一、高效液相色谱法介绍高效液相色谱法是以液体作为流动相，并彩用颗粒极细的高效固定相的柱色谱分离技术。高效液相色谱对样品的适用性广，不受分析对象挥发性和热稳定性的限制，因而弥补了气相色谱法的不足。在目前已知的有机化合物中，可用气相色谱分析的约占20%，而80%则需用高效液相色谱来分析。 二、高效液相色谱法分类根据分离机理可分为：吸附色谱键合相色谱离子交换色谱大小排阻（凝胶）色谱液-液分配色谱法 （一）吸附色谱分离吸附色谱法是当组分分子流经固定相（吸附剂，如硅胶或氧化铝）时，不同组分分子、流动相分子就要对吸附剂表面的活性中心展开竞争。这种竞争能力的大小，决定了保留值大小，即被活性中心吸附得越牢的分子，保留值越大。 （二）键合相色谱分离键合相色谱法是将类似于气相色谱中的固定液的液体，通过化学反应键合到硅胶表面，从而形成固定相。采用化学键合固定相的色谱法称为键合相色谱。若采用极性键合相、非极性流动相，则称为正相色谱；采用非极性键合相、极性流动相，则称为反相色谱。这种分离的保留值大小，主要决定于组分分子与键合固定液分子间作用力的大小。 （三）离子交换色谱分离离子交换色谱法是流动相中的被分离离子，与作为固定相的离子交换剂上的平衡离子进行可逆交换时，它们对交换剂的基体离子亲和力大小的不同而达到分离的。组分离子对交换剂基体离子亲和力越大，保留时间就越长。（四）大小排阻色谱分离 大小排阻色谱法的固定相是一类孔径大小有一定范围的多孔材料。被分离的分子大小不同，它们扩散渗入多孔材料的容易程度不同。小分子最易扩散进入细孔中，保留时间最长；大分子完全排斥在孔外，随流动相很快流出，保留时间最短。（五）液-液分配色谱法 分离液-液分配色谱的固定相和流动相是互不相溶的两种溶剂,分离时,组分溶入两相,不同的组分因分配系数(K)的不同而被分离.目前广泛使用的化学键合固定相是将固定液的官能团键合在载体上而制成的,使用化学键合固定相的色谱方法(简称键合相色谱法)可以用分配色谱的原理加以解释.键合相色谱法在HPLC中占有极其重要的地位,是应用最广的色谱法.按照固定相和流动相极性的不同,分配色谱法又可分为正相色谱法和反相色谱法两类. 1.正相色谱法 固定相极性大于流动相极性的分配色谱法称为正相分配色谱法,简称为正相色谱法。氰基键合硅胶,氨基键合硅胶等极性的化学键合固定相是正相色谱常用的固定相,正相色谱的流动相一般为极性较小的有机溶剂.在正相色谱中,极性小的组分由于K值较小先流出,极性较大的组分后流出.正相色谱法用于溶于有机溶剂的极性及中等极性的分子型物质的分离。 2.反相色谱法 流动相极性大于固定相极性的分配色谱法称为反相分配色谱法,简称为反相色谱法。反相色谱法使用非极性固定相,最常用的非极性固定相是十八烷基硅烷键合硅胶,还有辛烷基硅烷键合硅胶等。流动相常用水与甲醇,乙腈或四氢呋喃的混合溶剂。在反相色谱中极大的组分因K值较小先流出色谱柱,极性较小的组分后流出.流动相中有机溶剂的比例增加,流动相极性减小,洗脱力增强.反相色谱法是目前应用最广的高效液相色谱法。 三、高效液相色谱仪简介高效液相色谱仪主要由：输液系统进样系统色谱柱系统检测系统数据记录处理系统等组成。高效液相色谱仪流程图高效液相色谱仪流程图1 1 1 1贮液罐（滤棒，贮液罐（滤棒，贮液罐（滤棒，贮液罐（滤棒，可滤去颗粒状物质）可滤去颗粒状物质）可滤去颗粒状物质）可滤去颗粒状物质）2 2 2 2高压泵（输液泵）高压泵（输液泵）高压泵（输液泵）高压泵（输液泵）3 3 3 3进样装置进样装置进样装置进样装置4 4 4 4色谱柱色谱柱色谱柱色谱柱分离分离分离分离5 5 5 5检测器检测器检测器检测器分析分析分析分析6 6 6 6废液出口或组分废液出口或组分废液出口或组分废液出口或组分收集器收集器收集器收集器 7 7 7 7记录装置记录装置记录装置记录装置(一)输液泵 高效液相色谱的流动相采用高压泵输送,有不同类型的输液泵,按输液性质可分为恒压泵和恒流泵.目前使用较多的是柱塞式往复泵。(二)进样器 进样器是将试样送入色谱柱的装置.一般要求进样装置的密封性好,死体积小,重复性好,保证中心进样,进样时对色谱系统的压力,流量影响小。 (三)色谱柱 色谱柱是色谱分离的核心.为了保证色谱柱的柱效高,使用寿命长,一般使用由专业化工厂生产的商品柱.色谱柱管多由不锈钢制成,内装一定的固定相.色谱往长一般1030cm,内径25mm. 化学键合相是广泛使用的固定相,其中又以十八烷基硅烷键合硅胶的应用最为广泛。 (四)检测器样品经色谱柱分离后进入检侧器进行检测.按其适用范围检测器可分为通用型和专属型两大类,专属型检测器只能检测某些组分的某一性质,紫外检测器(UVD),荧光检测器(ED)属于这一类,它们只对有紫外吸收或荧光发射的组分有响应;通用型检测器检测的是一般物质均具有的性质,示差折光检测器(RID),蒸发光散射检测器(ELSD)等.液相色谱-质谱联用(LC-MS)则是用质谱作为高效液相色谱的检测器. (四)检测器 样品经色谱柱分离后进入检侧器进行检测.按其适用范围检测器可分为通用型和专属型两大类,专属型检测器只能检测某些组分的某一性质,紫外检测器(UVD),荧光检测器(ED)属于这一类,它们只对有紫外吸收或荧光发射的组分有响应;通用型检测器检测的是一般物质均具有的性质,示差折光检测器(RID),蒸发光散射检测器(ELSD)等.液相色谱-质谱联用(LC-MS)则是用质谱作为高效液相色谱的检测器。(五)数据记录处理和计算机控制系统 现代HPLC的特征是用微机控制仪器.HPLC仪器的中心计算机控制系统,即能做数据采集和分析工作,又能程序控制仪器的各个部件,还能在分析一个试样之后自动改变条件而进行下一个试样的分析,许多色谱仪的软件系统具有方法认证功能,使分析工作更加规范化. 高效液相色谱的特点高效液相色谱的特点高压压力可达150300 kg/cm2。色谱柱每米降压为75 kg/cm2以上。 高速流速为0.110.0 mL/min。 高效塔板数可达5000/米。在一根柱中同时分离成份可达100种。 高灵敏度紫外检测器灵敏度可达0.01ng。同时消耗样品少。 四、高效液相色谱法的应用1.在鉴别中的应用 在HPLC法中,保留时间与组分的结构和性质有关,是定性的参数,可用于药物的鉴别.如中国药典收载的药物头孢羟氨苄的鉴别项下规定:在含量测定项下记录的色谱图中,供试品主峰的保留时间应与对照品主峰的保留时间一致.头抱拉定,头孢噻酚钠等头孢类药物以及地西泮注射液,曲安奈德注射液等多种药物均采用HPLC法进行鉴别。 2.在杂质检查中的应用 HPLC分离效能高,灵敏,在药物的杂质检查中应用广泛.主要用于药物中有关物质的检查。“有关物质”是指药物中存在的合成原料,中间体,副产物,降解产物等物质,这些物质的结构和性质与药物相似,含量很低,只有采用色谱的方法才能将其分离并检测.若杂质是已知的,又有杂质的对照品,可用杂质对照品做对照进行检查.若杂质是未知的,可以采用主成分自身对照法自身对照法或峰面积归一化法峰面积归一化法进行检查。 面积归一化法面积归一化法测定供试品（或经衍生化处理的供试品）中各杂质及杂质的总量限度采用不加校正因子的峰面积归一法。计算各杂质峰面积及其总和，并求出占总峰面积的百分率。但溶剂峰不计算在内。色谱的记录时间应根据各品种所含杂质的保留时间决定，除另有规定外,可为该品种项下主成分保留时间的倍数。 主成分自身对照法主成分自身对照法 当杂质峰面积与成分峰面积相差悬殊时，采用主成分自身对照法。 在测定前，先按各品种项下规定的杂质限度，将供试品稀释成一定浓度的溶液作为对照溶液，进样，调节检测器的灵敏度或进样量，使对照溶液中的主成分色谱峰面积满足准确测量要求。然后取供试品溶液，进样，记录时间，除另有规定外，应为主成分保留时间的倍数。根据测得的供试品溶液的各杂质峰面积及其总和并和对照溶液主成分的峰面积比较，计算杂质限度。3.在含量测定中的应用 用高效液相色谱法侧定含量可以消除药物中的杂质,制剂中的附加剂及共存的药物对测定的干扰.中药材及其制剂组成复杂,基中不少有效成分的含量测定也越来越多地采用了高效液相色谱法.