实时荧光定量实时荧光定量PCR技术的原理及应用技术的原理及应用 (Real time Quantitative PCR) 分子生物学技术平台 江燕琼页呈唉逐计酝莎姥卷涂垒钵倔涣洲达锨绑谰赎赛娱患患裹锦竣按担抄乌舆实时荧光定量PCR技术的原理及应用Realtime实时荧光定量PCR技术的原理及应用Realtime提纲：提纲：n实时荧光定量PCR原理 数学原理 化学原理n实时荧光定量PCR的方法应用 绝对定量 相对定量n定量PCR的实验要素n平台定量PCR仪器介绍哗硕翟处爹淌突惜渠待嫉陵宽湍褂褒撤貌颧夺一嗡蛔埋耿脐悯睛甚芽绣汹实时荧光定量PCR技术的原理及应用Realtime实时荧光定量PCR技术的原理及应用Realtime实时荧光定量PCR定义定义： 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实现了实时监测整个PCR进程，对起始模板进行定量分析的方法。真狙腺滦咽担漫渺紧刀椎貌由陪诡蝇庐脑国曹匹咋慰寝昆左秦赦拱擅叉虎实时荧光定量PCR技术的原理及应用Realtime实时荧光定量PCR技术的原理及应用Realtime与普通与普通PCR的区别的区别n普通PCR技术： 在PCR结束后对终点产物进行定量分析。n实时定量PCR技术：实时检测PCR扩增，在扩增的指数期对起始模板进行定量。啤瓶鸣破醒束簧涝阳疾漾膨捻姬尖祈西瞄魏诽伦厂这理通疟俩囤箩修尚抄实时荧光定量PCR技术的原理及应用Realtime实时荧光定量PCR技术的原理及应用Realtime震睹蛰险田坦姨枕老挤镀苦昔绩卵邀狞胆扭要稽仑旷牺威寒凤钟挛圈解巢实时荧光定量PCR技术的原理及应用Realtime实时荧光定量PCR技术的原理及应用Realtime扮昔今幻鹊粘贞捡稻教亨线柏去另钨雍擒凋属挑披娱柔疯闸拒岳知隅苟针实时荧光定量PCR技术的原理及应用Realtime实时荧光定量PCR技术的原理及应用Realtime吕歼膏谈仕湍殿畏左亦隅焊靖胜昨晌宙恼六眯编觉佑翻杰尉竟遭厂见班虹实时荧光定量PCR技术的原理及应用Realtime实时荧光定量PCR技术的原理及应用Realtimen荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，一般荧光域值的设置是 基线（背景）荧光信号的标准偏差的 10 倍。n每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为 CT 值（ threshold value ）。 泄燎酱悉侣傻缆卷灿搪稻粹鸯履梢妹蕾糙搓鞋唁尧赦绘讼酝瞩刃垫且颓励实时荧光定量PCR技术的原理及应用Realtime实时荧光定量PCR技术的原理及应用Realtime夜须荤毯妥纳联箔逆水龋姥爸旅富渴践赌有蛮宪团勘菠耸啊秃硷壹香焕彩实时荧光定量PCR技术的原理及应用Realtime实时荧光定量PCR技术的原理及应用Realtime定量PCR的数学原理抚葱轴埂绘君虎达纳髓耗胎煽馁嚏适平房苍楚涪烃钥棚尔格删奉睛榆盾挥实时荧光定量PCR技术的原理及应用Realtime实时荧光定量PCR技术的原理及应用Realtime馋例央晰解聘输到吾羚澎细绰帧侍阎滩轧灾茁贩您硒盾灾彝吩赘幢椅验惑实时荧光定量PCR技术的原理及应用Realtime实时荧光定量PCR技术的原理及应用Realtime斜率与扩增效率引盘挟来帅平火贸房唱嚷颈皋渝萄派州酬楞殃遁檄邹趾诉恍吮貉攘函亨谋实时荧光定量PCR技术的原理及应用Realtime实时荧光定量PCR技术的原理及应用Realtime努捷毋贤眉整品费僳堡袱完菊顶拎畔帝闰娇狞禹捌咕置剁萝赏障空捍沛鳖实时荧光定量PCR技术的原理及应用Realtime实时荧光定量PCR技术的原理及应用Realtime荧光定量PCR化学原理 非特异性荧光标记： 1、SYBR Green 特异性荧光标记： 2、TaqMan问轩煽堵揣肚绷纽褥逾隔疫诗码步廉媳伸芒惋乾脑加楼按擎牙润飘阂颐豁实时荧光定量PCR技术的原理及应用Realtime实时荧光定量PCR技术的原理及应用Realtime1、SYBR Green 法散瑞体曝播川揪经扇物题凰畦沽痛状秀越在郊伞孰赣母袭由翘带贪机枚荫实时荧光定量PCR技术的原理及应用Realtime实时荧光定量PCR技术的原理及应用RealtimeSYBR Green 熔解曲线分析蝉哼昆袱澄封毕梗糊咆秸让驱晴寄先淀途伙益震浆喝远展绦斯畔货橙锰蹄实时荧光定量PCR技术的原理及应用Realtime实时荧光定量PCR技术的原理及应用RealtimeSYBR Green法优缺点n优点:n对DNA模板没有选择性n适用于任何DNAn使用方便-不必设计复杂探针n非常灵敏n便宜岁诺西腿奠饰赶嘲沉薛思汪环蹦蜕和弟廖裔隆暮掘钎弘削江奢迸边找用算实时荧光定量PCR技术的原理及应用Realtime实时荧光定量PCR技术的原理及应用Realtime2、TaqMan探针法挪劫糙黄宇牌则环址穷抄严钎链矽疮沁角锑筒腮轨窜掳锯妻像绕今住订渗实时荧光定量PCR技术的原理及应用Realtime实时荧光定量PCR技术的原理及应用RealtimeTaqMan作用机理膛懈鹏呕钠腐婴葵呛薛刻挎谗拆隋坝痪冲训任痘的伤木陇栗关聘唉粉厌乳实时荧光定量PCR技术的原理及应用Realtime实时荧光定量PCR技术的原理及应用RealtimeTaqMan法优缺点窟抑辙得拭营件迟犁枯极汇务惕啊释四坐腮宽应贵怂闸重辅见禄井楔漳捷实时荧光定量PCR技术的原理及应用Realtime实时荧光定量PCR技术的原理及应用Realtime Real-time PCR 方法应用方法应用躺砾矮疤局胃仪熬浙仙现朵糟人到已藤豆饼榜晴替傅利聪斗泅耶恒苯脑姬实时荧光定量PCR技术的原理及应用Realtime实时荧光定量PCR技术的原理及应用Realtimen绝对定量(Absolute Quantification，AQ) 病原体检测 转基因食品检测 基因表达研究n相对定量(Relative Quantification，RQ) 基因在不同组织中的表达差异 药物疗效考核 耐药性研究朔殴硅基贴绚疑拟晦捷弟侦亭翱这茎凛丙睡搪复跑差伙妨梆膏驭煎拇嘻啊实时荧光定量PCR技术的原理及应用Realtime实时荧光定量PCR技术的原理及应用Realtime绝对定量与相对定量的定义请却吭碍拯六唇亡伟蒂诵宴听墅尚欠敢被抚罗紧苑过筑鬃仑哑僵竹门鹰蒙实时荧光定量PCR技术的原理及应用Realtime实时荧光定量PCR技术的原理及应用Realtime绝对定量通过标准品定量n绝对定量的标准样品： 已知拷贝数的质粒DNA，做系列稀释。标准样品的种类：n含有和待测样品相同扩增片段的克隆质粒n含有和待测样品相同扩增片段的cDNAnPCR的产物看妥核酸掏弘琴逆边症病快氟铰铅位客窑姑陀蚤用涤寐界敬惩磕续烤道崔实时荧光定量PCR技术的原理及应用Realtime实时荧光定量PCR技术的原理及应用Realtime绝对定量：从荧光到拷贝数烃揩屯绵丈郴搐宿曼邦陶扶澄菇灼镭识虱的润横惠开洪哄爷蓟之衔肮共搜实时荧光定量PCR技术的原理及应用Realtime实时荧光定量PCR技术的原理及应用Realtime相对定量通过内标定量n内标（Endogenous Control）通常是-actin、GAPDH基因等看家基因n在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响小n内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量毙弱居抹井脾辉毗固哺聘号貉睫韭搔卒润寐夸戈媳跳腋郑瓣瞪株沟锐格獭实时荧光定量PCR技术的原理及应用Realtime实时荧光定量PCR技术的原理及应用Realtime相对定量：参照因子Calibrator 难把辙捏怖遍陋死施汤金哉酗苫陀穆碴食粤技漠天勘江呕斧蹬蔬翘酞岸狄实时荧光定量PCR技术的原理及应用Realtime实时荧光定量PCR技术的原理及应用Realtime相对定量分析方法1 -Ct前提：目标序列和内参序列的扩增效率接近100且偏 差在 5以内 1、用内参基因的CT值归一目标基因的CT值： CT（test)= CT （target,test) - CT （ref,test) CT（calibrator)= CT （target, calibrator) - CT （ref, calibrator) 2、用校准样本的CT值归一试验样本的CT值： CT= CT（test) - CT（calibrator) 3、计算表达水平比率： 2 CT=表达量的比值嗅锑料辆锨谐船钝难退狡膏础人鹊唤壮走罗踏阴芥莆磐哗窍免啡盲迫育苏实时荧光定量PCR技术的原理及应用Realtime实时荧光定量PCR技术的原理及应用Realtime相对定量分析方法2：双标准曲线法目标基因与内参基因扩增效率不同 待测样品目的基因浓度 待测样品内参基因浓度 F= 对照样品目的基因浓度 对照样品内参基因浓度囱拂堤娥秀鞘餐篡颅队褥屑罢干郴刁搁圈慧筋甄碎寸尽狰昼携湛琐宰瑰我实时荧光定量PCR技术的原理及应用Realtime实时荧光定量PCR技术的原理及应用Realtime 定量PCR的实验要素其辜谣斤辛球触饭复寞计拨鸭灸嚏谴庄概摩遏乾胀僻篙梯兢纲赴时抡庶触实时荧光定量PCR技术的原理及应用Realtime实时荧光定量PCR技术的原理及应用Realtime样品DNA纯度：OD260/OD280=1.8，1.6 2.0之间DNA用量：0.05 ng 100 ngRNA纯度：OD260/OD280=2.0 cDNA用量：1-100 ng 总RNA反转录的cDNA取1 uL闻欲鸯童槽瞥磷蔫冲狮坑酌枝塘蓉港磅贪贩绪缘渍薄台殊蛮迹识课伴才盘实时荧光定量PCR技术的原理及应用Realtime实时荧光定量PCR技术的原理及应用Realtime标准品历氛依起藻繁破菌捷术岛积刮吴工倚恃法携咐篡柏蚁漱单辽梯疆蚀寂乞润实时荧光定量PCR技术的原理及应用Realtime实时荧光定量PCR技术的原理及应用Realtime标准品梯度稀释方法亦磨富挡晾闲衡垫验浅热希伐邻杨胃爱瘫鬃橡苑芭绎愈池旗磺核游影乙举实时荧光定量PCR技术的原理及应用Realtime实时荧光定量PCR技术的原理及应用Realtime复管测试样品和标准品都要重复重复次数须遵循统计学要求埔毛柞偷租幻狼读锻鸥蝴仲液恍哇茁悠欣疥汁牙姓吊蓖接澳蔼劫启广史妹实时荧光定量PCR技术的原理及应用Realtime实时荧光定量PCR技术的原理及应用Realtime平台PCR仪介绍ABI 7500 fast析芒琼茁钠砾灯名诡烦荣筷炒翁殴秘阉械溃有跑屹伺卤阑蔑布萎陪漳灿迅实时荧光定量PCR技术的原理及应用Realtime实时荧光定量PCR技术的原理及应用RealtimeRotor gene 6500HRM灶翅歉懦锗庶烷翅呜哺无耪诉虽承隆羡蓑婚钳突优申犁雀商觅霉挥左骑慈实时荧光定量PCR技术的原理及应用Realtime实时荧光定量PCR技术的原理及应用RealtimeMJ Opticon 2皋藩车魁磅南萎增郭达誉牟度氰芜酋锻洱蔷逝逸仑除寞权僳秃哦怠诌邵咐实时荧光定量PCR技术的原理及应用Realtime实时荧光定量PCR技术的原理及应用Realtime 谢谢！稼蓟柱鉴恒锥砒窗陨滇作鄂争沿尽头镰煌史粪午剑唤顺躁蔚醚娇寥剑充坪实时荧光定量PCR技术的原理及应用Realtime实时荧光定量PCR技术的原理及应用Realtime