实验七实验七 培养基的配制及消毒培养基的配制及消毒与灭菌及与灭菌及LB培养基的制备培养基的制备1 1一、实验目的一、实验目的1 了解培养基的种类、掌握培养基的配制、了解培养基的种类、掌握培养基的配制、分装方法和灭菌前的准备工作；高压灭菌分装方法和灭菌前的准备工作；高压灭菌的原理、使用范围和注意事项。的原理、使用范围和注意事项。2 明确培养基的配制原理。明确培养基的配制原理。3 通过对通过对LB培养基的配制，掌握配制培养基培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤。的一般方法和步骤。2 2培养基是人工地将多种物质按各种微培养基是人工地将多种物质按各种微生物生长的需要配制而成的一种混合生物生长的需要配制而成的一种混合营养基质，用以培养或分离各种微生营养基质，用以培养或分离各种微生物。因此，营养基质应当有微生物所物。因此，营养基质应当有微生物所能利用的营养成分（包括碳源、氮源、能利用的营养成分（包括碳源、氮源、能源、无机盐、生长因素）和水。根能源、无机盐、生长因素）和水。根据微生物的种类和实验目的不同，培据微生物的种类和实验目的不同，培养基也有不同的种类和配制方法。养基也有不同的种类和配制方法。3 3按成分的不同分类按成分的不同分类 1天然培养基天然培养基:主要成分是复杂的天然有机物质，主要成分是复杂的天然有机物质，如马铃薯、豆芽汁、牛肉膏、蛋白胨、血清等。如马铃薯、豆芽汁、牛肉膏、蛋白胨、血清等。这些复杂天然有机物质的成分不完全了解，每次这些复杂天然有机物质的成分不完全了解，每次所用的原料，其中各成分的数量也不恒定。这类所用的原料，其中各成分的数量也不恒定。这类培养基是实验室常用的培养基，例如牛肉膏蛋白培养基是实验室常用的培养基，例如牛肉膏蛋白胨培养基、马铃薯培养基等。胨培养基、马铃薯培养基等。2合成培养基合成培养基:用化学成分完全了解的纯试剂配制用化学成分完全了解的纯试剂配制而成的培养基，如高氏而成的培养基，如高氏1号培养基，查氏培养基等。号培养基，查氏培养基等。一般用于营养代谢、分类鉴定、菌种选育、遗传一般用于营养代谢、分类鉴定、菌种选育、遗传分析等。分析等。4 4按培养基的物理状态分类按培养基的物理状态分类 1固体培养基固体培养基:在液体培养基中加入凝固剂即为在液体培养基中加入凝固剂即为固体培养基。实验用的凝固剂有琼脂、明胶和硅固体培养基。实验用的凝固剂有琼脂、明胶和硅胶，后者用于配制自养微生物的固体培养基。对胶，后者用于配制自养微生物的固体培养基。对其他多数微生物来讲，以琼脂最为合适，一般加其他多数微生物来讲，以琼脂最为合适，一般加入入1525%即可凝固成固体。此培养基可供即可凝固成固体。此培养基可供分离、鉴定、活菌计数、菌种保藏等用。分离、鉴定、活菌计数、菌种保藏等用。2半固体培养基半固体培养基:在液体培养基中加入少量凝固在液体培养基中加入少量凝固剂即为半固体培养基，例如琼脂只需加入剂即为半固体培养基，例如琼脂只需加入0207%。常用作细菌动力检查和菌种保存、噬菌。常用作细菌动力检查和菌种保存、噬菌体制剂的制备等。体制剂的制备等。3液体培养基液体培养基:没有加琼脂，配好后成液体状态没有加琼脂，配好后成液体状态的培养基。常用于生理代谢的研究和工业发酵等。的培养基。常用于生理代谢的研究和工业发酵等。5 5按培养基的用途分类按培养基的用途分类 1基础培养基基础培养基:含有一般细菌生长繁殖需要含有一般细菌生长繁殖需要的基本的营养物质。最常用的基础培养基的基本的营养物质。最常用的基础培养基是上面提及的天然培养基中的牛肉膏蛋白是上面提及的天然培养基中的牛肉膏蛋白胨培养基。这种培养基可作为一些特殊培胨培养基。这种培养基可作为一些特殊培养基的基础成分。养基的基础成分。2营养培养基（加富培养基）营养培养基（加富培养基）:在基础培养在基础培养基中加入某些特殊营养物质，如血液、血基中加入某些特殊营养物质，如血液、血清、酵母浸膏或生长因子等。用以培养对清、酵母浸膏或生长因子等。用以培养对营养要求高的微生物，如培养百日咳杆菌营养要求高的微生物，如培养百日咳杆菌需要含有血液的培养基。需要含有血液的培养基。6 63鉴别培养基鉴别培养基:是一类含有某种特定化合物或试是一类含有某种特定化合物或试剂的培养基。某种微生物在这种培养基上培养后，剂的培养基。某种微生物在这种培养基上培养后，它所产生的某种代谢产物与这种特定的化合物或它所产生的某种代谢产物与这种特定的化合物或试剂能发生某种明显的特征性反应，根据这一特试剂能发生某种明显的特征性反应，根据这一特征性反应可以将某种微生物与其他种微生物区别征性反应可以将某种微生物与其他种微生物区别开来。主要用于不同类型微生物的快速鉴定，如开来。主要用于不同类型微生物的快速鉴定，如用来检查细菌能否产生硫化氢的醋酸铅培养基。用来检查细菌能否产生硫化氢的醋酸铅培养基。4选择培养基选择培养基:利用微生物对某种或某些化学物利用微生物对某种或某些化学物质的敏感性不同，在培养基中加入这类物质，抑质的敏感性不同，在培养基中加入这类物质，抑制不需要的微生物生长，而利于所需分离的微生制不需要的微生物生长，而利于所需分离的微生物生长，从而达到分离或鉴别某种微生物的目的，物生长，从而达到分离或鉴别某种微生物的目的，如分离真菌的马丁氏培养基。既有选择作用又有如分离真菌的马丁氏培养基。既有选择作用又有鉴别作用的培养基，如鉴别肠道杆菌的远藤氏培鉴别作用的培养基，如鉴别肠道杆菌的远藤氏培养基等。养基等。7 7二、基本原理二、基本原理LB培养基是一种应用最广泛和最普通的细培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。菌基础培养基，有时又称为普通培养基。它含有酵母提取物、蛋白胨和它含有酵母提取物、蛋白胨和NaCl。碳源。碳源和能源：酵母提取物，氮源：磷酸盐、蛋和能源：酵母提取物，氮源：磷酸盐、蛋白胨，无机盐：白胨，无机盐：NaCl。在配制固体培养基。在配制固体培养基时还要加入一定量琼脂作凝固剂。琼脂在时还要加入一定量琼脂作凝固剂。琼脂在常用浓度下常用浓度下96时溶化，一般实际应用时时溶化，一般实际应用时在沸水浴中或下面垫以石棉网煮沸溶化，在沸水浴中或下面垫以石棉网煮沸溶化，以免琼脂烧焦。琼脂在以免琼脂烧焦。琼脂在40时凝固，通常时凝固，通常不被微生物分解利用。不被微生物分解利用。8 8由于这种培养基多用于培养细菌，因由于这种培养基多用于培养细菌，因此，要用稀酸或稀碱将其此，要用稀酸或稀碱将其pH调至中性调至中性或微碱性，以利于细菌的生长繁殖。或微碱性，以利于细菌的生长繁殖。LB培养基的配方如下：酵母提取物培养基的配方如下：酵母提取物 5g、蛋白胨、蛋白胨 10g、NaCl 5g、琼、琼脂脂 1520g、水、水 1000mL、pH 7.47.69 9三、实验器材三、实验器材酵母提取物，蛋白胨，酵母提取物，蛋白胨， NaCl，琼脂；，琼脂；1mol/L NaOH， 1mol/L HCl；试管，三角；试管，三角烧瓶，烧杯，量筒，玻棒，培养基分装器，烧瓶，烧杯，量筒，玻棒，培养基分装器，天平，牛角匙，高压蒸汽灭菌锅，天平，牛角匙，高压蒸汽灭菌锅，pH试纸试纸（pH 5.59.0），棉花，牛皮纸，记号笔，），棉花，牛皮纸，记号笔，麻绳，纱布等。麻绳，纱布等。1010四、实验步骤四、实验步骤1称量称量 按培养基配方比例依次准确地称取酵母提取物、蛋白胨、按培养基配方比例依次准确地称取酵母提取物、蛋白胨、NaCl放入烧杯中。蛋白胨很易吸潮，在称取时动作要迅速放入烧杯中。蛋白胨很易吸潮，在称取时动作要迅速。另外，称药品时严防药品混杂，一把牛角匙用于一种药。另外，称药品时严防药品混杂，一把牛角匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净、擦干，再称取另一药品，品，或称取一种药品后，洗净、擦干，再称取另一药品，瓶盖也不要盖错。瓶盖也不要盖错。2溶化溶化在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解。待药品完全溶解后，补然后，在石棉网上加热使其溶解。待药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。如果配制固体培养基，将称好的充水分到所需的总体积。如果配制固体培养基，将称好的琼脂放入已溶化的药品中，再加热溶化，在琼脂溶化的过琼脂放入已溶化的药品中，再加热溶化，在琼脂溶化的过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底使烧杯破裂。最后补足程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底使烧杯破裂。最后补足所失的水分。所失的水分。 11113调调pH在未调在未调pH前，先用精密前，先用精密pH试纸测量培养基的原始试纸测量培养基的原始pH值，值，如果如果pH偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/L NaOH，边加边搅拌，并随时用，边加边搅拌，并随时用pH试纸测其试纸测其pH值，直至值，直至pH达达7.6。反之，则用。反之，则用1mol/L HCl进行调节。注意进行调节。注意pH值不要调值不要调过头，以避免回调，否则，将会影响培养基内各离子的浓过头，以避免回调，否则，将会影响培养基内各离子的浓度。对于有些要求度。对于有些要求pH值较精确的微生物，其值较精确的微生物，其pH的调节可的调节可用酸度计进行（使用方法，可参考有关说明书）。用酸度计进行（使用方法，可参考有关说明书）。4分装分装 (1)液体分装分装高度以试管高度的液体分装分装高度以试管高度的1/4左右为宜。左右为宜。(2)固体分装分装试管，其装量不超过管高的固体分装分装试管，其装量不超过管高的1/5，灭菌后，灭菌后制成斜面，分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一制成斜面，分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。半为宜。(3)半固体分装试管一般以试管高度的半固体分装试管一般以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂为宜，灭菌后垂直待凝。直待凝。12125加塞加塞培养基分装完毕后，在试管口或三角烧瓶口上塞上棉塞，培养基分装完毕后，在试管口或三角烧瓶口上塞上棉塞，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能。好的通气性能。6.包扎包扎加塞后，将全部试管用麻绳捆扎好，再在棉塞外包一层牛加塞后，将全部试管用麻绳捆扎好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道麻绳皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培养基名称、组别、日期。三角烧瓶扎好。用记号笔注明培养基名称、组别、日期。三角烧瓶加塞后，外包牛皮纸，用麻绳以活结形式扎好，使用时容加塞后，外包牛皮纸，用麻绳以活结形式扎好，使用时容易解开，同样用记号笔注明培养基名称、组别、日期。易解开，同样用记号笔注明培养基名称、组别、日期。7灭菌灭菌将上述培养基以将上述培养基以1.05kg/cm2（15磅磅/英寸英寸2），），121.3，20分钟高压蒸汽灭菌。如因特殊情况不能及时灭菌，则应分钟高压蒸汽灭菌。如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入冰箱内暂存。放入冰箱内暂存。13138搁置斜面搁置斜面将灭菌的试管培养基冷至将灭菌的试管培养基冷至50左右，将试左右，将试管棉塞端搁在玻棒上，搁置的斜面长度以管棉塞端搁在玻棒上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。不超过试管总长的一半为宜。9无菌检查无菌检查将灭菌的培养基放入将灭菌的培养基放入37的温室中培养的温室中培养2448小时，以检查灭菌是否彻底。小时，以检查灭菌是否彻底。1414五、实验报告五、实验报告 1 分析分析（1） 指出你所配制的培养基中的碳源、氮指出你所配制的培养基中的碳源、氮源、能源、无机盐及生长因子的来源源、能源、无机盐及生长因子的来源（2） 使用高压灭菌锅的注意事项使用高压灭菌锅的注意事项 2 思考思考（1）培养基配好后，为什么摇立即灭菌？）培养基配好后，为什么摇立即灭菌？（2）为什么配置培养基时要注意各营养成）为什么配置培养基时要注意各营养成分的比例？分的比例？1515