1创新设计创新设计2创新设计创新设计1.限制酶限制酶的选择的选择原则原则3创新设计创新设计（1）根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类）根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类应应选选择择切切点点位位于于目目的的基基因因两两端端的的限限制制酶酶，以以便便将将目目的的基基因因“切切出出”，如如图图甲甲可可选择选择Pst。不不能能选选择择切切点点位位于于目目的的基基因因内内部部的的限限制制酶酶，以以防防破破坏坏目目的的基基因因，如如图图甲甲不不能能选选择择Sma。为为避避免免目目的的基基因因和和质质粒粒的的自自身身环环化化和和随随意意连连接接，也也可可使使用用不不同同的的限限制制酶酶切切割割目目的的基基因因和和质质粒粒，如如图图甲甲也也可可选选择择用用Pst 和和EcoR 两两种种限限制制酶酶（但但要要确确保保质质粒粒上上也也有有这这两两种种酶酶的的切切点点），而而且且这这种种切切点点不不致致于于破破坏坏所所有有的的“标标记记基基因因”以以及及启启动动子和终止子子和终止子。4创新设计创新设计（2）根据质粒的特点确定限制酶的）根据质粒的特点确定限制酶的种类种类5创新设计创新设计所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保具有相同的黏性末端。所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保具有相同的黏性末端。质质粒粒作作为为载载体体必必须须具具备备标标记记基基因因等等，所所以以所所选选择择的的限限制制酶酶尽尽量量不不要要破破坏坏这这些些结结构构，应应至至少少含含有有一一个个完完好好的的标标记记基基因因，如如图图乙乙中中限限制制酶酶pst 因因其其会会破破坏坏标标记记基基因因而而不不宜宜选择。选择。所所选选限限制制酶酶切切点点不不应应位位于于复复制制原原点点处处以以防防破破坏坏复复制制原原点点，如如果果所所选选酶酶的的切切点点不不止止一一个个，则则切切割割重重组组后后可可能能会会丢丢失失某某些些片片段段，若若丢丢失失的的片片段段含含复复制制原原点点区区，则则切切割割重重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。6创新设计创新设计所所选选限限制制酶酶，其其切切点点应应位位于于启启动动子子与与终终止止子子之之间间，如如图图乙乙中中Hind会会破破坏坏启启动动子子，EcoR会会破破坏坏终终止止子子，而而Nde和和BamH切切出出的的切切口口可可让让目目的的基基因因嵌嵌入入启启动动子子与与终终止止子子之间。之间。（3）参考）参考Ti质粒的质粒的TDNA片段选择限制酶片段选择限制酶若若质质粒粒上上标标出出TDNA片片段段，则则所所选选限限制制酶酶切切点点应应位位于于TDNA片片段段中中，从从而而有有利利于于将将目目的的基基因因嵌嵌入入到到TDNA片片段段上上因因为为Ti质质粒粒的的TDNA片片段段最最易易转转移移至至受受体体细细胞胞并并且且整整合合到到受受体体细细胞胞染染色色体体DNA上上，如如用用两两种种限限制制酶酶Xba 和和Sac （两两种种酶酶切切出出的的黏黏性性末末端端不不同同）切切割割某某DNA，获获得得含含目目的的基基因因的的片片段段。若若利利用用该该片片段段构构建建基基因因表表达载体，则下图中甲、乙、丁，达载体，则下图中甲、乙、丁，Ti质粒均不宜选择，而丙质粒均不宜选择，而丙Ti质粒宜选取。（分析如下质粒宜选取。（分析如下）7创新设计创新设计8创新设计创新设计2.目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定（1）界定）界定“标记基因标记基因”与与“DNA分子杂交技术分子杂交技术”在目的基因检测中的作用：在目的基因检测中的作用：载体上标记基因的标记原理载体上标记基因的标记原理载载体体上上的的标标记记基基因因一一般般是是一一些些抗抗生生素素的的抗抗性性基基因因。目目的的基基因因要要转转入入的的受受体体细细胞胞没没有有抵抵抗抗相相关关抗抗生生素素的的能能力力。当当含含有有抗抗生生素素抗抗性性基基因因的的载载体体进进入入受受体体细细胞胞后后，抗抗性性基基因因在在受受体体细细胞胞内内表表达达，使使受受体体细细胞胞能能够够抵抵抗抗相相应应抗抗生生素素，所所以以在在受受体体细细胞胞的的培培养养体体系系中中加加入入该该种种抗抗生生素素就就可可以以只只保保留留转转入入载载体体的的受受体体细细胞胞，倘倘若若在在选选择择培培养养基基中中不不能能存存活活，则则表表明明无无质质粒粒转转入入，当当然然不不会会有有“目目的的基基因因”转转入入，能能存存活活时时必必含含该该载载体体，原原理如下图所示理如下图所示：9创新设计创新设计“标记基因标记基因”筛选后为何还需应用筛选后为何还需应用“DNA分子杂交技术分子杂交技术”确认目的基因是否转入？确认目的基因是否转入？经经上上述述步步骤骤筛筛选选得得到到的的受受体体细细胞胞，只只是是含含特特定定的的标标记记基基因因的的质质粒粒，然然而而，该该质质粒粒上上是是否否成成功功嵌嵌入入了了目目的的基基因因，还还不不能能确确定定，故故仍仍需需使使用用“目目的的基基因因”作作探探针针，利利用用DNA分子杂交技术，检测受体细胞的质粒上是否含目的基因分子杂交技术，检测受体细胞的质粒上是否含目的基因。10创新设计创新设计（2）使使用用“目目的的基基因因”作作探探针针，运运用用“分分子子杂杂交交技技术术”检检测测目目的的基基因因是是否否转转录录出出特特定定mRNA。（3）采采用用“抗抗原原抗抗体体杂杂交交技技术术”，从从转转基基因因生生物物中中提提取取蛋蛋白白质质（作作抗抗原原）与与相相应应抗体杂交，依据是否出现杂交带确认目的基因是否抗体杂交，依据是否出现杂交带确认目的基因是否“指导指导”特定蛋白质的合成。特定蛋白质的合成。（4）采采用用抗抗虫虫、抗抗病病毒毒等等“接接种种实实验验”进进行行目目的的基基因因成成功功表表达达的的“个个体体生生物物学学”水水平的检测平的检测。11创新设计创新设计【例例证证】 （2016全全国国卷卷，40）图图（a）中中的的三三个个DNA片片段段上上依依次次表表示示出出了了EcoR、BamH和和Sau3A三三种种限限制制性性内内切切酶酶的的识识别别序序列列与与切切割割位位点点，图图（b）为为某某种种表表达达载载体的示意图（载体上的体的示意图（载体上的EcoR、Sau3A的切点是唯一的）的切点是唯一的）。12创新设计创新设计根据基因工程的有关知识，回答下列问题：根据基因工程的有关知识，回答下列问题：（1）经经BamH酶酶切切后后得得到到的的目目的的基基因因可可以以与与上上述述表表达达载载体体被被酶酶切切后后的的产产物物连接，理由是连接，理由是_。（2）若若某某人人利利用用图图（b）所所示示的的表表达达载载体体获获得得了了甲甲、乙乙、丙丙三三种种含含有有目目的的基基因因的的重重组组DNA分分子子，如如图图（c）所所示示，这这三三种种重重组组DNA分分子子中中，不不能能在在宿宿主主细细胞胞中中表表达达目目的的基因产物的有基因产物的有，不能表达的原因，不能表达的原因是是_。13创新设计创新设计图（c）（3）DNA连连接接酶酶是是将将两两个个DNA片片段段连连接接起起来来的的酶酶，常常见见的的有有和和，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是_。14创新设计创新设计慧眼识图获取信息慧眼识图获取信息（1）三种限制酶切割结果）三种限制酶切割结果分析分析15创新设计创新设计（2）表达载体与重组）表达载体与重组DNA分子分子分析分析16创新设计创新设计答答案案（1）Sau3A两两种种酶酶切切割割后后产产生生的的片片段段具具有有相相同同的的黏黏性性末末端端（2）甲甲、丙丙甲甲中中目目的的基基因因插插入入在在启启动动子子的的上上游游，丙丙中中目目的的基基因因插插入入在在终终止止子子的的下下游游，二二者者的的目目的基因均不能被转录（的基因均不能被转录（3）EcoliDNA连接酶连接酶T4DNA连接酶连接酶T4DNA连接酶连接酶17创新设计创新设计1.（2019湖湖南南长沙沙长郡郡中中学学月月考考）下下图图是是利利用用工工程程菌菌（大大肠肠杆杆菌菌）生生产产人人生生长长激激素素的的实实验验流流程程。所所用用的的pBR322质质粒粒含含有有限限制制酶酶Pst 、EcoR 和和Hind 的的切切点点各各一一个个，且且三三种种酶酶切切割割形形成成的的末末端端各各不不相相同同，而而Ampr表表示示氨氨苄苄青青霉霉素素抗抗性性基基因因，Tetr表示四环素抗性基因。请回答以下相关问题表示四环素抗性基因。请回答以下相关问题：18创新设计创新设计（1）过过程程所所用用到到的的组组织织细细胞胞是是，过过程程所所用用的的酶酶是是。过过程程常常用用溶液处理大肠杆菌。溶液处理大肠杆菌。（2）经）经过程得到的互补过程得到的互补DNA片段，称为片段，称为。（3）如如果果用用限限制制酶酶Pst 、EcoR 和和Hind 对对图图中中质质粒粒进进行行切切割割，用用一一种种酶酶、两两种种酶酶和和三三种种酶酶分分别别切切割割时时形形成成的的DNA片片段段种种类类与与用用一一种种酶酶和和两两种种酶酶分分别别切切割割时时形形成成的的DNA片片段段种种类类（填填“相相同同”或或“不不同同”），这这些些种种类类的的DNA片片段段中中含含有有完完整整氨氨苄苄青青霉霉素素抗抗性性基基因因的的DNA片片段段和和四四环环素素抗抗性性基基因因的的DNA片片段段分分别别有有种种和和种种。19创新设计创新设计（4）如如果果只只用用限限制制酶酶Pst 切切割割目目的的基基因因和和质质粒粒，完完成成过过程程、后后（受受体体大大肠肠杆杆菌菌不不含含Ampr、Tetr），将将三三角角瓶瓶内内的的大大肠肠杆杆菌菌先先接接种种到到甲甲培培养养基基上上，形形成成菌菌落落后后用用无无菌菌牙牙签签挑挑取取培培养养基基甲甲上上的的单单个个菌菌落落，分分别别接接种种到到乙乙和和丙丙两两个个培培养养基基的的相相同同位位置置上上，一一段段时时间间后后，菌菌落落的的生生长长状状况况如如图图乙乙、丙丙所所示示。接接种种到到甲甲培培养养基基上上的的目目的的是是筛筛选选的的大大肠肠杆杆菌菌；接接种种到到培培养养基基乙乙上上的的大大肠肠杆杆菌菌菌菌落落，能能存存活活的的大大肠肠杆杆菌菌体体内内导导入入的的是是。含含有有目目的的基基因因的的大大肠肠杆杆菌菌在在培培养养基基乙和丙上的生存情况乙和丙上的生存情况是是_。20创新设计创新设计（5）将将大大肠肠杆杆菌菌培培养养在在含含氨氨苄苄青青霉霉素素、四四环环素素培培养养基基上上的的过过程程，属属于于基基因因工工程程基基本本操作中操作中的的_步骤。该基因工程中的步骤。该基因工程中的pBR322质粒彻底水解的产物质粒彻底水解的产物是是_。解解析析（1）过过程程获获得得的的是是人人生生长长激激素素mRNA，所所以以组组织织细细胞胞取取自自人人垂垂体体组组织织细细胞胞；过过程程构构建建基基因因表表达达载载体体的的酶酶是是DNA连连接接酶酶；过过程程将将基基因因表表达达载载体体导导入入大大肠肠杆杆菌菌前前，常常用用CaCl2溶溶液液处处理理大大肠肠杆杆菌菌，使使之之成成为为感感受受态态细细胞胞。（2）过过程程是是人人的的生生长长素素mRNA逆转录形成逆转录形成cDNA的过程的过程。21创新设计创新设计（3）Pst 、EcoR 和和Hind 三三种种酶酶的的切切点点分分别别用用1、2、3表表示示，一一种种酶酶酶酶切切时时，一一共共可可以以得得到到3种种相相同同长长度度的的片片段段；两两种种酶酶酶酶切切时时，可可得得到到12，21，23，32，13，31六六种种片片段段；三三种种酶酶酶酶切切时时，可可得得到到12，23，31三三种种片片段段，与与前前面面重重复复，因因此此用用一一种种酶酶、两两种种酶酶和和三三种种酶酶分分别别切切割割时时形形成成的的DNA片片段段种种类类与与用用一一种种酶酶和和两两种种酶酶分分别别切切割割时时形形成成的的DNA片片段段种种类类相相同同。这这些些种种类类的的DNA片片段段中中含含有有完完整整氨苄青霉素抗性基因的氨苄青霉素抗性基因的DNA片段和四环素抗性基因的片段和四环素抗性基因的DNA片段分别有片段分别有3种和种和3种种。22创新设计创新设计（4）在在甲甲中中能能生生长长的的是是具具有有四四环环素素抗抗性性的的细细菌菌，含含有有四四环环素素抗抗性性基基因因；在在乙乙培培养养基基中中能能生生长长的的是是具具有有四四环环素素和和氨氨苄苄青青霉霉素素抗抗性性的的细细菌菌，所所以以导导入入的的是是完完整整的的pBR322质质粒粒或或含含有有Ampr、Tetr的的质质粒粒。与与丙丙相相比比，乙乙培培养养基基中中少少了了两两个个菌菌落落，说说明明丙丙培培养养基基中中这这两两个个菌菌落落中中的的大大肠肠杆杆菌菌成成功功导导入入了了重重组组质质粒粒，而而且且目目的的基基因因插插入入质质粒粒后后，破破坏坏了了氨氨苄苄青青霉霉素素抗抗性性基基因因，使使含含有有目目的的基基因因的的大大肠肠杆杆菌菌不不能能在在含含有有氨氨苄苄青青霉霉素素的的乙乙培培养养基基上上生生长长，但但四四环环素素抗抗性性基基因因是是完完好好的的，则则含含有有目目的的基基因因的的大大肠肠杆杆菌菌能能在在含含有有四四环素的丙培养基上环素的丙培养基上生长。生长。23创新设计创新设计（5）将将大大肠肠杆杆菌菌培培养养在在含含氨氨苄苄青青霉霉素素、四四环环素素培培养养基基上上的的过过程程，属属于于基基因因工工程程中中的的筛筛选选含含目目的的基基因因的的受受体体细细胞胞步步骤骤。该该基基因因工工程程中中的的pBR322质质粒粒的的化化学学本本质质是是DNA，其彻底水解的产物是磷酸、脱氧核糖和四种含氮碱基。其彻底水解的产物是磷酸、脱氧核糖和四种含氮碱基。答案答案（1）人垂体组织细胞）人垂体组织细胞DNA连接酶连接酶CaCl2（2）cDNA（3）相相同同33（4）含含四四环环素素抗抗性性基基因因完完整整的的pBR322质质粒粒（或或含含有有Ampr、Tetr的的质质粒粒）在在丙丙中中能能存存活活，在在乙乙中中不不能能存存活活（5）筛筛选选含含目目的的基基因因的受体细胞磷酸、脱氧核糖、四种含氮碱的受体细胞磷酸、脱氧核糖、四种含氮碱基基24创新设计创新设计2.（2019河河南南名名校校联盟盟调研研）如如图图所所示示为为培培育育转转基基因因细细菌菌的的操操作作流流程程，回回答答下下列列问问题题：（1）图图中中过过程程所所用用工工具具酶酶有有。为为了了防防止止载载体体和和外外源源DNA自自连连，应如何操作？应如何操作？_。（2）当当细细菌菌的的转转化化过过程程中中吸吸收收的的外外源源DNA是是病病毒毒DNA时时，该该转转化化过过程程又又称称转转染染。图中外源图中外源DNA来自来自。为了提高转染效率，应使用。为了提高转染效率，应使用处理细菌。处理细菌。（3）图中）图中过程，重组过程，重组DNA增殖时需要哪些条件？增殖时需要哪些条件？_。25创新设计创新设计（4）图图中中过过程程，筛筛选选含含重重组组质质粒粒的的细细菌菌需需用用到到基基因因的的功功能能。已已知知所所用用载载体体内内有有青青霉霉素素抗抗性性基基因因和和四四环环素素抗抗性性基基因因两两种种抗抗性性基基因因，请请写写出出能能在在含含四四环环素素的的培培养养基基上上生生长长，但但不不能能在在含含青青霉霉素素的的培培养养基基上上生生长长的的细细菌菌即即为为含含外外源源DNA细细菌菌的的前前提提条件：条件：_（答出两点即可）。（答出两点即可）。解解析析根根据据转转染染的的定定义义可可知知，培培育育图图示示转转基基因因细细菌菌的的外外源源DNA应应来来自自（DNA）病病毒毒。另外，限制酶也可以答成限制性核酸内切酶另外，限制酶也可以答成限制性核酸内切酶。26创新设计创新设计答案答案（1）限制酶和）限制酶和DNA连接酶应使用两种限制酶同时切割载体和外源连接酶应使用两种限制酶同时切割载体和外源DNA（2）（）（DNA）病毒）病毒Ca2（3）模板、原料、酶和能量等）模板、原料、酶和能量等（4）标标记记原原细细菌菌不不具具有有青青霉霉素素和和四四环环素素的的抗抗性性基基因因，外外源源DNA插插入入到到载载体体的的青青霉霉素抗性基因素抗性基因内部内部27本节内容结束