微生物学实验 吉林大学生物基础实验吉林大学生物基础实验教学中心教学中心无菌技术及无菌操作无菌技术及无菌操作1复件 无菌技术及无菌操作一.无菌技术二.灭菌方法三.细胞培养无菌操作基本技术2复件 无菌技术及无菌操作无菌技术无菌技术是用于细胞培养过程的术语，其基本原理可用于所有的细胞类型。无菌技术有两个主要目的，一是防止实验室的培养物被其他来源的微生物（如皮肤、衣服或周围环境的微生物）污染。二是防止实验工作者（包括老师和学生）被微生物感染。3复件 无菌技术及无菌操作无菌试验无菌试验 无菌实验室无菌实验室无菌操作无菌操作 细胞培养无菌操作细胞培养无菌操作 4复件 无菌技术及无菌操作P2 级无菌操作台级无菌操作台无菌操作无菌操作无菌操作室无菌操作室无菌操作室无菌操作室5复件 无菌技术及无菌操作灭菌方法消毒消毒：一般指消灭病原菌和有害微生物 的营养体。灭菌灭菌：一般指杀灭一切微生物的芽孢孢子及休眠体。灭菌的方法灭菌的方法： 一、加热法 二、过滤除菌 三、辐射灭菌 四、化学药品灭菌6复件 无菌技术及无菌操作一、加热法1 1、干热灭菌、干热灭菌方法：热空气灭菌和灼烧。机理：利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌目的。2 2、湿热灭菌、湿热灭菌方法：高压蒸汽灭菌法、常压蒸汽灭菌法、煮沸消毒法和超高温杀菌法。机理：利用高温（高于100）导致菌体蛋白质变性达到目的。7复件 无菌技术及无菌操作干热灭菌箱干热灭菌箱8复件 无菌技术及无菌操作湿热灭菌分类湿热灭菌分类1 1 高压蒸汽灭菌法高压蒸汽灭菌法2 2 常压蒸汽灭菌法（间歇灭菌）常压蒸汽灭菌法（间歇灭菌） 可采用阿诺氏流动可采用阿诺氏流动蒸汽灭菌器进行。蒸汽灭菌器进行。3 3 煮沸消毒法煮沸消毒法4 4 超高温杀菌超高温杀菌9复件 无菌技术及无菌操作二、过滤除菌主要是选用孔径小（一般主要是选用孔径小（一般0.20.2微米或微米或0.40.4微米）微米）的微孔材料（如磁土、的微孔材料（如磁土、 石棉、超滤膜等）制石棉、超滤膜等）制作成专门的细菌滤器，通过抽气泵进行减压过作成专门的细菌滤器，通过抽气泵进行减压过滤。滤。最广泛的过滤器有蔡氏过滤器和微孔滤膜过滤最广泛的过滤器有蔡氏过滤器和微孔滤膜过滤器。许多材料如血清、抗生素及糖溶液都是采器。许多材料如血清、抗生素及糖溶液都是采用此中方法过滤。用此中方法过滤。无菌滤膜（孔径无菌滤膜（孔径0.20.2微米）过滤可以有效除去微米）过滤可以有效除去细菌，但不能除去病毒，因此过滤后的溶液不细菌，但不能除去病毒，因此过滤后的溶液不一定是没有病毒的。一定是没有病毒的。10复件 无菌技术及无菌操作配液配液 过滤过滤 除菌连动线除菌连动线11复件 无菌技术及无菌操作三 、辐射灭菌实验室的辐射灭菌通常用紫外线灭菌。实验室的辐射灭菌通常用紫外线灭菌。紫外线波长在紫外线波长在200300nm200300nm具有杀菌作用，具有杀菌作用，其中以其中以265266nm265266nm杀菌力最强。杀菌力最强。机理：机理：紫外线诱导了胸腺嘧啶二聚体的形成和紫外线诱导了胸腺嘧啶二聚体的形成和DNADNA链的交联，另外由于辐射使空气中的氧气链的交联，另外由于辐射使空气中的氧气电离成氧离子，氧离子再使氧气氧化生成臭电离成氧离子，氧离子再使氧气氧化生成臭氧或使水氧化生过氧化氢，过氧化氢和臭氧氧或使水氧化生过氧化氢，过氧化氢和臭氧有杀菌作用。紫外灯照射距离以不超过有杀菌作用。紫外灯照射距离以不超过1.21.2米米为宜。为宜。12复件 无菌技术及无菌操作四、化学药品灭菌化学药品灭菌是应用能抑制或杀死微生物的化学药品灭菌是应用能抑制或杀死微生物的化学制剂进行消毒灭菌的方法。化学制剂进行消毒灭菌的方法。 机理：能破坏细菌代谢机能使细菌不能增殖。机理：能破坏细菌代谢机能使细菌不能增殖。杀菌剂：能破坏细菌代谢机能并有致死作用的杀菌剂：能破坏细菌代谢机能并有致死作用的化学试剂化学试剂 。如重金属离子等。如重金属离子等。抑菌剂：只是阻抑细菌代谢机能使细菌不能增抑菌剂：只是阻抑细菌代谢机能使细菌不能增殖的化学试剂。如磺胺类试剂等殖的化学试剂。如磺胺类试剂等实验室常用的杀菌剂有实验室常用的杀菌剂有2%2%煤酚皂溶液（来苏尔），煤酚皂溶液（来苏尔），0.1%0.1%升汞，升汞，3%5%3%5%甲醛溶液，甲醛溶液，75%75%乙醇溶液等。乙醇溶液等。13复件 无菌技术及无菌操作细胞培养无菌操作基本技术细胞培养无菌操作基本技术(1)(1)实验前实验前, ,无菌室及无菌操作台用紫外灯照射无菌室及无菌操作台用紫外灯照射30-6030-60分钟灭菌分钟灭菌, ,用用70% 70% 酒精擦拭无菌操作台面酒精擦拭无菌操作台面, ,并开启并开启无菌操作台风机运转无菌操作台风机运转1010分钟后分钟后, ,才可开始实验操作才可开始实验操作. .每次操作只处理一株细胞每次操作只处理一株细胞, ,以免造成细胞交叉污染以免造成细胞交叉污染. .实验结束后实验结束后, ,将实验物品带出工作台将实验物品带出工作台. .如需要继续如需要继续进行下一个实验进行下一个实验, ,则用则用70% 70% 酒精擦拭无菌操作台面酒精擦拭无菌操作台面, ,再让无菌操作台风机运转再让无菌操作台风机运转1010分钟后分钟后, ,才可进行下一才可进行下一个实验操作。个实验操作。 14复件 无菌技术及无菌操作(2)(2)无菌操作工作区域应保持清洁与宽敞无菌操作工作区域应保持清洁与宽敞, ,必要物品必要物品, ,如试管架如试管架, ,移液器或吸管头等可以暂时放置移液器或吸管头等可以暂时放置, ,其它其它实验用品用完后应及时移出实验用品用完后应及时移出, ,以利气体流通以利气体流通. .实验实验用品要用用品要用70%70%酒精擦拭后才能带入无菌操作台内酒精擦拭后才能带入无菌操作台内. .实验操作应在操作台中央无菌区域内进行实验操作应在操作台中央无菌区域内进行, ,勿在勿在边缘非无菌区域操作。边缘非无菌区域操作。(3)(3)小心取出无菌实验用品小心取出无菌实验用品, ,避免造成污染避免造成污染. .切勿碰切勿碰触吸管与吸头头部或容器瓶口触吸管与吸头头部或容器瓶口, ,不要在打开的容不要在打开的容器正上方操作实验器正上方操作实验. .容器打开后容器打开后, ,用手夹住瓶盖并用手夹住瓶盖并握住瓶身握住瓶身, ,倾斜约倾斜约4545角取用角取用, ,尽量勿将瓶盖盖口尽量勿将瓶盖盖口朝上放在台面上。朝上放在台面上。 15复件 无菌技术及无菌操作(4)(4)工作人员应注意自身的安全工作人员应注意自身的安全, ,必须穿戴实验衣与必须穿戴实验衣与手套后才进行实验手套后才进行实验. .对于来自人源性或病毒感染对于来自人源性或病毒感染的细胞株应特别小心的细胞株应特别小心, ,并选择适当等级的无菌操并选择适当等级的无菌操作台作台( (至少两级至少两级).).操作过程中操作过程中, ,应避免引起气溶胶应避免引起气溶胶的产生的产生, ,小心有毒性试剂小心有毒性试剂, ,例如例如DMSODMSO及及TPATPA等等, ,并避并避免尖锐物品伤人等。免尖锐物品伤人等。(5)(5)定期检查下列项目定期检查下列项目:CO2:CO2钢瓶内的钢瓶内的CO2CO2压力压力;CO2;CO2培培养箱内的养箱内的CO2CO2浓度浓度, ,温度温度, ,及水盘是否有污染及水盘是否有污染; ;无菌无菌操作台内气流压力是否正常操作台内气流压力是否正常, ,定期更换紫外灯管定期更换紫外灯管及及HEPAHEPA过滤器滤膜过滤器滤膜, ,预滤网（预滤网（300300小时小时/ /预滤网预滤网,3000,3000小时小时/HEPA/HEPA)。16复件 无菌技术及无菌操作