的扩增过程，大量的洗脱过程即增加了成本和样品制备的时间，也容易出现错误累积；低读长：150-400bp。无法满足更高的科研需要；大量的数据拼接工作和光学读取导致的大体量数据，让分析变成了耗时耗力的工作。罗氏公司已决定于2016年停止其第二代测序平台454的生产。第四代基因测序技术第四代基因测序技术纳米孔测序技术原理：分子在通过纳米孔道时，会对通过纳米孔的电流，或横穿过纳米孔的电流（隧穿电流）产生影响，而每种不同的分子通过时，对电流产生的影响具有可区别的差异。利用这种差异，纳米孔测序技术就可以识别基因中碱基（对）的排列顺序。第四代测序技术真正实现单分子检测和电子传导检测相结合的测序方法，完全摆脱了洗脱过程、PCR扩增过程。最有希望实现1000美元基因组甚至100美元基因组的技术，纳米孔技术具有超高读长、高通量、更少的测序时间和更为简单的数据分析，实现了从低读长到超高读长、从光学检测到电子传导检测的双重跨越。有望在几小时内以几百美元的成本完成全基因组测序。测序技术在微生物领域应用重大突发传染病发现常规细菌鉴定微生物耐药基因分析分子流行病学监测