第十一章第十一章 生物素生物素- -亲合亲合素放大技术素放大技术第二节第二节 亲合素、链霉亲合素的理化性质与标志亲合素、链霉亲合素的理化性质与标志一、理化特性一、理化特性二、亲合素或链酶亲合素的标志二、亲合素或链酶亲合素的标志第一节第一节 生物素的理化性质与标志生物素的理化性质与标志一、活化生物素一、活化生物素二、活化生物素标志蛋白质二、活化生物素标志蛋白质第三节第三节 生物素生物素- -亲合素系统的特点亲合素系统的特点一、灵敏度二、特异性一、灵敏度二、特异性三、稳定性四、适用性三、稳定性四、适用性五、其他五、其他思索题思索题小结小结第四节第四节 生物素生物素- -亲合素系统的运用亲合素系统的运用一、生物素一、生物素- -亲合素系统根本类型及原理亲合素系统根本类型及原理二、生物素二、生物素- -亲合素系统在酶免疫测定中的运用亲合素系统在酶免疫测定中的运用三、生物素三、生物素- -亲合素系统在荧光免疫技术中的运用亲合素系统在荧光免疫技术中的运用四、生物素四、生物素- -亲合素系统在放射免疫测定中的运用亲合素系统在放射免疫测定中的运用五、生物素五、生物素- -亲合素系统在分子生物学中的运用亲合素系统在分子生物学中的运用维生素维生素H H 动、植物组织中广泛动、植物组织中广泛 分布分布, ,卵黄和肝含量高卵黄和肝含量高MW 244.31kD.MW 244.31kD.I I环为咪咪唑酮环，可与，可与亲合合 素素结合合环为噻吩吩环，C2C2上戊酸上戊酸 侧链的未端的未端羧基是基是结合生合生 物大分子的独一构造物大分子的独一构造 I I I I 咪唑酮环咪唑酮环咪唑酮环咪唑酮环 噻吩环噻吩环噻吩环噻吩环 羧基羧基第一节第一节 生物素理化性质与标志生物素理化性质与标志一、活化生物素一、活化生物素 生物素侧链的末生物素侧链的末端羧基经化学修端羧基经化学修饰后制成带各种饰后制成带各种活性基团的衍生活性基团的衍生物活化生物素物活化生物素( (生物素化衍生物生物素化衍生物) )生物素活化生物素活化活化生物素易活化生物素易与抗原、抗体与抗原、抗体酶及核酸分子酶及核酸分子中相应基团偶中相应基团偶联构成生物素联构成生物素化标志物化标志物 标志蛋白质氨基的活化生物素标志蛋白质氨基的活化生物素 标志蛋白质醛基的活化生物素标志蛋白质醛基的活化生物素 标志蛋白质巯基的活化生物素标志蛋白质巯基的活化生物素 标志核酸的活化生物素标志核酸的活化生物素 活化生物素活化生物素标志蛋白质氨基的活化生物素标志蛋白质氨基的活化生物素BNHSBNHS分子可与蛋白质分子可与蛋白质 赖氨酸的氨基构成肽键赖氨酸的氨基构成肽键 BNHSBNHS适用标志抗体和适用标志抗体和 中性或偏碱性的蛋白质中性或偏碱性的蛋白质生物素生物素N-N-羟基丁二酰胺羟基丁二酰胺碳二亚胺碳二亚胺生物素羟生物素羟基琥珀酰基琥珀酰亚胺酯亚胺酯BNHS BNHS 如何减小空间位阻？如何减小空间位阻？长臂活化生物素长臂活化生物素BCNHSBCNHS：生物素和生物素和N-N-羟基丁二酰亚胺之间添羟基丁二酰亚胺之间添加了两个加了两个6-6-氨基已糖分子基团，形氨基已糖分子基团，形成连结臂，生物素与大分子基团的成连结臂，生物素与大分子基团的间隔间隔 标志蛋白质醛基的活化生物素标志蛋白质醛基的活化生物素生物素酰肼生物素酰肼(BHZ)(BHZ)：水合肼与生物素的合成物：水合肼与生物素的合成物 主要用于标志偏酸性糖蛋白主要用于标志偏酸性糖蛋白 肼化生物胞素肼化生物胞素(BCHZ) (BCHZ) ：生物素与赖氨酸衔接：生物素与赖氨酸衔接 后，再与无水肼反响而成。后，再与无水肼反响而成。 除醛基外，除醛基外， BCHZ BCHZ还可标志氨基还可标志氨基标志蛋白质巯基的活化生物素标志蛋白质巯基的活化生物素马来酰亚胺马来酰亚胺- -丙酰丙酰- -生物胞素生物胞素MPB)MPB)能特异地与蛋白质巯基结合的活化能特异地与蛋白质巯基结合的活化生物素生物素 标志核酸的活化生物素标志核酸的活化生物素光生物素光生物素(photobiotin)(photobiotin) 侧链上衔接的芳香基叠氮物基团侧链上衔接的芳香基叠氮物基团, , 经光照经光照后后, , 变为芳香变为芳香 基硝基苯，可直接与腺嘌呤氨基结合基硝基苯，可直接与腺嘌呤氨基结合, , 构构成成B-B-核酸探针核酸探针 生物素脱氧核苷三磷酸生物素脱氧核苷三磷酸Bio-dUTPBio-dUTP 作为作为TTPTTP的构造类似物，可采用缺口移的构造类似物，可采用缺口移 位法掺入到双链位法掺入到双链DNADNA中。中。BNHS和和BHZ 可直接标志核酸，可直接标志核酸，但对碱基配对有影但对碱基配对有影响。响。活化生物素经过侧链与蛋白分子衔接；活化生物素经过侧链与蛋白分子衔接；一个蛋白分子可被多个生物素标志多价性；一个蛋白分子可被多个生物素标志多价性；对对BNHS多标志抗体多标志抗体, BHZ那么多标志微酸性抗原；那么多标志微酸性抗原； 抗原、抗体标志后活性不变；抗原、抗体标志后活性不变；可对标志资料如酶标志：碱性磷酸酶标志后可对标志资料如酶标志：碱性磷酸酶标志后 活性将降低；活性将降低；二、生物素标志蛋白质二、生物素标志蛋白质选择活化生物素：依抗原或抗体分子所活化生物素：依抗原或抗体分子所带可可标志基志基团 的种的种类氨基、氨基、醛基或基或巯基以及分子的酸碱性；基以及分子的酸碱性；控制生物素：蛋白控制生物素：蛋白质比例比例 生物素：生物素：IgG IgG 用量比用量比(mg/mg)(mg/mg)宜宜为2:1, IgG2:1, IgG运用运用浓度度 0.55g/ml; 0.55g/ml; 生物素生物素1313个个/Ag/Ag，3535个个/Ab/Ab；运用交运用交联臂减少空臂减少空间阻力阻力第二节第二节 亲合素、链霉亲合素的理亲合素、链霉亲合素的理化性质与标志化性质与标志亲合素亲合素(avidin, AV) (avidin, AV) 和链霉亲合素和链霉亲合素(streptavidin, SA)(streptavidin, SA)是生物素的天然特异性结合物。而是生物素的天然特异性结合物。而且，二者均为大分子蛋白，因此几乎一切用于标志的物且，二者均为大分子蛋白，因此几乎一切用于标志的物质均可以同亲合素质均可以同亲合素AVAV或链酶亲合素或链酶亲合素SASA结合。结合。 构造构造 四四亚亚基糖蛋白基糖蛋白 四四肽链肽链蛋白蛋白 无糖基无糖基PI 10.5 6PI 10.5 6结结合位合位 色氨酸色氨酸 色氨酸色氨酸生物素生物素 4 4 4 4Ka 1015 1015Ka 1015 1015活性活性 13 1315 1515 151818亲亲合素合素合素合素A A A A链链霉霉霉霉亲亲合素合素合素合素(SA)(SA)(SA)(SA)一、理一、理 化化 特特 性性二、亲合素二、亲合素/链霉亲合素标志链霉亲合素标志标志物：酶、胶体金标志物：酶、胶体金 异硫氰酸荧光素异硫氰酸荧光素FITCFITC HRP-AV(SA)HRP-AV(SA) 过碘酸钠、戊二醛过碘酸钠、戊二醛ABC/SABC ABC/SABC 预制预制AV(SAV)-BiotinAV(SAV)-Biotin第三节第三节 生物素生物素- -亲合素系统的特点亲合素系统的特点一、灵敏度一、灵敏度二、特异性二、特异性三、稳定性三、稳定性四、适用性四、适用性五、其他五、其他第四节第四节 生物素生物素- -亲合素系统的运用亲合素系统的运用生物素与亲合素之间结合的亲合生物素与亲合素之间结合的亲合力高、特异性强，各自均可以与各型力高、特异性强，各自均可以与各型大小分子结合，以及二者在结合反响大小分子结合，以及二者在结合反响时具有的多级放大作用等优越性，使时具有的多级放大作用等优越性，使BASBAS及其相关技术被广泛运用在各种标及其相关技术被广泛运用在各种标志免疫分析技术领域中，尤其为标志志免疫分析技术领域中，尤其为标志免疫检测自动化分析做出了极大的奉免疫检测自动化分析做出了极大的奉献。献。 一、生物素一、生物素- -亲合素系统根本类型亲合素系统根本类型及原理及原理BABBAB法：法： Ag+BAb Ag-AbB A Ag-AbB-A Ag+BAb Ag-AbB A Ag-AbB-A BE Ag-AbB-A-BE BE Ag-AbB-A-BE 特点：以游离特点：以游离A A分分别衔接接B-AbB-Ab和和B-E B-E BABA法法Ag+BAb Ag-AbB AE Ag-AbB-A-Ag+BAb Ag-AbB AE Ag-AbB-A-BEBE特点：以特点：以A-E/SA-EA-E/SA-E替代替代BABBAB法中的法中的A A，省，省 却了加却了加B-EB-E的步的步骤3. 3. ABC ABC法法 A+BE A- BE-ABC A+BE A- BE-ABC Ag+BAb Ag-AbB ABC Ag-AbB- Ag+BAb Ag-AbB ABC Ag-AbB-ABC ABC 特点特点: :将将BABBAB法中的法中的A A先与先与B-EB-E结合，制合，制备成复合物成复合物ABCABC二、生物素二、生物素- -亲合素系统在酶免疫亲合素系统在酶免疫测定中的运用测定中的运用BASBAS在在ELISAELISA中的运用中的运用 生物素生物素- -亲合素系统在均相酶免疫测定亲合素系统在均相酶免疫测定 三、生物素三、生物素- -亲合素系统在荧光免亲合素系统在荧光免疫技术中的运用疫技术中的运用 BAS BAS用于荧光抗体技术，通常采用用于荧光抗体技术，通常采用BABA法，法，即用荧光素直接标志亲合素或链酶亲即用荧光素直接标志亲合素或链酶亲合素；也可采用游离亲合素或链酶合素；也可采用游离亲合素或链酶亲合素搭桥，两端分别衔接生物素化亲合素搭桥，两端分别衔接生物素化抗体和荧光素标志的生物素抗体和荧光素标志的生物素BABBAB法或法或荧光标志的抗亲合素或链酶亲合素荧光标志的抗亲合素或链酶亲合素抗体的夹心法。抗体的夹心法。 四、生物素四、生物素- -亲合素系统在放射免亲合素系统在放射免疫测定中的运用疫测定中的运用BASBAS主要与免疫放射分析主要与免疫放射分析(IRMA)(IRMA)检测体系偶检测体系偶联，用于对终反响的放大联，用于对终反响的放大BABA法法 BASBAS也可用于也可用于IRMAIRMA反响后反响后B B、F F成分的分别成分的分别 五、生物素五、生物素- -亲合素系统在分子生亲合素系统在分子生物学中的运用物学中的运用以生物素标志核酸探针进展的定位检测以生物素标志核酸探针进展的定位检测用用BAS制备的亲和吸附剂进展基因的分别制备的亲和吸附剂进展基因的分别纯化纯化将免疫测定技术与将免疫测定技术与PCR结合建立免疫结合建立免疫-PCR(immuno-PCR)用于抗原的检测用于抗原的检测 思索题思索题1.1.生物素的分子构造特点是什么？生物素的分子构造特点是什么？2.2.生物素生物素经过什么构造、方式与生物大分子相什么构造、方式与生物大分子相连结？3.3.亲合素或合素或链霉霉亲合素的分子构造、理化性合素的分子构造、理化性质有何特点？有何特点？4.4.为什么什么亲合素、合素、链霉霉亲合素具有合素具有“桥联作用？作用？5.5.亲合素、合素、链霉霉亲合素可以被哪些示踪合素可以被哪些示踪剂标志？志？6.6.为什么生物素什么生物素亲合素系合素系统具有放大作用？具有放大作用？7.7.生生物物素素与与亲合合素素或或链霉霉亲合合素素的的结合合能能否否与与抗抗原原抗抗体体结合合一一样？8.8.生生物物素素亲合合素素系系统放放大大的的是是反反响响过程程还是是单一一检测信信号号的能量？的能量？9.9.生物素、生物素、亲合素或合素或链霉霉亲合素如何与合素如何与标志免疫技志免疫技术联接？接？10.10.如如何何将将生生物物素素链霉霉亲合合素素放放大大系系统用用于于一一切切双双位位点点ELISA?ELISA?小小 结结生生物物素素亲合合素素链霉霉亲合合素素系系统具具有有的的多多级放放大大独独特特效效应，可可极极大大地地提提高高分分析析测定定的的灵灵敏敏度度；二二者者之之间的的高高亲和和、高高特特异异结合合以以及及既既可可偶偶联生生物物大大分分子子，又又可可衔接接标志志资料料的的特特性性，使使该系系统在在标志志免免疫疫分分析析技技术领域域中中的的应器器具具有有很很强的的稳定定性性和和适适用用性性。该系系统有有二二种种根根本本类型型：以以游游离离亲合合素素为中中间物物，分分别衔接接包包含含生生物物素素化化大大分分子子的的待待检反反响响体体系系和和标志志生生物物素素的的BABBAB法法或或ABCABC技技术；另另一一类是是直直接接用用标志志亲合合素素衔接接生生物物素素化化大大分分子子反反响响体体系系进展展检测的的BABA法或法或LABLAB。在在生生物物素素亲合合素素链霉霉亲合合素素放放大大系系统运运用用中中，无无论采采用用酶、荧光光素素或或发光光物物作作为检测示示踪踪剂，均均是是待待测抗抗原原与与生生物物素素化化抗抗体体反反响响构构成成复复合合物物后后，再再利利用用生生物物素素与与亲合合素素间的的多多价价放放大大结合合特特性性，或或直直接接与与标有有示示踪踪剂的的生生物物素素结合合BABA、LABLAB法法，或或依依次次与与亲合合素素链霉霉亲合合素素、生生物物素素示示踪踪标志志物物反反响响衔接接成成聚聚合合物物BABBAB、ABCABC法法，最最终使使待待测反反响响信信号号被被放放大，提高大，提高检测方法的灵敏度。方法的灵敏度。