第三章第三章 蛋白质蛋白质(Protein)(Protein)蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质( ( ( (protein)protein)protein)protein)是是由由氨氨基基酸酸为为单单位位以以酰酰胺胺键键( (肽肽键键) )连连接接起起来来的的一一类类含含氮氮的的生物大分子。生物大分子。蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质存存存存在在在在于于于于所所所所有有有有的的的的生生生生物物物物细细细细胞胞胞胞中中中中，是是是是生生生生活活活活细细细细胞胞胞胞中中中中数数数数量量量量、种种种种类类类类最最最最丰丰丰丰富富富富的的的的生生生生物物物物大大大大分分分分子子子子，构构构构成成成成生生生生物物物物体体体体最最最最基基基基本本本本的的的的结结结结构构构构物物物物质和功能物质。质和功能物质。质和功能物质。质和功能物质。蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质是是是是生生生生命命命命活活活活动动动动的的的的物物物物质质质质基基基基础础础础，它它它它参参参参与了几乎所有的生命活动过程与了几乎所有的生命活动过程与了几乎所有的生命活动过程与了几乎所有的生命活动过程。元元素素组组成成：所所有有蛋蛋白白质质都都含含有有 C C、H H、O O、N N 四四种种元元素素，大大多多数数蛋蛋白白质质还还含含有有少少量量的的 S S，有有些些蛋蛋白白质质还还含含有有一一些些其其它元素，如它元素，如 P P、FeFe、CuCu、MoMo、I I等。等。各各种种蛋蛋白白质质的的含含氮氮量量都都很很接接近近，都都在在16%16%左左右右，因因此此可可通通过过测测定定生生物物样样品品中中的的含含氮氮量量计计算算出出样样品品中中蛋蛋白白质质的的含含量量，1 1克氮就相当于克氮就相当于6.256.25克蛋白质。克蛋白质。10-5蛋白质化学F主要内容：主要内容：氨基酸的化学氨基酸的化学肽肽蛋白质的结构与功能蛋白质的结构与功能蛋白质的理化性质及其分离纯化蛋白质的理化性质及其分离纯化蛋白质化学F第一节第一节 氨基酸化学氨基酸化学蛋蛋白白质质用用H H+ +，OHOH- -或或酶酶彻彻底底水水解解，可可以以得得到到许许多多种种氨氨基基酸酸的的混混合合物物，氨氨基基酸酸是是构构成成蛋蛋白白质质的的基基本本单单位。位。 组组成成蛋蛋白白质质的的基基本本( (标标准准) )氨氨基基酸酸（amino amino acidacid，AaAa）有有2020种。种。这这些些氨氨基基酸酸中中，大大部部分分属属于于L-L- - -氨氨基基酸酸。其其中中，脯脯氨氨酸酸属属于于L-L- - -亚亚氨氨基基酸酸，而而甘甘氨氨酸酸则则属属于于 - -氨基酸。氨基酸。蛋白质化学F一、蛋白质一、蛋白质的基本单位的基本单位L-L- - -氨基氨基氨基氨基酸酸酸酸1. L-1. L- - -氨基氨基氨基氨基酸的结构通式及分子构型酸的结构通式及分子构型酸的结构通式及分子构型酸的结构通式及分子构型或或结构通式结构通式(投影式投影式)与羧基相邻的与羧基相邻的-碳原子上都有一个氨基，因而碳原子上都有一个氨基，因而称为称为-氨基酸氨基酸蛋白质化学F构构型型：分分子子中中各各原原子子或或基基团团之之间间的的连连接接方方式式称称为为分分子子的的构构型型。组组成成蛋蛋白白质质的的氨氨基基酸酸除除GlyGly以以外外都都有有手手性性碳碳原原子子，在在三三维维空空间间上上就就有有两两种种不不同同的排列方式，它们互为镜影，这两种不同的构型分别称为的排列方式，它们互为镜影，这两种不同的构型分别称为D-D-型和型和L-L-型。型。 L- -氨基酸的分子构型氨基酸的分子构型(configurition)蛋白质化学F蛋白质化学F2. 2. 基本氨基酸的分类、结构及代号基本氨基酸的分类、结构及代号 (1)(1)按按侧链侧链R R基的结构基的结构氨基酸的氨基酸的分类分类蛋白质化学F(2) (2) 按按侧链侧链R R基的极性基的极性蛋白质化学F氨基酸的结构及代号氨基酸的结构及代号: :(non-polar, hydrophobic)蛋白质化学F色氨酸色氨酸 tryptophan Trp(Try) W 5.89丝氨酸丝氨酸 serine Ser S 5.68酪氨酸酪氨酸 tyrosine Tyr Y 5.66半胱氨酸半胱氨酸 cysteine Cys C 5.07 蛋氨酸蛋氨酸 methionine Met M 5.74天冬酰胺天冬酰胺 asparagine Asn N 5.41谷氨酰胺谷氨酰胺 glutamine Gln Q 5.65苏氨酸苏氨酸 threonine Thr T 5.60(polar, uncharged)蛋白质化学F(acidic)(basic)蛋白质化学F 特殊氨基酸特殊氨基酸(Special amino acids) Gly无光学活性无光学活性(optically inactive) 蛋蛋 白白 质质 多多 肽肽 中中GlyGly残残基基的的存存在在将将增增加加其其结结构构区区域域 的的 柔柔 性性 ， 而而ProPro残残基基的的存存在在则则相相反反，将将会会增增加加其其结结构构区区域域的的刚性，刚性，蛋白质化学F具具环环式式结结构构的的亚亚氨氨基基酸酸(ring structure and imino acid) 特殊氨基酸特殊氨基酸(Special amino acids) Pro蛋蛋白白质质多多肽肽中中ProPro残残基基的的存存在在将将会会增增加加其其结结构构区区域域的的刚刚性性，而而GlyGly残残基基的的存存在在则则相相反反，将将增增加加其其结结构构区区域的柔性域的柔性蛋白质化学F具具有有活活性性的的巯巯基基 (active thiol)易易氧氧化化形形成成二二硫硫键键(disulfide bond), 可可 用用 作作 还还 原原 剂剂 ( reducing reagent) 特殊氨基酸特殊氨基酸(Special amino acids) Cys蛋白质化学F 特殊氨基酸特殊氨基酸(Special amino acids) His组组氨氨酸酸侧侧链链为为一一个个咪咪唑唑基基，在在酸酸碱碱催催化化中中起起重重要要作用作用蛋白质化学F特殊氨基酸特殊氨基酸(Special amino acids) Phe, Tyr 和和Trp蛋蛋白白质质分分子子中中Phe, Phe, TyrTyr和和TrpTrp残残基基的的存存在在使使得得蛋白质在近紫外区蛋白质在近紫外区(220-300(220-300nmnm) )有特征性吸收有特征性吸收蛋白质化学F3. 3. 蛋白质分子中蛋白质分子中不常见不常见不常见不常见( ( ( (非标准非标准非标准非标准) ) ) )的的的的L L L L- - - -氨基酸氨基酸氨基酸氨基酸在在少少数数蛋蛋白白质质中中分分离离出出一一些些不不常常见见的的氨氨基基酸酸，通通常常称称为为非非标标准准(non-standard)氨氨基基酸酸。这这些些氨氨基基酸酸都都是是由由相相应应的的基基本本(标标准准)氨氨基基酸酸衍衍生生而而来来的的。其其中中重重要要的的有有4-羟羟基基脯脯氨氨酸酸、5-羟羟基基赖赖氨氨酸酸、N-甲甲基基赖赖氨氨酸酸、3,5-二二碘碘酪酪氨氨酸酸和和硒硒代代半半胱胱氨氨酸酸等等。这些不常见蛋白质氨基酸的结构如下：这些不常见蛋白质氨基酸的结构如下：蛋白质化学F硒代半胱氨酸 (Selenocysteine)(4-hydroxyproline (Hpro)(5-hydroxylysine)(6-N-methyllysine)(Diiodinotyrosine) 蛋白质化学F二、天然的非蛋白质氨基酸二、天然的非蛋白质氨基酸在在细细胞胞内内已已发发现现的的非非蛋蛋白白组组成成成成分分的的氨氨基基酸酸有有300多多种种，尽尽管管它它们们不不是是蛋蛋白白质质的的构构成成成成分分，但具有广泛的生物学功能。但具有广泛的生物学功能。如在尿素循环中的关键代谢中间产物：L-瓜氨酸：瓜氨酸：H2N-C-NH-CH2-CH2-CH2-CH-COOONH3(Citrulline)L-鸟氨酸：鸟氨酸： H3N-CH2-CH2-CH2-CH-COONH3+(Ornithine)蛋白质化学F1. 氨基酸的氨基酸的一般物理性质一般物理性质 常见氨基酸均为无色结晶,其形状因构型而异(1) 溶溶解解性性：各各种种氨氨基基酸酸在在水水中中的的溶溶解解度度差差别别很很大大，并并能能溶溶解解于于稀稀酸酸或或稀稀碱碱中中，但但不不能能溶溶解解于于有有机机溶溶剂剂。通通常常酒酒精精能能把把氨氨基基酸从其溶液中沉淀析出。酸从其溶液中沉淀析出。 (2) 熔点：熔点：氨基酸的熔点极高，一般在氨基酸的熔点极高，一般在200以上。以上。(3) 味味感感：其其味味随随不不同同氨氨基基酸酸有有所所不不同同，有有的的无无味味、有有的的味味甜甜、有的味苦，谷氨酸的单钠盐有鲜味，是味精的主要成分。有的味苦，谷氨酸的单钠盐有鲜味，是味精的主要成分。(4) 旋旋光光性性：除除甘甘氨氨酸酸外外，氨氨基基酸酸都都具具有有旋旋光光性性，能能使使偏偏振振光光平平面面向向左左或或向向右右旋旋转转，左左旋旋者者通通常常用用（-）表表示示，右右旋旋者者用用（+)表示。表示。(5) 光光吸吸收收：构构成成蛋蛋白白质质的的20种种氨氨基基酸酸在在可可见见光光区区都都没没有有光光吸吸收收，但但在在远远紫紫外外区区(220nm)均均有有光光吸吸收收。在在近近紫紫外外区区(220-300nm)只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力。只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力。三三. 氨基酸的主要理化性质氨基酸的主要理化性质蛋白质化学F酪氨酸的酪氨酸的 max275nm， 275=1.4x103;苯丙氨酸的苯丙氨酸的 max257nm， 257=2.0x102;色氨酸的色氨酸的 max280nm， 280=5.6x103;蛋白质化学F2. 氨基酸的氨基酸的主要化学性质主要化学性质(1) 氨基酸的离解性质及等电点氨基酸的离解性质及等电点Brnsted的酸碱理论，即广义酸碱理论。的酸碱理论，即广义酸碱理论。HA A- + H +酸酸碱碱质子质子蛋白质化学F 氨基酸在水中的两性离子既能像酸一样放出质子，也能像碱一氨基酸在水中的两性离子既能像酸一样放出质子，也能像碱一样接受质子，氨基酸具有样接受质子，氨基酸具有酸碱性质酸碱性质，是一类两性电解质是一类两性电解质。As an acid（proton donor）：）：As a base（proton acceptor）：）：蛋白质化学F不同不同pH时氨基酸以不同的离子化形式存在：时氨基酸以不同的离子化形式存在： 正离子正离子两性离子两性离子负离子负离子 氨基酸所带静电荷为氨基酸所带静电荷为“零零”时，溶液的时，溶液的pH值称为该氨基值称为该氨基酸的等电点（酸的等电点（isoelectric point），），以以pI表示。表示。蛋白质化学F 实验证明在等电点时，氨基酸主要以两性离子形式存在，但也有少实验证明在等电点时，氨基酸主要以两性离子形式存在，但也有少量的而且数量相等的正、负离子形式，还有极少量的中性分子。量的而且数量相等的正、负离子形式，还有极少量的中性分子。 当溶液的当溶液的pH=pIpH=pI时，氨基酸主要从两性离子形式存在。时，氨基酸主要从两性离子形式存在。 pHpIpHpIpHpI时，氨基酸主要以负离子形式存在。时，氨基酸主要以负离子形式存在。 蛋白质化学F(a) 氨基酸的酸碱滴定曲线氨基酸的酸碱滴定曲线 Henderson-Hasselbalch方程方程pH=pKa + lg 质子受体质子受体 质子供体质子供体 酸碱滴定曲线酸碱滴定曲线等电点的计算等电点的计算 蛋白质化学F蛋白质化学F(b) 等电点的计算等电点的计算 中性氨基酸：以中性氨基酸：以GlyGly为例为例 H+2=K1K2pH=（pK1+pK2）/2pI=（pK1+pK2）/2pI =（2.34+9.60）/2=5.97GlyK1=Gly H+Gly+K2=Gly- H+GlypIpI时，时，Gly+ = Gly- Gly H+K1=Gly K2H+蛋白质化学F酸性氨基酸，以酸性氨基酸，以AspAsp为例：为例：Asp+Asp-Asp=Asp+蛋白质化学F碱性氨基酸，以碱性氨基酸，以Lys为例：为例：Lys+蛋白质化学F（2 2）氨基酸的化学反应）氨基酸的化学反应 -氨基参加的反应氨基参加的反应 （a a）成盐作用成盐作用 蛋白质化学F（b b）与与HNOHNO2 2的反应的反应蛋白质化学F（c c）与甲醛的反应与甲醛的反应 蛋白质化学F蛋白质化学F（d d）酰基化反应及常用的酰基化试剂酰基化反应及常用的酰基化试剂 酰氯：酰氯：苄氧酰氯（苄氧酰氯（Cbz-ClCbz-Cl）: :对甲苯磺酰氯对甲苯磺酰氯( (Tos-Cl)orTos-Cl)or5 5一二甲氨基萘一二甲氨基萘-1-1-磺酰氯磺酰氯(dansyl chloride, DNS): :叔丁氧酰氯叔丁氧酰氯( (Boc-Cl): Boc-Cl): 酸酐：酸酐：邻苯二甲酸酐：邻苯二甲酸酐：（R酰基）酰基）or蛋白质化学FCbz-ClCbz-氨基酸氨基酸举例举例1 1：氨基酸与氨基酸与苄氧酰氯（苄氧酰氯（Cbz-ClCbz-Cl）的反应的反应 蛋白质化学F氨基酸与氨基酸与 5 5一二甲氨基萘一二甲氨基萘-1-1-磺酰氯磺酰氯（dansyl chloride, DNS）的反应的反应 举例举例2 2：蛋白质化学F（e e）烃基化反应烃基化反应 ( (f) f) 与与2 2、4 4一二硝基氟苯的反应一二硝基氟苯的反应 2，4一二硝基氟苯一二硝基氟苯（R烃基）烃基）蛋白质化学FDNFBDNP-氨基酸（黄色）氨基酸（黄色）蛋白质化学F( (g) g) 与苯异硫氰酸（酯）的反应与苯异硫氰酸（酯）的反应 PITCPTC-氨基酸氨基酸PTH-氨基酸氨基酸蛋白质化学F-羧基参加的反应羧基参加的反应 （a a）成盐和成酯反应成盐和成酯反应 蛋白质化学F酰化氨基酸酰化氨基酸对硝基苯酚对硝基苯酚酰化氨基酸对酰化氨基酸对-硝基苯酯硝基苯酯（活化酯）（活化酯）（式中（式中Y酰基）酰基）蛋白质化学F（b b）成酰氯反应成酰氯反应 蛋白质化学F（c c）成酰胺反应成酰胺反应 体外：体外：体内：体内：Asp + NH4ATP酶酶Asn+蛋白质化学F（d d）脱羧基反应脱羧基反应 蛋白质化学F（e e）叠氮反应叠氮反应 蛋白质化学F-氨基和氨基和-羧基共同参加的反应羧基共同参加的反应 (a) 茚三酮反应茚三酮反应蛋白质化学F（b）成肽键成肽键 蛋白质化学F侧链侧链R R基参加的主要反应基参加的主要反应 (a) -S-S- -S-S-和和- -SHSH的氧化还原反应的氧化还原反应 R-SH：HS-CH2CH2OH 巯基乙醇（巯基乙醇（mercaptoethanol） HS-CH2COOH 巯基乙酸（巯基乙酸（mercaptoacetic acid） HS-CH2(CHOH)2-CH2SH二硫苏糖醇（二硫苏糖醇（dithiothreitol, DTT） 蛋白质化学F（b b）苯环的黄色反应苯环的黄色反应 phe+phe+少量浓少量浓H H2 2SOSO4 4+ +浓浓HNOHNO3 3 黄色黄色 TyrorTrp+ 浓浓HNO3 黄色黄色 （c c）酚基的酚基的MillonMillon反应（米伦氏反应）反应（米伦氏反应） HgNOHgNO3 3 Tyr+Tyr+Hg(NOHg(NO3 3) )2 2 红色红色 HNOHNO3 3 蛋白质化学Foror（d d）paulypauly反应反应 His + His + 重氮苯磺酸重氮苯磺酸 红色（棕红色）红色（棕红色） Tyr + Tyr + 重氮苯磺酸重氮苯磺酸 橘黄色橘黄色 （e e）FolinFolin一酚反应一酚反应 + +磷钼酸磷钼酸 TyrTyr磷钨酸磷钨酸 TrpTrp蓝色（钼蓝与钨蓝混合物）蓝色（钼蓝与钨蓝混合物） 蛋白质化学F四氨基酸分析分离四氨基酸分析分离 1 1分配层析法的一般原理：分配层析法的一般原理： 分配系数分配系数 Kd=CACBCA：一种物质在一种物质在A相（流动相）中的浓度相（流动相）中的浓度 CB：一种物质在一种物质在B相（固定相）中的浓度相（固定相）中的浓度 主要根据被分析的样品（如主要根据被分析的样品（如aaaa混合物）在两种互不相溶混合物）在两种互不相溶的溶剂中的溶剂中分配系数分配系数的不同而达到分离的目的，的不同而达到分离的目的， 蛋白质化学F逆流分溶（逆流分配）逆流分溶（逆流分配） 蛋白质化学F蛋白质化学F2 2纸层析纸层析 单向纸层析图单向纸层析图RfRf值值 蛋白质化学F双向纸层析图双向纸层析图 蛋白质化学F3 3薄层层析薄层层析 蛋白质化学F4 4离子交换层析离子交换层析 原理原理：分离氨基酸时，用离子交换树脂作为支持物，利用：分离氨基酸时，用离子交换树脂作为支持物，利用离离子交换树脂上的活性基团子交换树脂上的活性基团与与溶液中的离子溶液中的离子进行进行交换反应交换反应，由于各，由于各种离子交换能力不同，与树脂结合的牢固程度就不同，在洗脱过种离子交换能力不同，与树脂结合的牢固程度就不同，在洗脱过程中，各种离子以不同的速度移动，从而达到分离的目的。程中，各种离子以不同的速度移动，从而达到分离的目的。 这种分离主要与各种离子这种分离主要与各种离子所带电荷所带电荷有关，在电荷相同时，有关，在电荷相同时，与与极性，非极性极性，非极性有关。有关。 阳离子交换树脂：活性基团是酸性的阳离子交换树脂：活性基团是酸性的，如磺酸基，如磺酸基- -SOSO3 3H H强酸型）强酸型），羧基，羧基- -COOHCOOH（弱酸型）弱酸型） 阴离子交换树脂：阴离子交换树脂：活性基团是碱性的活性基团是碱性的，如季胺基，如季胺基- -N N+ +(CH(CH3 3) )3 3OHOH- - 蛋白质化学F5高效液相层析（高效液相层析（high performance (pressure) liguid chromatography, HPLC）HPLC的特点的特点: HPLC分离氨基酸的灵敏度高，可达到10-12mol水平 固相支持物颗粒小，比表面积大溶剂系统采用高压，流速快适于各种类型的支持物的柱层析蛋白质化学F（1 1）反相柱）反相柱（2 2）正向柱）正向柱 HPLC常用的层析柱：常用的层析柱：蛋白质化学F第二节第二节肽肽 (peptides)一、一、肽键肽键 (peptide bond)一个Aa的氨基与另一个Aa的羧基脱去一分子H2O形成的共价酰胺键。1. 定义定义：蛋白质化学F2. 2. 肽键的肽键的特点特点肽键的特点是氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的共轭作用。组成肽键的原子处于同一平面。肽键中的C-N键具有部分双键性质，不能自由旋转。在大多数情况下，以反式结构存在。在在细细胞胞内内环环境境条条件件下下，肽肽键键相相对对稳稳定定蛋白质化学F二、肽（二、肽（peptidespeptides） 1. 1. 几个相关的概念几个相关的概念肽肽是是由由两两个个或或两两个个以以上上的的氨氨基基酸酸通通过过肽肽键键连连接接而而形形成成的的化化合合物物。组成肽的氨基酸单元称为组成肽的氨基酸单元称为氨基酸残基氨基酸残基。肽与氨基酸残基：肽与氨基酸残基：由两个氨基酸残基组成的肽称为由两个氨基酸残基组成的肽称为二肽二肽(dipeptide)；由三个以上十个以由三个以上十个以下氨基酸残基组成的肽称为下氨基酸残基组成的肽称为寡肽寡肽(oligopeptide)；由多个氨基酸组成的由多个氨基酸组成的肽则称为肽则称为多肽多肽(polypeptide), 亦称多肽链亦称多肽链。二肽，寡肽与多肽：二肽，寡肽与多肽：蛋白质化学F通常在多肽链的一端含有一个游离的通常在多肽链的一端含有一个游离的 - -氨基，称为氨基，称为氨基端或氨基端或N-N-端端；在另一端含有一个游离的在另一端含有一个游离的 - -羧基，称为羧基，称为羧基端或羧基端或C-C-端端。N N端端氨基酸残基氨基酸残基氨基酸残基氨基酸残基C C端端肽链书写方式：肽链书写方式：N端端C端端 注注：肽链可以是链状、环状或分支状。：肽链可以是链状、环状或分支状。 肽链的肽链的N-N-端与端与C-C-端：端：氨基酸顺序：氨基酸顺序：在在多多肽肽链链中中，氨氨基基酸酸残残基基按按一一定定的的顺顺序序排排列列，这这种种排排列列顺顺序序称称为为氨氨基基酸酸顺顺序序，氨氨基基酸酸的的顺顺序序是是从从N-N-端端的的氨氨基基酸酸残残基基开开始始，以以C-C-端端氨基酸残基为终点的排列顺序。氨基酸残基为终点的排列顺序。蛋白质化学F上述五肽可简写表示为：上述五肽可简写表示为：Ser-Val-Tyr-Asp-GlnSer-Val-Tyr-Asp-Gln肽链的表示法(简写)蛋白质化学F多肽与蛋白质多肽与蛋白质蛋白质是由一条或多条多肽蛋白质是由一条或多条多肽(polypeptide)链以特殊方式结合而成的生物链以特殊方式结合而成的生物大分子。大分子。蛋白质与多肽并无严格的界线，通常是将分子量在蛋白质与多肽并无严格的界线，通常是将分子量在6000道尔顿以上的道尔顿以上的多肽称为蛋白质。多肽称为蛋白质。蛋白质分子量变化范围很大蛋白质分子量变化范围很大, 从大约从大约6000到到1000000道尔顿甚至更大。道尔顿甚至更大。蛋白质化学F2. 2. 肽的理化性质肽的理化性质 (1)(1)两性解离与等电点两性解离与等电点 肽与氨基酸一样具有酸、碱性质，它的解离主要取决于肽链的肽与氨基酸一样具有酸、碱性质，它的解离主要取决于肽链的末端氨基、末端羧基和侧链末端氨基、末端羧基和侧链R R基。基。 由于肽中由于肽中N N端自由氨基和端自由氨基和C C端自由羧基之间的距离比氨基酸中的端自由羧基之间的距离比氨基酸中的大，因此它们之间的静电引力较弱。肽中大，因此它们之间的静电引力较弱。肽中C C端端- -COOHCOOH的的pKpK略大于氨基略大于氨基酸中的酸中的pKpK值，值，pKpK1 1。N N端端- -NHNH+ +3 3的的pKpK略小于氨基酸中的略小于氨基酸中的pKpK值，值，pKpK2 2。R R基的基的pKpK变化不大。变化不大。 肽的等电点：肽所带净电荷为肽的等电点：肽所带净电荷为“零零”时，溶液的时，溶液的pHpH值。值。 蛋白质化学F例：已知末端例：已知末端-COOH，pK3.6，末端末端-NH3+pK8.0 -NH+3pK10.6。 计算计算Ala-Ala-Lys-Ala的等电点。的等电点。 pI=(8.010.6) /2 =9.3蛋白质化学F(2) (2) 肽的化学性质肽的化学性质 肽的化学性质与氨基酸相似，如两性解离、等电点等，但肽的化学性质与氨基酸相似，如两性解离、等电点等，但肽有肽有与氨基酸不同的特殊反应与氨基酸不同的特殊反应 （a）双缩脲反应双缩脲反应 （b）肽键的紫外吸收肽键的紫外吸收210230nm 双缩脲双缩脲 碱性碱性CuSO4溶液溶液 紫色紫色蛋白质化学F3. 3. 天然存在的某些活性肽天然存在的某些活性肽 (1) (1) 肌肽和鹅肌肽肌肽和鹅肌肽 肌肽（肌肽（carnosinecarnosine）:-Ala-His :-Ala-His 鹅肌肽（鹅肌肽（anserineanserine）：）：-Ala-1-Me-His -Ala-1-Me-His 蛋白质化学F(2) 谷胱甘肽谷胱甘肽(glutathione,GSH) 蛋白质化学FGSH过氧过氧化物酶化物酶H2O2 2GSH 2H2O GSSG GSH还原酶还原酶NADPH+H+ NADP+ As a reductant to protect nucleic acids and proteins from toxin by discharging free radical or H2O2蛋白质化学F(3) (3) 多肽抗菌素多肽抗菌素 蛋白质化学F(4) (4) 多肽激素多肽激素 种类较多，生理功能各异。种类较多，生理功能各异。多肽类激素主要见于多肽类激素主要见于垂体垂体及及下丘脑下丘脑分泌分泌的激素，的激素，如催产素（如催产素（9肽）、加压素（肽）、加压素（9肽）、促肾上腺皮肽）、促肾上腺皮质激素（质激素（39肽）、促甲状腺素释放激素（肽）、促甲状腺素释放激素（3肽）。肽）。 神经肽主要与神经信号转导作用相关，包括脑啡神经肽主要与神经信号转导作用相关，包括脑啡肽（肽（5肽）、肽）、 -内啡肽（内啡肽（31肽）、强啡肽（肽）、强啡肽（17肽）肽）等。等。蛋白质化学F垂体后叶激素如催产素和加压素蛋白质化学F促甲状腺素释放激素促甲状腺素释放激素(thyrotropin-release hormone，TRH )如由下丘脑分泌的激素之一如由下丘脑分泌的激素之一 促甲状腺素释放激素促甲状腺素释放激素蛋白质化学F(5) (5) 神经肽神经肽甲硫氨酸脑啡肽甲硫氨酸脑啡肽Tyr-Gly-Gly-phe-Met 亮氨酸脑啡肽亮氨酸脑啡肽Tyr-Gly-Gly-phe-Leu 功能：镇痛功能：镇痛 例如脑啡肽例如脑啡肽 ( (enkephalin)enkephalin)： Responsible for signal transduction (信号转导信号转导) in neurotransmission 脑脑啡啡肽肽(enkephalin)；内内啡啡肽肽(Endorphin)；强强啡啡肽肽(dynorphin)； P物物质质 (Substance P)；神神经经肽肽Y (neuropeptide Y)蛋白质化学F4 4 肽的人工合成肽的人工合成(1) (1) 概况概况 20世纪初世纪初 E. Fischer：以氨基酸为原料合成了一个十八肽。以氨基酸为原料合成了一个十八肽。 1932年年 M.Bergman: Cbz 1953年年 美国美国 Du.Vigneaud：生物活性的催产素生物活性的催产素 1965年年 中国：生物活性的牛胰岛素中国：生物活性的牛胰岛素 1962年年 美国美国Merrifield：固相合成法固相合成法 蛋白质化学F(2) (2) 合成方法合成方法 （a a）液相合成法液相合成法 用缩合剂的方法用缩合剂的方法 蛋白质化学F氨基保护基氨基保护基Y Y：CbzCbz、BocBoc、TosylTosyl COCOSOOH3C苄氧甲酰基苄氧甲酰基(CGZ)：叔丁氧甲酰基叔丁氧甲酰基(BOC)：对甲苯磺酰基对甲苯磺酰基(Tosyl)：蛋白质化学F甲酯（甲酯（OMeOMe）：）：CHCH3 3O-O- 乙酯（乙酯（OEtOEt）：）：C C2 2H H5 5O-O- 苄酯（苄酯（OBzlOBzl）：）： 叔丁酯（叔丁酯（OBuOBut t）：）： 羧基保护基羧基保护基Z Z：蛋白质化学F缩合剂：缩合剂：N，N一二环己基碳二亚胺一二环己基碳二亚胺（N，N-dicyclohexyl carbodiimide，缩写缩写DCCI或或DCC） 蛋白质化学F脱去氨基保护基的方法：脱去氨基保护基的方法：Boc用酸，如用酸，如50%三氟醋酸脱去三氟醋酸脱去Tosyl用钠氨还原法用钠氨还原法 脱去羧基保护基的方法：脱去羧基保护基的方法：苄酯（苄酯（OBzl）用催化加氢法用催化加氢法 叔丁酯（叔丁酯（OBut）用酸，如用酸，如50%三氟醋酸脱去三氟醋酸脱去 Cbz用催化加氢法用催化加氢法 甲酯或乙酯用皂化法甲酯或乙酯用皂化法 蛋白质化学F 将参与肽键合成的羧基和氨基活化将参与肽键合成的羧基和氨基活化 羧基的活化羧基的活化: : 氨基的活化：氨基的活化： 接肽时加入有机碱如三乙胺或接肽时加入有机碱如三乙胺或KHCOKHCO3 3等，保证氨基处于等，保证氨基处于自由状态，氨基即活化。自由状态，氨基即活化。 早期用酰氯，但反应太激烈，后来采用叠氮法，而现早期用酰氯，但反应太激烈，后来采用叠氮法，而现在用了最多的是在用了最多的是活化酯法活化酯法和和混合酸酐混合酸酐法。法。 蛋白质化学FBOCBOCBOCBOCBOCAmino acid protected by t-butyloxycarboxyl (BOC)(b) (b) 固相合成法固相合成法 蛋白质化学F一、蛋白质的分类一、蛋白质的分类 （一）根据蛋白质分子的形状（一）根据蛋白质分子的形状1 1球状蛋白质（球状蛋白质（globular proteinglobular protein）2 2纤维状蛋白质（纤维状蛋白质（fibrous proteinfibrous protein）第三节第三节 蛋白质的结构与功能蛋白质的结构与功能蛋白质化学F（二）根据组成和溶解度（二）根据组成和溶解度1单纯蛋白质（单纯蛋白质（simple protein）: 也称简单蛋白质，完全由氨基酸组也称简单蛋白质，完全由氨基酸组 成的蛋白质。成的蛋白质。单纯蛋白质的分类（根据溶解度的不同）单纯蛋白质的分类（根据溶解度的不同） (1) 清蛋白清蛋白(albumin)：溶于水及稀盐、稀酸或稀碱溶液。如血清清蛋白。溶于水及稀盐、稀酸或稀碱溶液。如血清清蛋白。 (2) 球蛋白球蛋白(globulin)：不溶于水而溶于稀盐溶液，如血清球蛋白。不溶于水而溶于稀盐溶液，如血清球蛋白。 (3) 谷蛋白谷蛋白(glutelin)：不溶于水、醇及中性盐溶液，但溶于稀酸、稀碱，不溶于水、醇及中性盐溶液，但溶于稀酸、稀碱， 如米谷蛋白。如米谷蛋白。 (4) 谷醇溶蛋白谷醇溶蛋白(prolamine)：不溶于水，但溶于不溶于水，但溶于70%80%乙醇，如玉米乙醇，如玉米 醇溶蛋白。醇溶蛋白。 (5) 组蛋白组蛋白(histone)：溶于水及稀酸溶液，分子中含溶于水及稀酸溶液，分子中含Arg、Lys 较多较多,呈呈 （弱）碱性，如小牛胸腺组蛋白。（弱）碱性，如小牛胸腺组蛋白。 (6) 鱼精蛋白鱼精蛋白(protamine)：溶于水及稀酸溶液，分子中含碱性氨基酸特溶于水及稀酸溶液，分子中含碱性氨基酸特 别多，呈（强）碱性，如鲑精蛋白。别多，呈（强）碱性，如鲑精蛋白。 (7) 硬硬蛋蛋白白(scleroprotein)：不不溶溶于于水水、盐盐、稀稀酸酸、稀稀碱碱溶溶液液。如如胶胶原原 蛋白、角蛋白、丝心蛋白、弹性蛋白等。蛋白、角蛋白、丝心蛋白、弹性蛋白等。 蛋白质化学F2结合蛋白质（结合蛋白质（conjugated protein）：）：亦称复合蛋白质，亦称复合蛋白质， 由蛋白质和非蛋白质两部分组成。由蛋白质和非蛋白质两部分组成。 结合蛋白质的分类（根据非蛋白质即辅基的不同）结合蛋白质的分类（根据非蛋白质即辅基的不同） (1) 糖蛋白（糖蛋白（glycoprotein）：）：含糖类，如胶原蛋白。含糖类，如胶原蛋白。 (2) 脂蛋白（脂蛋白（lipoprotein）：）：含脂类，如血浆脂蛋白。含脂类，如血浆脂蛋白。 (3) 核蛋白（核蛋白（nucleoprotein）：）：含核酸，如核糖体。含核酸，如核糖体。 (4) 磷蛋白（磷蛋白（phosphoprotein）：）：含磷酸，如酪蛋白。含磷酸，如酪蛋白。 (5) 金属蛋白（金属蛋白（metalloprotein）：）：含金属，如铁蛋白含含金属，如铁蛋白含Fe。 (6) 血红素蛋白（血红素蛋白（hemoprotein）：）：辅基为血红素，如血红蛋白。辅基为血红素，如血红蛋白。 (7) 黄素蛋白（黄素蛋白（flavoprotein）：）：辅基为黄素（辅基为黄素（FAD或或FMN），）， 如琥珀酸脱氢酶（含如琥珀酸脱氢酶（含FAD）。）。 蛋白质化学F（三）根据功能（三）根据功能 1.非结构蛋白质非结构蛋白质包包括括酶酶、激激素素蛋蛋白白、运运输输蛋蛋白白（转转运运蛋蛋白白）、贮贮存存蛋蛋白白、运运动动蛋蛋白白、保保护护或或防防御御蛋蛋白白、受受体体蛋蛋白白、控控制制生生长长和和分分化化蛋蛋白白、毒毒蛋蛋白白、膜蛋白等。膜蛋白等。 2.结构蛋白质结构蛋白质对生物体起支持和保护作用，主要指硬蛋白包括胶原蛋白、角蛋对生物体起支持和保护作用，主要指硬蛋白包括胶原蛋白、角蛋白、丝蛋白、弹性蛋白等。白、丝蛋白、弹性蛋白等。 蛋白质化学F 为了对蛋白质结构叙述的方便，人为地将蛋白质的结构分为为了对蛋白质结构叙述的方便，人为地将蛋白质的结构分为一一级结构、二级结构、三级结构和四级结构级结构、二级结构、三级结构和四级结构。 蛋白质的蛋白质的一级结构一级结构又称又称初级结构初级结构，二级结构、三级结构、四二级结构、三级结构、四级结构级结构的三度空间排列称蛋白质的的三度空间排列称蛋白质的空间结构、高级结构、三维结空间结构、高级结构、三维结构或构象。构或构象。 二、蛋白质的结构二、蛋白质的结构 蛋白质化学F 随着蛋白质化学研究的进展，认为在二级结构和三级结随着蛋白质化学研究的进展，认为在二级结构和三级结构之间还可划分构之间还可划分超二级结构超二级结构和和结构域结构域两个层次，所以蛋白质两个层次，所以蛋白质的结构层次为：的结构层次为：一级结构一级结构二级结构二级结构超二级结构超二级结构结构域结构域三级结构三级结构四级结构四级结构蛋白质化学F（一）蛋白质的一级结构（一）蛋白质的一级结构（primary structure） 1定义：定义：蛋白质的一级结构是指蛋白质多肽链中氨基酸的线性排蛋白质的一级结构是指蛋白质多肽链中氨基酸的线性排列顺序（列顺序（sequence）。 氨氨基基酸酸顺顺序序书书写写时时，从从 N- -末末端端(N-terminus) 至至 C- -末末端端 (C-terminus).肽肽键键(peptide bond)和和二二硫硫键键(disulfide bond) 均属于蛋白质一级结构均属于蛋白质一级结构.蛋白质化学F2 2蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定 序列测定前的准备工作：序列测定前的准备工作：样品的纯度样品的纯度相对分子质量相对分子质量肽链的数目肽链的数目氨基酸组成氨基酸组成一级结构的测定主要用一级结构的测定主要用小片段重叠法小片段重叠法原理：原理：蛋白质化学FAnalysis of aa sequence in the polypeptide (protein sequencing)Sanger.1953, insulin Nobel prizeMajor step: purification, disulfide bond break(single chain)1.HCl degradation(6N, 110,180C,36h), aa composition, aa seperation by ion exchange chromatography.2.N-terminal(DNP, Dansyl-Cl), C-terminal (carboxylase) chemical method, enzymetic method3.Peptide chain peptide fragment Enzyme. Trypsin (Lys. Arg), Chymotrypsin(Phe, Tyr, Trp), BrCN(Met) Seperation4.Sequencing aa of peptide fragment Edman reation (degradation, phenlythisoctanate, 异硫氰酸苯脂）蛋白质化学FAa sequencing苯乙内酰硫脲氨基酸蛋白质化学F（1 1）肽链的拆开和分离与纯化）肽链的拆开和分离与纯化 共价键：共价键： 主要是二硫键折分主要是二硫键折分分离纯化：分离纯化： 采用还原法或氧化法采用还原法或氧化法序列测定步骤与方法序列测定步骤与方法 Dialysis (透析透析)Acetone precipitation and salt precipitation (沉淀沉淀)Electrophoresis (电泳电泳)Chromatography (层析层析)Ultracentrifugation (超离心超离心)蛋白质化学F（2）末端分析：包括）末端分析：包括N端分析，端分析，C端分析端分析 N端分析方法端分析方法 二硝基氟苯法（二硝基氟苯法（DNP法、法、DNFB法或法或FDNB法）法） 蛋白质化学F 丹磺酰氯法（丹磺酰氯法（DNS法）法） 蛋白质化学F 苯异硫氰酸苯异硫氰酸(酯酯)法（法（PITC法、法、PTC法、法、PTH法、法、Edman降解法降解法 ） 蛋白质化学F 氨肽酶（氨肽酶（aminopeptidase, Apase）法法 AlaValGly蛋白质化学F亮氨酸氨肽酶（亮氨酸氨肽酶（Leucine amino peptidase, LAP）专一性专一性:A=非极性氨基酸时非极性氨基酸时 快快A=其它氨基酸时其它氨基酸时 慢慢A BN端端A=Leu时时 最快最快蛋白质化学FC端分析端分析 硼氢化锂还原法硼氢化锂还原法 蛋白质化学F 肼解法：也称联氨法肼解法：也称联氨法 蛋白质化学F 羧肽酶（羧肽酶（carboxypeptidase, Cpase）法法 蛋白质化学F4 4种羧肽酶的来源和专一性种羧肽酶的来源和专一性 羧肽酶羧肽酶来源来源专一性专一性CpA胰脏胰脏能能释释放放除除pro、Arg和和Lys以以外外的的所有所有C端氨基酸端氨基酸CpB胰脏胰脏主要水解主要水解C端为端为Arg或或Lys的肽键的肽键CpC植物或微生物植物或微生物相相当当广广泛泛，几几乎乎能能释释放放C端端的的所所有氨基酸有氨基酸CpY面包酵母面包酵母可释放可释放C端所有氨基酸端所有氨基酸蛋白质化学F（3）肽链的氨基酸组成分析）肽链的氨基酸组成分析 酸水解：通常用酸水解：通常用6Mol/L HClHPLC分析分析Aa组成组成蛋白质化学F（4）肽链的部分水解）肽链的部分水解 化学方法：化学方法： 溴化氰（溴化氰（CNBr）裂解法裂解法: 蛋白质化学F酶解方法酶解方法 Cleavage reagent (裂解剂)Cleavage site (裂解位点)Trypsin (胰蛋白酶)Lys, Arg (C)Chymotrypsin (胰凝乳蛋白酶)Phe, Tyr, Trp (C)弹性蛋白酶Ala, Gly, Ser, Val (C)胃蛋白酶Phe, Trp, Tyr (N)Staphylococcus aureusGlu (C)Cyanogen bromide (溴化氰)Met (C)Hydroxylamine (羟胺)AsnGly蛋白质化学F（5 5）肽段的分离和氨基酸序列测定）肽段的分离和氨基酸序列测定 EdmanEdman降解降解（苯异硫氰酸酯法）苯异硫氰酸酯法）氨基酸顺序分析法实际上也是一氨基酸顺序分析法实际上也是一种种N-N-端分析法。此法的特点是能够不断重复循环，将肽链端分析法。此法的特点是能够不断重复循环，将肽链N-N-端端氨基酸残基逐一进行标记和解离。氨基酸残基逐一进行标记和解离。蛋白质化学F（6 6）找重叠肽从而推断整个肽链的氨基酸序列）找重叠肽从而推断整个肽链的氨基酸序列 蛋白质化学F（7 7）二硫键位置的确定）二硫键位置的确定 对角线电泳对角线电泳 （8 8）酰胺基位置的确定）酰胺基位置的确定 蛋白质化学FAa composition analysisResult:A 5, C 2, D 3, E 0, F 1, G 3, H 2, I 3,K 2, L 2, M 2, N 2, P 3, Q 1, R 1, S 2, T1, V 1, W 2, Y 0 Conclusion:Polypeptide has 38 Aa; Trypsin will cleave at one R(Arg) and two K(Lys), to give four fragments. Cyannogen bromide will cleave at two M(Met) to give three fragmentsTreat with FDNB, hydrolyze, separate Aa2,4-dinitrophenyl-Asn detectedN (Asn) is amino-terminal residuesSSCleave with cyanogen bromide, separate fragmentsC-1: NGAAWHDFNPIDPRGASMC-2: TKQCVHSDC-3: ALIKWLIACGPMC-3 overlap with T-1 and T-4, allowing them to be orderedSequence on sequencerSequence establishedNGAAWHDFNPFDPRGASMALIKWLIACGPMTKQCVHSDT-2T-1T-4T-3C-1C-3C-2(C)-S-S-(b)HSSHT-1: GASMALIKT-2: NGAAWHDFNPIDPRT-3: QCVHSDT-4: WLIACGPMTKT-2 placed at amino-terminus because it begins with N(Asn); T-3 place at carbooxyl terminus because it does not end with R(Arg) or K(Lys).Cleave with trypsin,separate fragmentsSequence on sequencer蛋白质化学F3. 根据根据DNA序列推测蛋白质氨基酸序列序列推测蛋白质氨基酸序列（Deduction from DNA sequence）Isolate the genes encoding the proteinDNA sequencingmRNA sequencingDedermine the AA sequence according to the 3-letter codons蛋白质化学F4 4蛋白质序列数据库蛋白质序列数据库 (1) PIR（Protein Information Resource）数据库数据库 (2) SWISS-PROT数据库数据库 蛋白质化学F（二）蛋白质的三维结构（二）蛋白质的三维结构1.1.蛋白质的二级结构蛋白质的二级结构 一一条条多多肽肽链链中中相相邻邻氨氨基基酸酸残残基基在在空空间间上上的的有有规规则则的的、重重复复的的排排列列蛋蛋白白质质的的二二级级结结构构。(refers to regular, recurring arrangements in space of adjacent amino acid residues in a peptide chain)Repeated connection of N(-H), C , and C(=O)H-bond formation Without including side chains -helix ( -螺旋螺旋) -pleated sheet ( -折叠折叠) -turn ( -bend) ( -转角转角)Random coil (无规则卷曲无规则卷曲)定义：定义：蛋白质化学F肽单元肽单元(酰胺平面或肽键平面酰胺平面或肽键平面)在肽链中每在肽链中每6个原了个原了C -C(=O)-N(-H)-C 构成一个构成一个肽单肽单元元 Peptide unit plane can rotate freely around C -C and C -N bonds, namely, the torsion angles (平平面面转转角角) and 蛋白质化学FPeptide unit is planar and rigidC=O and N-H groups are in trans conformationPeptide unit plane can rotate freely around C -C and C -N bonds, namely, the torsion angles (平平面面转角转角) and 酰胺平面的特性酰胺平面的特性Both and are defined as 0o, in the conformation in which the two peptide bonds connected to a single C are in the same plane(连连接接在在同同一一个个C 原原子子上上的的两两个个肽肽键键平平面面处处在在同同一一平平面面时时定定义义 和和 均均为零度为零度)蛋白质化学F 多肽链的主链由许多酰胺平面组成，平面之间以多肽链的主链由许多酰胺平面组成，平面之间以 碳原子碳原子相隔。相隔。和和这一对两面角决定了相邻两个酰胺平面的相对位这一对两面角决定了相邻两个酰胺平面的相对位置，也就决定了肽链的构象。置，也就决定了肽链的构象。 蛋白质化学F(1) -helix ( -螺旋螺旋) 1950年美国年美国Pauling等人在研究纤维状蛋白质时，提出了等人在研究纤维状蛋白质时，提出了-螺旋，螺旋，后来发现在球状蛋白质分子中也存在后来发现在球状蛋白质分子中也存在-螺旋。螺旋。 蛋白质化学F 蛋蛋白白质质多多肽肽链链像像螺螺旋旋一一样样盘盘曲曲上上升升，每每3.63.6个个氨氨基基酸酸残残基基螺螺旋旋上上升升一一圈圈，每每圈圈螺螺旋旋的的高高度度为为0.540.54nmnm，每每个个氨氨基基酸酸残残基基沿沿轴轴上上升升0.150.15nmnm，螺螺旋旋上上升升时时，每个残基沿轴旋转每个残基沿轴旋转100100。 在同一肽链内相邻的螺圈之在同一肽链内相邻的螺圈之间形成氢链。间形成氢链。 - -螺螺旋旋有有右右手手螺螺旋旋和和左左手手螺螺旋旋之之分分，天天然然蛋蛋白白质质绝绝大大部部分分是是右右手手螺螺旋旋，到到目目前前为为止止仅仅在在嗜嗜热热菌菌蛋蛋白白酶酶中中发发现现了了一一段段左手螺旋。左手螺旋。 - -螺旋结构的要点如下：螺旋结构的要点如下： 左手和右手螺旋左手和右手螺旋蛋白质化学F -螺旋的稳定性主要靠氢键来维持。螺旋的稳定性主要靠氢键来维持。 The -CO group of peptide unit n is H-bonded to the -NH group of peptide unit (n+3).蛋白质化学F一些侧链基团虽然不参与螺旋，但他们可影响一些侧链基团虽然不参与螺旋，但他们可影响 -螺旋的稳定性螺旋的稳定性 在多肽链中连续的出现带同种电荷的极性氨基酸，在多肽链中连续的出现带同种电荷的极性氨基酸， -螺旋就不稳定螺旋就不稳定 在多肽链中只要出现在多肽链中只要出现pro， -螺旋就被中断，产生一个弯曲（螺旋就被中断，产生一个弯曲（bend）或结节（或结节（kink） Gly的的R基基太太小小，难难以以形形成成 -螺螺旋旋所所需需的的两两面面角角，所所以以和和Pro一一样样也也是螺旋的最大破坏者是螺旋的最大破坏者 肽肽链链中中连连续续出出现现带带庞庞大大侧侧链链的的氨氨基基酸酸如如Ile，由由于于空空间间位位阻阻，也也难难以以形成形成 -螺旋螺旋 在蛋白质的在蛋白质的-螺旋中若螺旋中若N端为带负电荷的氨基酸有利于中和端为带负电荷的氨基酸有利于中和N端端+，因而使，因而使其其-螺旋稳定。螺旋稳定。蛋白质化学F(2) (2) - Sheet (-折叠折叠) ) 也是也是paulingpauling等人提出来的，它是等人提出来的，它是与与 - 螺旋完全不同的一种结构。螺旋完全不同的一种结构。蛋白质化学FHO -折叠主链骨架以一定的折叠形式形成一个折叠的片层。折叠主链骨架以一定的折叠形式形成一个折叠的片层。 在两条相邻的肽链之间形成氢链。在两条相邻的肽链之间形成氢链。蛋白质化学F -折叠有平行折叠有平行(parallel)和反平行和反平行(antiparallel)的两种形式的两种形式: 每一个氨基酸在主轴上所占的距离，平行的是每一个氨基酸在主轴上所占的距离，平行的是0.3250.325nmnm，反平反平 行的是行的是0.350.35nmnm。 蛋白质化学F(3) -turn -turn ( (-转角转角 ) ) -转角是指蛋白质分子的多肽链经常出现转角是指蛋白质分子的多肽链经常出现180180的回折，在回折角上的回折，在回折角上的结构就称的结构就称-转角，也称发夹结构，或称转角，也称发夹结构，或称U U形转折。由第一个氨基酸残形转折。由第一个氨基酸残基的基的C=OC=O与第四个氨基酸残基的与第四个氨基酸残基的NHNH之间形成氢键。之间形成氢键。Gly and Pro residuesoften occur in -turn蛋白质化学F没没有有一一定定规规律律的的松松散散肽肽链链结结构构，但但仍仍是是紧紧密密有有序序的的稳稳定定结结构构，通通过过主主链链间间及及主主链链与与侧侧链链间间氢氢键键维维持持其其构构象象不不同同的的蛋蛋白白质质，自自由由回回转转的的数数量量和和形形式式各不相同分两类：各不相同分两类：（）自由回转（）自由回转 连接条带连接条带 紧密环如紧密环如环环 环环蛋白质化学FSide chains and secondary structure Shape: Pro having a rigid ring ( helix disrupter)Size: -sheet need small side chain; Leu, Ile, Trp, and Asn having bulky sides (hard to form helix)Charge: too many charged AAs in a short region of one peptide repel each other (hard to form helix) 蛋白质化学F在在蛋蛋白白质质分分子子中中，由由若若干干相相邻邻的的二二级级结结构构单单元元组组合合在在一一起起，彼彼此此相相互互作作用用，形形成成有有规规则则的的、在在空空间间上上能能辨辨认认的的二二级级结结构构组组合合体体。几几种种类类型型的的超超二二级级结结构构：； Supersecondary Strructure and Domain(超二级结构和结构域超二级结构和结构域)(1) Supersecondary Structure超超二二级级结结构构在在结结构构层层次次上上高高于于二二级级结结构构，但但没没有有聚聚集集成成具具有有功功能能的的结结构域构域蛋白质化学F两个两个聚集体连在一起形成聚集体连在一起形成 结构，结构，称称Rossmann折叠折叠Rossmann Sheet (折叠折叠)Rossmann折叠折叠蛋白质化学F结构域通常是几个超二级结构的组合，对于较小的蛋白质分子，结构域通常是几个超二级结构的组合，对于较小的蛋白质分子，结构域与三级结构等同，即这些蛋白为单结构域。结构域与三级结构等同，即这些蛋白为单结构域。结构域一般由结构域一般由100200 个氨基酸残基组成，但大小范围可达个氨基酸残基组成，但大小范围可达 40400 个残基。氨基酸可以是连续的，也可以是不连续的个残基。氨基酸可以是连续的，也可以是不连续的结构域之间常形成裂隙，比较松散，往往是蛋白质优先被水解结构域之间常形成裂隙，比较松散，往往是蛋白质优先被水解的部位。酶的活性中心往往位于两个结构域的界面上的部位。酶的活性中心往往位于两个结构域的界面上结构域之间由结构域之间由“铰链区铰链区”相连，使分子构象有一定的柔性，通相连，使分子构象有一定的柔性，通过结构域之间的相对运动，使蛋白质分子实现一定的生物功能。过结构域之间的相对运动，使蛋白质分子实现一定的生物功能。在蛋白质分子内，结构域可作为结构单位进行相对独立的运动，在蛋白质分子内，结构域可作为结构单位进行相对独立的运动，水解出来后仍能维持稳定的结构，甚至保留某些生物活性水解出来后仍能维持稳定的结构，甚至保留某些生物活性（）（）Domain (结构域结构域)结结构构域域是是 1970年年Edelman提提出出的的，它它是是指指在在较较大大的的球球状状蛋蛋白白质质分分子子中中，多多肽肽链链往往往往形形成成几几个个紧紧密密的的球球状状构构象象，彼彼此此分分开开，以以松松散散的肽链相连，此球状构象就是结构域。的肽链相连，此球状构象就是结构域。蛋白质化学F 对那些较小的蛋白质分对那些较小的蛋白质分子来说，结构域和三级结构子来说，结构域和三级结构往往是一个意思，也就是说往往是一个意思，也就是说是单结构域的。一般来说，是单结构域的。一般来说，大的蛋白质分子可以由大的蛋白质分子可以由2 2个或个或更多个结构域组成。更多个结构域组成。 蛋白质化学F结结构构域域有有时时也也称称功功能能域域，功功能能域域是是指指有有功功能能的的部部分分功功能能域域可可以以是是一一个个结结构构域域，也也可可以以是是两两个个或或两两个个以以上上的的结结构构域组成。域组成。 从从动动力力学学的的角角度度耒耒看看，一一条条长长的的多多肽肽链链先先折折叠叠成成几几个个相相对对独独立立的的区区域域，再再缔缔合合成成三三级级结结构构要要比比直直接接折折叠叠成成三三级级结构更合理。结构更合理。从从功功能能的的角角度度耒耒看看，酶酶蛋蛋白白的的活活性性中中心心往往往往位位于于结结构构域域之之间间，因因为为连连接接各各个个结结构构域域的的常常常常是是一一条条松松散散的的肽肽链链，使使结结构构域域在在空空间间上上摆摆动动比比较较自自由由，容容易易形形成成适适合合底底物物结结合的空间。合的空间。蛋白质化学FMethyl-accepting chemotaxin蛋白质化学FProtein structure Domains, motifs and familiesDomains: structurally independent units of many proteins, connected by sections with limited higher order structure within the same polypeptide. (Figure) They can also have specific function such as substrate binding蛋白质化学FStructural motifs: Groupings of secondary structural elements that frequently occur in globular proteinsOften have functional significance and represent the essential parts of binding or catalytic sites conserved among a protein family motif蛋白质化学FProtein families: structurally and functionally related proteins from different sourcesThe primary structures of c-type cytochromes from different organismsMotifMotif蛋白质化学FThe tertiary structures of the above c-type cytochromesCys, Met and His side chains covalently linked to the heme to the proteinDomain蛋白质化学F3. Tertiary Structures (三级结构三级结构)Factors affecting the 3D structurehydrophobic interaction (疏水作用疏水作用)ionic interaction (离子作用离子作用)hydrogen bonds (氢键氢键)van der Waals force (范德华力范德华力)The relative spatial position of all residues of a protein, i.e., the three-dimensional ( (3D) )arrangement of all atoms(1)(2)蛋白质化学Fa. Hydrophobic interactionNonpolar molecules tend to cluster together in water, that is, aqueous environment tends to squeeze nonpolar molecules together. 蛋白质化学FA charged group is able to attract an opposite charged group. The force is given by Coulombs lawb. Ionic interaction蛋白质化学Fc. Hydrogen bondA hydrogen atom is shared by two other atoms. H-donor( (供供体体) ): the atom to which H atom is more tightly attached, and the other is H-acceptor( (受体受体) ). 蛋白质化学FAn asymmetric electronic charge around an atom causes a similar asymmetry around its neighboring atoms. The attraction between a pair of atoms increases as they come closer, until they are repelled by van der Waals contact distance. d. van der Waals force 蛋白质化学FInteractions stabilizing proteins 蛋白质化学F1963年年Kendrew等通过鲸肌红蛋白的等通过鲸肌红蛋白的x-射线衍射分析，测得射线衍射分析，测得了它的空间结构。了它的空间结构。 (3) 例子例子蛋白质化学FRibonuclease( (核酸酶核酸酶) )蛋白质化学F Rhodopsin( (视紫红质视紫红质) )蛋白质化学F 从目前对球状蛋白质二、三级结构研究的资料来看，从目前对球状蛋白质二、三级结构研究的资料来看，它们有一些共同的特点：它们有一些共同的特点： (1) 在球状蛋白质分子中在球状蛋白质分子中,一条多肽链往往通过一部分一条多肽链往往通过一部分-螺旋，螺旋， 一部分一部分-折叠，一部分折叠，一部分-转角和无规卷曲等使肽链折叠转角和无规卷曲等使肽链折叠 盘绕成近似盘绕成近似球状球状的构象。的构象。(2) 球状蛋白质的大多数极性侧链总是暴露在分子表面形球状蛋白质的大多数极性侧链总是暴露在分子表面形成亲成亲 水面水面，而大多数非极性侧链总是埋在分子内部形成，而大多数非极性侧链总是埋在分子内部形成疏水核疏水核。 (3) 球状蛋白质的表面往往有内陷的空穴，空穴周围有许多球状蛋白质的表面往往有内陷的空穴，空穴周围有许多疏疏 水侧链，是水侧链，是疏水区疏水区，这空穴往往是，这空穴往往是酶的活性部位或蛋白质酶的活性部位或蛋白质 的功能部位的功能部位。蛋白质化学F4.4.Quaternary structure (四级结构四级结构) ) 四四级级结结构构是是指指蛋蛋白白质质的的亚亚基基聚聚合合成成大大分分子子蛋蛋白白质质的的方方式式（亚亚基基是是指指一一条条多多肽肽链链或或以以共共价价链链连连接接在在一一起起的的几几条条多多肽肽链链组组成成的的蛋蛋白白质质分分子子的的最最小小共共价价结结构构单单位）。位）。 (1) (1) 定义：定义：The spatial arrangement of multiple subunits of a protein is referred to as the quaternary structure.蛋白质化学FProteins need to have two or more polypeptide chains to function properly.Each individual polypeptide of the complete tertiary structure is called subunit (亚基). These subunits are associated by H-bonds, ionic interactions, and hydrophobic interactions.Polypeptide chains can be in dimer (二聚物), trimer (三聚物)., as well as homo- (同性) or hetero- (异性) form. 蛋白质化学FIonic forces among Hb subunits蛋白质化学FHemoglobinHemoglobinMyoglobinMyoglobinMathews et al (2000) Biochemistry (3e) p.214蛋白质化学FMathews et al (2000) Biochemistry (3e) p.195小结小结蛋白质化学F三、蛋白质的理化性质三、蛋白质的理化性质 蛋白质是由氨基酸组成，因此蛋白质的性质与氨蛋白质是由氨基酸组成，因此蛋白质的性质与氨基酸相似，但由于蛋白质是由许多氨基酸通过肽键形基酸相似，但由于蛋白质是由许多氨基酸通过肽键形成了大分子化合物，也就出现了一些新的性质。成了大分子化合物，也就出现了一些新的性质。 蛋白质化学F（一）胶体性质（一）胶体性质 由于蛋白质分子很大，在水中形成胶体溶液。蛋白质主要是指由于蛋白质分子很大，在水中形成胶体溶液。蛋白质主要是指球状蛋白质有亲水面，它的亲水基团都在表面，因此与水有很大的球状蛋白质有亲水面，它的亲水基团都在表面，因此与水有很大的亲和力，成为亲和力，成为亲水胶体亲水胶体。 蛋白质的亲水胶体溶液是相当蛋白质的亲水胶体溶液是相当稳定的，一方面由于蛋白质表面的稳定的，一方面由于蛋白质表面的亲水基团会吸引它周围的水分子，亲水基团会吸引它周围的水分子，使水分子定向排列在它的周围，形使水分子定向排列在它的周围，形成成“水化层水化层”。另一方面由于蛋白。另一方面由于蛋白质在非等电点时带有同种质在非等电点时带有同种电荷电荷，同，同种电荷相斥，也使蛋白质分子保持种电荷相斥，也使蛋白质分子保持一定的距离而不会聚合。一定的距离而不会聚合。 蛋白质化学F蛋白质胶体颗粒的沉淀蛋白质胶体颗粒的沉淀+-+-（沉淀沉淀）（疏水胶体）（疏水胶体）（疏水胶体）（疏水胶体）蛋白质化学F（二）酸碱性质和等电点（二）酸碱性质和等电点 1. 1. 蛋白质分子的可解离基团蛋白质分子的可解离基团2. 2. 等电点等电点 在某一在某一pHpH值时，蛋白质所带的正电荷与负电荷恰好相值时，蛋白质所带的正电荷与负电荷恰好相等，即净电荷为零，此时溶液的等，即净电荷为零，此时溶液的pHpH值就是蛋白质的等电点。值就是蛋白质的等电点。 蛋白质化学F 每种蛋白质都有它特有的等电点，这也是鉴别蛋白质每种蛋白质都有它特有的等电点，这也是鉴别蛋白质的指标之一。的指标之一。蛋白质的酸性氨基酸和碱性氨基酸含量与等电点的关系蛋白质的酸性氨基酸和碱性氨基酸含量与等电点的关系: :等电点和蛋白质分子中所含氨基酸的种类有关。等电点和蛋白质分子中所含氨基酸的种类有关。蛋白质化学F3. 3. 等离子点等离子点 等离子点等离子点是蛋白质在不含其它溶质的纯水中，是蛋白质在不含其它溶质的纯水中，蛋白质所带净电荷为零时的溶液的蛋白质所带净电荷为零时的溶液的pHpH值。等离子点值。等离子点是一个常数。是一个常数。 4 4蛋白质等电点的测定蛋白质等电点的测定 等电聚焦等电聚焦 蛋白质化学F（三）电泳（三）电泳(Electrophoresis) 移动的速度移动的速度 v =E Z fThe charges and the molecular weights will determine their moving velocity in the electric field, leading to the separation of different proteins.The gel polymer material for protein separation is composed of methylenebisacrylamide and acrylamide. 蛋白质化学FThe pore size can be controlled by changing the concentration of cross-linking reagent. The gel with different concentration of cross-linking reagent can be used for different size proteins. 蛋白质化学FSodium dodecyl sulfate (SDS) is added into the protein solution to denature the protein.Anions of SDS bind to protein in the ratio of 1 SDS per 2 AAs. The protein-SDS complex is roughly charged proportional to the mass. The smaller the protein, the faster the moving speed. 蛋白质化学F(四四) 变性作用（变性作用（denaturation） 1 1变性的概念和理论变性的概念和理论 概念：变性是指蛋白质受物理或化学因素的影响，使蛋白概念：变性是指蛋白质受物理或化学因素的影响，使蛋白质分子原有的特定的空间结构发生改变，从而导致蛋白质质分子原有的特定的空间结构发生改变，从而导致蛋白质性质的改变以及生物活性的丧失。性质的改变以及生物活性的丧失。 理论：吴宪提出理论：吴宪提出肽链从紧密有序结构肽链从紧密有序结构松散无序的结构松散无序的结构蛋白质化学F2 2变性的因素变性的因素 物理因素物理因素: : 加热、紫外线、加热、紫外线、X-X-射线、超声波等。射线、超声波等。 化学因素化学因素: : 酸、碱、有机溶剂、蛋白变性剂（尿素、盐酸酸、碱、有机溶剂、蛋白变性剂（尿素、盐酸 胍）、重金属盐等。胍）、重金属盐等。 蛋白质化学F3 3变性蛋白质的特性变性蛋白质的特性 （1 1）生物活性全部或部分丧失）生物活性全部或部分丧失 （2 2）一些侧链基团暴露，可滴定基团增加）一些侧链基团暴露，可滴定基团增加 （3 3）一些物理化学性质的改变）一些物理化学性质的改变 （4 4）生化性质的改变）生化性质的改变 蛋白质化学F4 4变性的可逆性变性的可逆性 蛋白质化学F蛋白质的一级结构决定高级结构蛋白质的一级结构决定高级结构 蛋白质化学F（五）凝固作用（五）凝固作用 变性蛋白质互相凝聚或互相穿插在一起的现象称变性蛋白质互相凝聚或互相穿插在一起的现象称蛋白质的凝固。蛋白质的凝固。 蛋白质化学F（六）沉淀作用（六）沉淀作用 1 1加酸沉淀蛋白质加酸沉淀蛋白质 2 2加中性盐沉淀蛋白质加中性盐沉淀蛋白质 3 3加有机溶剂沉淀蛋白质加有机溶剂沉淀蛋白质 4 4加重金属盐沉淀蛋白质加重金属盐沉淀蛋白质 5 5加生物碱试剂沉淀蛋白质加生物碱试剂沉淀蛋白质 蛋白质化学F（七）沉降作用（七）沉降作用 什么是沉降？什么是沉降？ 沉降速度：指离心时，蛋白质分子在单位时间内下沉的距离。沉降速度：指离心时，蛋白质分子在单位时间内下沉的距离。 t：时间（时间（sec） x：下沉的距离（下沉的距离（cm） v =dx dt沉降常数（沉降系数）沉降常数（沉降系数）：当沉降界面以恒速移动时，单：当沉降界面以恒速移动时，单 位离心场中的沉降速度。位离心场中的沉降速度。 s：沉降常数沉降常数 v：沉降速度沉降速度（cm/sec）w：离心机转头的角速度离心机转头的角速度（弧度（弧度/sec） x：蛋白质界面中点离旋转中心的距离，蛋白质界面中点离旋转中心的距离，以以cm计。计。 瑞典的蛋白质化学家瑞典的蛋白质化学家T.Svedberg 1S=10-13秒。秒。 蛋白质化学F（一）蛋白质一级结构与功能的关系（一）蛋白质一级结构与功能的关系 1镰刀状红细胞贫血病（镰刀状红细胞贫血病（sickle-cell anemia） 四、蛋白质结构与功能的关系四、蛋白质结构与功能的关系 蛋白质化学F蛋白质化学FObserved Normal range Red cell count 2.6106/ml 4.66.2106/ml Hemoglobin content 8g/100ml 1418g/100ml White cell count 15,250/ml 4,00010,000/ml HbA -链：链：Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-LysHbS -链：链：Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys HbA（ adult hemoglobin） HbS（sickle-cell hemoglobin） 蛋白质化学F蛋白质化学F蛋白质化学F蛋白质化学F2 2激素和它的前体分子激素和它的前体分子胰岛素和它的前体胰岛素和它的前体蛋白质化学F蛋白质化学F蛋白质化学F （二）蛋白质的空间结构与功能的关系（二）蛋白质的空间结构与功能的关系 以血红蛋白的别构效应为例说明蛋白质以血红蛋白的别构效应为例说明蛋白质的空间结构与功能的关系的空间结构与功能的关系 蛋白质化学F1血红蛋白中血红素辅基的结构血红蛋白中血红素辅基的结构 蛋白质化学F2血红素中的血红素中的Fe2+与氧结合前后价数不变与氧结合前后价数不变 蛋白质化学F3血红蛋白与氧的结合血红蛋白与氧的结合 蛋白质化学F4血红蛋白的别构效应血红蛋白的别构效应(变构效应变构效应)（allosteric effect） 蛋白质化学F蛋白质化学F 氧合作用显著改变氧合作用显著改变Hb的四级结构，血红素铁的的四级结构，血红素铁的微小移动导致血红蛋白构象的转换（从微小移动导致血红蛋白构象的转换（从T态态R态）态）T态（态（tense state）紧张态紧张态R态（态（relaxed state）松驰态。松驰态。蛋白质化学F 血红蛋白是由两个血红蛋白是由两个-亚基和两个亚基和两个-亚基亚基组成的四聚体（组成的四聚体（2 22 2），），有稳定的四级结构，有稳定的四级结构，与氧的亲和力很弱，但当氧与血红蛋白分子中与氧的亲和力很弱，但当氧与血红蛋白分子中一个亚基的血红素辅基的铁结合后。即引起该一个亚基的血红素辅基的铁结合后。即引起该亚基构象的改变，一个亚基构象的改变又会引亚基构象的改变，一个亚基构象的改变又会引起其余亚基的构象相继发生改变，亚基间的次起其余亚基的构象相继发生改变，亚基间的次级键被破坏，结果整个分子从紧密的构象变成级键被破坏，结果整个分子从紧密的构象变成比较松散的构象，易于与氧结合，使血红蛋白比较松散的构象，易于与氧结合，使血红蛋白与氧结合的速度大大加快。与氧结合的速度大大加快。 蛋白质化学F 别构效应别构效应是指含亚基的蛋白质分子由于一个是指含亚基的蛋白质分子由于一个亚基构象的改变而引起其余亚基以至整个分子构亚基构象的改变而引起其余亚基以至整个分子构象、性质和功能发生变化。象、性质和功能发生变化。 蛋白质化学F5波耳（波耳（Bohr）效应效应 H+和和CO2促进促进HbO2释放释放O2 蛋白质化学F蛋白质化学F6. 2，3一二磷酸甘油酸对一二磷酸甘油酸对Hb氧合的影响氧合的影响Or 2, 3 - Bisphosphoglycerate (BPG)蛋白质化学F蛋白质化学F蛋白质化学FGarrett & Grisham (1999) Biochemistry (2e) p.573substrateproduct蛋白质四级结构有利于细胞生理反应蛋白质四级结构有利于细胞生理反应蛋白质化学F 螺旋可以组合成更复杂的的构造 Garrett & Grisham (1999) Biochemistry (2e) p.173蛋白质化学F可自动组合的病毒外壳蛋白Alberts et al (2002) Molecular Biology of the Cell (4e) p.153蛋白质化学F五、蛋白质的分离、纯化和鉴定五、蛋白质的分离、纯化和鉴定一般包括五步一般包括五步 （一）细胞破碎（一）细胞破碎 有机械方法如高速组织捣碎器、玻璃匀浆器、在研有机械方法如高速组织捣碎器、玻璃匀浆器、在研缽中或球磨机上磨等。还有超声法、反复冻融法、自溶缽中或球磨机上磨等。还有超声法、反复冻融法、自溶等方法。等方法。 （二）抽提（二）抽提 根据蛋白质的溶解性用适当溶剂来抽提，总的原根据蛋白质的溶解性用适当溶剂来抽提，总的原则是要制备的蛋白质溶在什么溶剂中就用什么溶剂来则是要制备的蛋白质溶在什么溶剂中就用什么溶剂来抽提。抽提。蛋白质化学F（三）分离（三）分离 1盐析法盐析法 在蛋白质的抽提液中加入一定量的中性盐，使蛋在蛋白质的抽提液中加入一定量的中性盐，使蛋白质沉淀下来，常用的中性盐为白质沉淀下来，常用的中性盐为(NH4)2SO4、NH4Cl等。等。2 2有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法 常用的是乙醇、丙酮。常用的是乙醇、丙酮。 蛋白质化学F3 3等电点沉淀等电点沉淀 利用蛋白质在等电点时溶解度最小这一特性，利用蛋白质在等电点时溶解度最小这一特性，可以调溶液的可以调溶液的pHpH，尽量接近它的等电尽量接近它的等电 点，而使蛋白点，而使蛋白质沉淀。质沉淀。 4 4吸附法吸附法 吸附法是利用各种吸附剂和蛋白质结合能力吸附法是利用各种吸附剂和蛋白质结合能力（吸附能力）的不同来分离蛋白质。（吸附能力）的不同来分离蛋白质。 蛋白质化学F5 5透析和超滤透析和超滤 超滤法是最近几年发展起来的超滤法是最近几年发展起来的一种新技术，利用分子大小不同，一种新技术，利用分子大小不同，来分离蛋白质。来分离蛋白质。 透析蛋白质化学F（四）纯化（四）纯化1离子交换层析离子交换层析 离子交换层析是根据蛋白质所带电荷的不同进行分离子交换层析是根据蛋白质所带电荷的不同进行分离纯化。常用的阳离子交换剂为羧甲基纤维素（离纯化。常用的阳离子交换剂为羧甲基纤维素（CM-C），），阴离子交换剂为二乙氨基乙基纤维素（阴离子交换剂为二乙氨基乙基纤维素（DEAE-C）。）。 蛋白质化学F蛋白质化学F2凝胶过滤凝胶过滤 也称分子排阻层析、分子筛层析，这是根据蛋白质也称分子排阻层析、分子筛层析，这是根据蛋白质分子大小不同来分离纯化蛋白质的一种方法。分子大小不同来分离纯化蛋白质的一种方法。 常用的凝胶常用的凝胶 : 葡聚糖凝胶（商品名葡聚糖凝胶（商品名Sephadex） 聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶(商品名商品名Bio-GelP) 琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶(商品名因生产厂家而商品名因生产厂家而 不同不同)蛋白质化学F蛋白质化学F4 4亲和层析亲和层析 这是根据蛋白质能与特异的配体相结合而设计这是根据蛋白质能与特异的配体相结合而设计的一种方法。的一种方法。 蛋白质蛋白质 配体配体 蛋白质配体复合物蛋白质配体复合物3 3高效液相层析（高效液相层析（HPLCHPLC） 蛋白质化学F这种分离纯化方法由于专一性强，理论上可以从复杂的体系中这种分离纯化方法由于专一性强，理论上可以从复杂的体系中一步提取所需的物质。一步提取所需的物质。 蛋白质化学F5. 5. 疏水层析疏水层析6. 6. 电泳电泳7. 7. 结晶结晶蛋白质化学F（五）鉴定（五）鉴定 1纯度鉴定纯度鉴定 常用的方法有电泳法、超离心法等。常用的方法有电泳法、超离心法等。 还有恒溶度法还有恒溶度法蛋白质化学F2分子量确定分子量确定 （1）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE） SDS（十二烷基硫酸钠）是一种阴离子去污剂，带十二烷基硫酸钠）是一种阴离子去污剂，带有很多负电荷，与蛋白质结合以后，蛋白质分子带有足有很多负电荷，与蛋白质结合以后，蛋白质分子带有足够的负电荷，远远超过了蛋白质分子原有的电荷，蛋白够的负电荷，远远超过了蛋白质分子原有的电荷，蛋白质分子原有的电荷就变得无足轻重了，所以在电场上质分子原有的电荷就变得无足轻重了，所以在电场上移移动的速度完全取决于蛋白质分子的大小动的速度完全取决于蛋白质分子的大小。 SDS可将蛋白质解离成亚基，所以测出的分子量可将蛋白质解离成亚基，所以测出的分子量是亚基的分子量。是亚基的分子量。 蛋白质化学F蛋白质化学F（2）凝胶过滤法）凝胶过滤法 原理原理 ：蛋白质化学F3 3等电点的测定等电点的测定 蛋白质化学F4 4生物活性的测定生物活性的测定 不同的蛋白质有不同的生物功能，也就有不同的不同的蛋白质有不同的生物功能，也就有不同的生物活性测定的方法。生物活性测定的方法。 蛋白质化学F