实验二实验二培养材料消毒和接种培养材料消毒和接种 一、实验目的1、掌握植物组织培养中的无菌操作技术2、掌握植物外植体表面消毒的常规方法 操作前的准备工作操作前的准备工作接种室在接种前接种室在接种前4-5 d4-5 d必须通风换气。在必须通风换气。在接种前一天对接种室进行全面消毒，一接种前一天对接种室进行全面消毒，一般用般用40%40%福尔马林进行全面喷雾，并密闭福尔马林进行全面喷雾，并密闭24 h24 h，然后打开换气窗，然后打开换气窗10-15 min.10-15 min.。 A: A: 实验器具和材料的准备实验器具和材料的准备B: B: 用用75%75%的酒精擦拭超净工作台，然后室内及的酒精擦拭超净工作台，然后室内及超净工作台用紫外灯杀菌超净工作台用紫外灯杀菌20min-30min20min-30min。注意：。注意：台面上的用品不要放置太多或重叠放置，以免台面上的用品不要放置太多或重叠放置，以免降低灭菌效果。降低灭菌效果。C: C: 关紫外灯、打开风机，过关紫外灯、打开风机，过5-10min5-10min进入缓冲进入缓冲间，以间，以75%75%洗手和手臂，更换无菌服、帽子和洗手和手臂，更换无菌服、帽子和口罩。进入接种室。（注：没有特别情况，尽口罩。进入接种室。（注：没有特别情况，尽量不要下工作台）量不要下工作台）D: D: 用用70707575乙醇消毒双手。试验用具也应乙醇消毒双手。试验用具也应该用酒精消毒。点燃酒精灯，将金属器械在其该用酒精消毒。点燃酒精灯，将金属器械在其火焰上灼烧，冷却待用。火焰上灼烧，冷却待用。注意：所有操作应在火焰近处并经过灼烧进行。注意：所有操作应在火焰近处并经过灼烧进行。移液管不能灼烧，培养瓶口、塑料材料、橡胶移液管不能灼烧，培养瓶口、塑料材料、橡胶材料过火焰不能时间太长。材料过火焰不能时间太长。 接种接种时在近火焰在近火焰处打开瓶口，使瓶打开瓶口，使瓶倾斜，以免斜，以免空气中微生物落入瓶中空气中微生物落入瓶中 错 误 整个接种操作应在近火焰处进行，且动作要整个接种操作应在近火焰处进行，且动作要迅速迅速正正 确确 错 误 接种接种过程中尽可能达到程中尽可能达到悬空要求空要求防止操作防止操作带来的来的污染染 正正 确确 错 误 培养器材的清洗与灭菌培养器材的清洗与灭菌在细胞工程实验中，离体细胞对任何毒性物质在细胞工程实验中，离体细胞对任何毒性物质都十分敏感。毒性物质包括解体的微生物和细都十分敏感。毒性物质包括解体的微生物和细胞残余物以及非营养的化学物质。某些化学物胞残余物以及非营养的化学物质。某些化学物质仅质仅0.01g/L0.01g/L就会对细胞产生毒性作用，因就会对细胞产生毒性作用，因此对培养器皿的清洗是组织培养中一项极为重此对培养器皿的清洗是组织培养中一项极为重要的环节。要的环节。A A、新购买的玻璃仪器表面常附着有游离的碱性物、新购买的玻璃仪器表面常附着有游离的碱性物质，可先用质，可先用0.50.5的去污剂洗刷，再用自来水洗净，的去污剂洗刷，再用自来水洗净，然后浸泡在然后浸泡在1 12 2盐酸溶液中过夜（不可少于盐酸溶液中过夜（不可少于四小时），再用自来水冲洗，最后用无离子水冲四小时），再用自来水冲洗，最后用无离子水冲洗两次，在洗两次，在100100120120烘箱内烘干备用。烘箱内烘干备用。 B B、使用过的玻璃仪器的清洗、使用过的玻璃仪器的清洗 先用自来水洗刷至无污物，再用合适的毛刷先用自来水洗刷至无污物，再用合适的毛刷沾去污剂（粉）洗刷，然后用自来水彻底洗净沾去污剂（粉）洗刷，然后用自来水彻底洗净去污剂，用无离子水洗两次，烘干备用。去污剂，用无离子水洗两次，烘干备用。清洗后器皿内外不可挂有水珠，否则重洗清洗后器皿内外不可挂有水珠，否则重洗. .C C、金属用品洗涤、金属用品洗涤 金属用品一般不宜用各种洗涤液洗涤（新的金属用品一般不宜用各种洗涤液洗涤（新的可以用热洗衣粉水洗净），需要清洗时，一般可以用热洗衣粉水洗净），需要清洗时，一般用酒精擦洗，然后火焰干燥用酒精擦洗，然后火焰干燥 （1 1）干热灭菌）干热灭菌适用于玻璃器皿和金属器械的灭菌。操作方法：适用于玻璃器皿和金属器械的灭菌。操作方法：150 150 、40min 40min （2 2）湿热灭菌）湿热灭菌适用于各种器皿、培养基、器皿、蒸馏水、棉塞、适用于各种器皿、培养基、器皿、蒸馏水、棉塞、纸等。纸等。121 121 维持维持2030min2030min（3 3）过滤灭菌）过滤灭菌 培养基中某些成分遇到高温分解（如某些生长培养基中某些成分遇到高温分解（如某些生长调节剂调节剂GA3GA3、玉米素等），就需要过滤灭菌。、玉米素等），就需要过滤灭菌。 灭菌方法：将生长调节剂或酶配成一定浓度，灭菌方法：将生长调节剂或酶配成一定浓度，用注射器注入微孔滤膜虑。制培养基时，现将用注射器注入微孔滤膜虑。制培养基时，现将培养基高压灭菌，待降至培养基高压灭菌，待降至5050左右时，加入适左右时，加入适量的激素。量的激素。（4 4）射线灭菌）射线灭菌主要是利用紫外灯进行照射，适合实验室空气、主要是利用紫外灯进行照射，适合实验室空气、操作台等，灭菌时间操作台等，灭菌时间20-30min20-30min。注意：关灯后注意：关灯后5min5min后再进入。超净工作台关灯后再进入。超净工作台关灯后要打开风机后要打开风机 、（5 5）火焰灼烧灭菌）火焰灼烧灭菌用火焰灼烧达到灭菌目的，适用于接种器皿的用火焰灼烧达到灭菌目的，适用于接种器皿的灭菌。灭菌。 （6 6）消毒剂）消毒剂适用外植体、实验器皿、操作表面、皮肤等。适用外植体、实验器皿、操作表面、皮肤等。几种常用消毒剂的效果比较几种常用消毒剂的效果比较消消 毒毒 剂剂使用浓度使用浓度(%)(%)消毒时间消毒时间(min.)(min.)效效 果果残液去除残液去除难易难易乙醇乙醇70-7570-750.1-30.1-3好好易易新洁尔灭新洁尔灭101020205 53030好好易易氯化汞氯化汞0.10.11 12 21515最好最好最难最难过氧化氢过氧化氢101012125 51515较好较好最易最易抗菌素抗菌素4 450mgl50mgl-1-130306060较好较好较难较难次氯酸钙次氯酸钙/ /纳纳9 9 10105 53030好好易易二、实验原理二、实验原理用于进行组织培养的组织、器官和细胞称为外用于进行组织培养的组织、器官和细胞称为外植体。在组织培养中，外植体如果是带菌的，植体。在组织培养中，外植体如果是带菌的，在接种前都必须进行表面消毒，这是取得培养在接种前都必须进行表面消毒，这是取得培养成功的最基本的和重要的前提。常用消毒剂对成功的最基本的和重要的前提。常用消毒剂对外植体进行消毒。从室外取的材料，一般先用外植体进行消毒。从室外取的材料，一般先用自来水冲洗数分钟自来水冲洗数分钟. .接种材料使用消毒剂后，要用无菌水洗涤接种材料使用消毒剂后，要用无菌水洗涤3 35 5 遍，最后用无菌纸擦干净。使用消毒剂的原则遍，最后用无菌纸擦干净。使用消毒剂的原则是既要达到消毒目的，又不能损伤植物组织和是既要达到消毒目的，又不能损伤植物组织和细胞，还要符合就地取材的原则。对一些容易细胞，还要符合就地取材的原则。对一些容易污染、较难灭菌的外植体进行表面消毒时，用污染、较难灭菌的外植体进行表面消毒时，用单一消毒剂不能收到好的效果，所以常选用两单一消毒剂不能收到好的效果，所以常选用两种消毒剂交替浸泡法。种消毒剂交替浸泡法。一般，首先用一般，首先用7575乙醇浸泡外植体数秒钟至乙醇浸泡外植体数秒钟至30s30s，然后置于，然后置于0.10.1氯化汞溶液氯化汞溶液5 510min 10min 或或含有含有2 2活性氧的次氯酸钠溶液活性氧的次氯酸钠溶液5 530min30min，然，然后用无菌水洗涤。有时在氯化汞或次氯酸钠灭后用无菌水洗涤。有时在氯化汞或次氯酸钠灭菌后，用无菌水洗，进一步剥去几层组织或器菌后，用无菌水洗，进一步剥去几层组织或器官如叶片后，再用次氯酸钠灭菌官如叶片后，再用次氯酸钠灭菌3 35min5min，无，无菌水漂洗菌水漂洗3 3 次后，切割、用于接种。次后，切割、用于接种。消毒溶液对外植体消毒是在超净工作台上进行。消毒溶液对外植体消毒是在超净工作台上进行。完成表面消毒的接种材料要尽快放置于培养基完成表面消毒的接种材料要尽快放置于培养基中。中。三、实验材料三、实验材料器材：器材：超净工作台、镊子、酒精灯、脱脂棉、烧杯、超净工作台、镊子、酒精灯、脱脂棉、烧杯、广口瓶、培养皿。广口瓶、培养皿。药品及材料：药品及材料：0.1%0.1%升汞、酒精、次氯酸钠、无菌水、绿豆种升汞、酒精、次氯酸钠、无菌水、绿豆种子、培养基。子、培养基。四、实验步骤四、实验步骤（1 1）准备好培养基，无菌水，培养皿及接种工具。）准备好培养基，无菌水，培养皿及接种工具。（2 2）将培养基、无菌水、接种工具置于接种台上，）将培养基、无菌水、接种工具置于接种台上，打开超净台紫外灯开关，照射至少打开超净台紫外灯开关，照射至少2020分钟，关闭台分钟，关闭台内的紫外灯，通风五分钟后，再开日光灯进行无菌内的紫外灯，通风五分钟后，再开日光灯进行无菌操作。操作。（3 3）接种前用肥皂洗手，特别是将手指洗净，然）接种前用肥皂洗手，特别是将手指洗净，然后用沾有后用沾有75%75%酒精的棉球把手消毒一次。酒精的棉球把手消毒一次。（4 4）将绿豆种子在流水下冲洗干净。）将绿豆种子在流水下冲洗干净。（5 5）将种子放于广口瓶中，用）将种子放于广口瓶中，用75%75%的酒精溶液的酒精溶液浸泡浸泡30s30s，无菌水冲洗，然后用，无菌水冲洗，然后用0.1%0.1%升汞溶液升汞溶液浸泡浸泡3 3、5 5、10min10min，期间不断摇动溶液，用无，期间不断摇动溶液，用无菌水洗涤菌水洗涤5 5遍待用。遍待用。（6 6）取出培养皿，有必要的话可以用沾有）取出培养皿，有必要的话可以用沾有75%75%的酒精的棉球把皿表面擦一下。的酒精的棉球把皿表面擦一下。（7 7）接种用的镊子使用前插入）接种用的镊子使用前插入95%95%的乙的乙醇溶液中，使用镊子时在酒精灯上烧片醇溶液中，使用镊子时在酒精灯上烧片刻，冷却后待用。也可以插入培养基边刻，冷却后待用。也可以插入培养基边缘促使其冷却。缘促使其冷却。（8 8）在酒精灯火焰旁揭去培养皿封口膜，在）在酒精灯火焰旁揭去培养皿封口膜，在靠近火焰处，右手用灭菌的镊子夹取绿豆种子，靠近火焰处，右手用灭菌的镊子夹取绿豆种子，将其放在培养基上，用镊子轻轻按一下，使其将其放在培养基上，用镊子轻轻按一下，使其部分浸入培养基。每瓶可放部分浸入培养基。每瓶可放8-128-12个外植体。个外植体。（9 9）封上封口膜，标上接种日期、材料名称、）封上封口膜，标上接种日期、材料名称、姓名等，将接种材料移到培养室培养。姓名等，将接种材料移到培养室培养。五、作五、作业1、观察接种后、观察接种后25天的污染情况，填入下表天的污染情况，填入下表接种日接种日期期接种数接种数污染数污染数污染率污染率主要污染主要污染菌种菌种 2、在接种过程中，通过哪些措施来防止细菌对接种、在接种过程中，通过哪些措施来防止细菌对接种工具，接种材料的污染？工具，接种材料的污染？