乙型肝炎病毒的异质性乙型肝炎病毒的异质性 及临床意义及临床意义 成成 军军 博士、教授博士、教授 北京地坛医院北京地坛医院 HBV的感染过程的感染过程第一局部第一局部乙型肝炎病毒的血清型乙型肝炎病毒的血清型 1 1 决定因素决定因素决定因素决定因素乙型肝炎病毒的血清型，由膜主蛋白序列来决定。乙型肝炎病毒的血清型，由膜主蛋白序列来决定。乙型肝炎病毒的血清型，由膜主蛋白序列来决定。乙型肝炎病毒的血清型，由膜主蛋白序列来决定。2 2 亲水结构区亲水结构区亲水结构区亲水结构区HBsAgHBsAg有两个亲水区：有两个亲水区：有两个亲水区：有两个亲水区：32-76 aa32-76 aa和和和和110-156 aa110-156 aa。HBsAgHBsAg亲水赖亲水赖亲水赖亲水赖氨酸改变，抗原活性消失。氨酸改变，抗原活性消失。氨酸改变，抗原活性消失。氨酸改变，抗原活性消失。3 3 共同决定簇共同决定簇共同决定簇共同决定簇139-147 aa139-147 aa是共同簇抗原是共同簇抗原是共同簇抗原是共同簇抗原a a必需的最小序列。必需的最小序列。必需的最小序列。必需的最小序列。 乙型肝炎病毒的血清学分型乙型肝炎病毒的血清学分型1 1 排斥决定簇排斥决定簇排斥决定簇排斥决定簇主蛋白还携带两对相互排斥的亚型决定簇主蛋白还携带两对相互排斥的亚型决定簇主蛋白还携带两对相互排斥的亚型决定簇主蛋白还携带两对相互排斥的亚型决定簇d/y d/y 122-134 aa122-134 aa指令指令指令指令d/yd/y决定簇和决定簇和决定簇和决定簇和w/r w/r 159-160 aa159-160 aa指令指令指令指令w/rw/r决定簇。决定簇。决定簇。决定簇。2 2 四个主要亚型四个主要亚型四个主要亚型四个主要亚型组成组成组成组成4 4个主要亚型：个主要亚型：个主要亚型：个主要亚型：adwadw、adradr、aywayw和和和和ayrayr。四个主要亚型四个主要亚型 除了除了4个主要亚型外，还有个主要亚型外，还有adyr、adwr、adyw/aywr和和adywr等复合亚型。不等复合亚型。不同亚型在外膜蛋白的前同亚型在外膜蛋白的前-S区序列和全基因组区序列和全基因组序列亦有相应的差异。序列亦有相应的差异。复合亚型复合亚型第二局部第二局部乙型肝炎病毒的基因型乙型肝炎病毒的基因型HBV基因型的定义分型方法是根据HBsAg主蛋白基因或全基因组核苷酸序列差异性进行的基因型分型，差异大于8%即被确定为另一基因型，按照这种分型方法，将HBV分为6种基因型，分别命名为A-F型，另有学者新定义了G、H型，尚待确定。 国内流行病学资料国内主要的基因型为B、C两型，台湾省的研究资料提示除E型外，其他基因型均可在华人HBV感染者中检出，B和C型占患者人群的85%。HBV HBV 的异质性的异质性 基因型基因型 基因型基因型基因型基因型 * * 地理分布地理分布地理分布地理分布 A A 北欧、西欧、美国、非洲北欧、西欧、美国、非洲北欧、西欧、美国、非洲北欧、西欧、美国、非洲 B B 中国、印度尼西亚、越南中国、印度尼西亚、越南中国、印度尼西亚、越南中国、印度尼西亚、越南 C C 中国、越南、朝鲜、日本中国、越南、朝鲜、日本中国、越南、朝鲜、日本中国、越南、朝鲜、日本 D D 地中海区、中东、印度地中海区、中东、印度地中海区、中东、印度地中海区、中东、印度 E E 西非西非西非西非 F F 美国印地安拿人、波利尼西亚美国印地安拿人、波利尼西亚美国印地安拿人、波利尼西亚美国印地安拿人、波利尼西亚 G G 欧洲、美国欧洲、美国欧洲、美国欧洲、美国 * * 根据根据根据根据 HBV HBV 全序列中核苷酸差异全序列中核苷酸差异全序列中核苷酸差异全序列中核苷酸差异 8% 8% Chu CJ et al. Hepatology 2002; 35(5):1274Chu CJ et al. Hepatology 2002; 35(5):1274第三局部第三局部乙型肝炎病毒基因准种的特点乙型肝炎病毒基因准种的特点 问问 题题 不同的慢性乙型肝炎患者之间血不同的慢性乙型肝炎患者之间血清中乙型肝炎病毒基因序列是不同的，清中乙型肝炎病毒基因序列是不同的，因此可以根据序列的差异分成不同的因此可以根据序列的差异分成不同的血清型血清型adradr、aywayw、adw adw 等，也可等，也可以分成不同的基因型以分成不同的基因型A A、B B、C C、D D、E E、F F、G G、H H。 问：同一个患者血液中不同的乙问：同一个患者血液中不同的乙型肝炎病毒之间其基因序列是否相同型肝炎病毒之间其基因序列是否相同？ 答：相同！或答：相同！或 不同！不同！型与准种型与准种基因型基因型 不同个体之间不同个体之间 血清型血清型 不同个体之间不同个体之间 准准 种种 单一个体单一个体 乙型肝炎病毒准种的定义乙型肝炎病毒准种的定义 乙型肝炎病毒在长期复制过程中，乙型肝炎病毒在长期复制过程中，由于逆转录过程其多聚酶缺乏严格的由于逆转录过程其多聚酶缺乏严格的校正机制，从而产生自发点突变，造校正机制，从而产生自发点突变，造成子代病毒基因序列之间的微小差异，成子代病毒基因序列之间的微小差异，因而血清中的乙型肝炎病毒基因序列因而血清中的乙型肝炎病毒基因序列是不同的。这种差异一般小于全长基是不同的。这种差异一般小于全长基因组的因组的5%5%。 有微小基因序列差异、但序列十有微小基因序列差异、但序列十分相近的乙型肝炎病毒组成的病毒群，分相近的乙型肝炎病毒组成的病毒群，这一病毒群时刻处于动态变化之中，这一病毒群时刻处于动态变化之中，乙型肝炎病毒的这种存在状态称为乙型肝炎病毒的这种存在状态称为“准种。准种。 英文：英文：quasispeciesquasispecies为什么以前没有注意？为什么以前没有注意？方法比较方法比较既往方案：既往方案：收集血清收集血清提取血清中提取血清中HBV DNA设计重叠设计重叠PCR引物引物PCR扩增扩增产物直接测序产物直接测序单一克隆序列单一克隆序列本研究方案本研究方案收集血清收集血清提取血清中提取血清中HBV DNA设计设计PCR引物引物PCR扩增扩增 TA克隆入质粒载体中克隆入质粒载体中随机选择单克隆测序随机选择单克隆测序多个克隆序列多个克隆序列SS基因准种的特点基因准种的特点前前-S1-S1、前、前-S2-S2、SSProtocol of Human Somatic Gene Therapy S 基因全长基因全长 PCR, 1400 bp 1 2 3 4 M 5 6 71 400 bpHBVHBV全全S S基因基因RFLPRFLP结果结果遗传树分析E853-A3E845-A12E845-B4E845-A16E845-A8Renbao GanN19 E5N19 A3N19 A8N19 E19EJ1 B13 EJ1 A4E67 B5E67 A1E67 A8E67 B1E67 B8N19 E5EJ1 B6EJ1 A12EJ1 B16HBVHBV准种特点分析准种特点分析 HBV DNA S Region HBV DNA X Region HBV DNA P Region HBV DNA C Region HBV DNA Pre-C 区区 HBV DNA 全长全长 HBV DNA基因准种的基因准种的个体化特点个体化特点HBsAgHBsAg氨基酸序列氨基酸序列RT702 A3 MENTT-LFGGA-VPFAQWFAG-RT702A14 MENTT-LFGGA-VPFAQWFAG-RT702 B3 MENTT-LFGGA-VPFAQWFAG-RT702A10 MENTT-LFGGA-VPFAQWFAG-RT522 B7 MESTT-LFGGA-VPFVQWFVG-RT522 A5 MESTT-LFGGA-VPFVQWFVG-RT522B11 MESTT-LFGGA-VPFVQWFVG-RT XJ A2 MENTT-LFGEA-VPFVQWFVG-RT XJ A6 MENTT-LFGEA-VPFVQ*FVG-RT XJ B5 MENTT-LFGEA-VPFVQWFVG-RT XJ C4 MENTT-LFGEA-VPFVQWFVG-变异的一些特点逆转录酶区变异的一些特点逆转录酶区RT702 A3 -SSNLSWLS-SHPIVLGF-VIGSWGTLPQEHIVLKIK-RT702A14 -SSNLSWLS-SHPIVLGF-VIGSWGTLPQEHIVLKIK-RT702 B3 -SSNLSWLS-SHPIVLGF-VIGSWGTLPQEHIVLKIK-RT702A10 -SSNLSWLS-SHPIVLGF-VIGSWGTLPQEHIVLKIK- RT522 B7 -SSNLTWLS-SHPIILGF-VIGSWGTLPQEHIVLKLK-RT522 A5 -SSNLTWLS-SHPIILGF-VIGSWGTLPQEHIVLKLK-RT522B11 -SSNLTWLS-SHPIILGF-VIGSWGTLPQEHIVLKLK-RT XJ A2 -SSNLSWLS-SHPIILGF-VIGCWGTLPQEHIVLKIK-RT XJ A6 -SSNLSWLS-SHPIILGF-VIGCWGTLPQEHIVLKIK-RT XJ B5 -SSNLSWLS-SHPIILGF-VIGCWGTLPQEHIVLKIK-RT XJ C4 -SSNLSWLS-SHPIILGF-VIGCWGTLPQEHIVLKIK-前前- -S2基因基因缺失突变的研究缺失突变的研究线线 索：索：S基因研究中发现前基因研究中发现前- -S2S2区多个缺失突区多个缺失突变株的存在变株的存在HBVHBV在慢性患者人群中的准种现象在慢性患者人群中的准种现象前前- -S2S2区缺失突变分析区缺失突变分析 总数 无缺失 缺失百分比HBeAg 阳性 36 23 1336%抗-HBe 阳性 15 1 1493%合计 51 24 2752%前前-S2-S2区缺失突变位点分析区缺失突变位点分析 位点位点 范围范围 702-4 nt 43-66 24 bp ZH-A6 nt 52-66 15 bp ZH-B4 nt 37-66 30 bp ZH-B12 nt 37-66 30 bp N314-5 nt 25-66 42 bp N314-7 nt 25-66 42 bp 811-B12 nt 52-66 15 bp不同病毒株突变位点adr MQWNSTTFHQALLDPRVRGLYFPAGGSSSGTVNPVPTTASPISSIFSRTGDPAPN702-1 -A-I-H702-4 -A-I-702-9 -G-A-T-I-702-10 -G-A-T-I-314-1 -T-Q-L-I-314-5 -L-314-7 -L-314-9 -T-Q-ZH-A6 -Q-ZH-B4 -ZH-B6 -ZH-B11 -ZH-B12 -142-A3 -142-A7 -142-A8 -H811-A7 -811-A8 -811-B12 -本研究的一些重要发现慢性乙肝患者体内存在有慢性乙肝患者体内存在有HBVHBV准种群。准种群。HBVHBV准种群中存有缺陷型病毒，即局部准种群中存有缺陷型病毒，即局部ORFORF编编码序列经突变终止了正常表达。码序列经突变终止了正常表达。前前C/CC/C区、区、X X区、前区、前-S2-S2区内部存有缺失突变，区内部存有缺失突变，尤其以后尤其以后2 2个区域多见。个区域多见。HBVHBV变异存在个体化现象。变异存在个体化现象。血液中发现了截短型外表抗原中蛋白血液中发现了截短型外表抗原中蛋白 关于准种研究的一些问题关于准种研究的一些问题乙型肝炎病毒的高变区与高保守区的界定？乙型肝炎病毒的高变区与高保守区的界定？乙型肝炎病毒准种与感染慢性化的关系？乙型肝炎病毒准种与感染慢性化的关系？乙型肝炎病毒准种群的漂变规律与肝纤维化的关系？乙型肝炎病毒准种群的漂变规律与肝纤维化的关系？乙型肝炎病毒准种群的漂变规律与肝细胞癌的关系？乙型肝炎病毒准种群的漂变规律与肝细胞癌的关系？干扰素治疗与乙型肝炎病毒准种群的漂变？干扰素治疗与乙型肝炎病毒准种群的漂变？拉米夫定治疗与乙型肝炎病毒准种群的漂变？拉米夫定治疗与乙型肝炎病毒准种群的漂变？耐药株与准种漂变规律的关系？耐药株与准种漂变规律的关系？需要多靶位的需要多靶位的“联合、序贯的治疗？联合、序贯的治疗？乙型肝炎病毒研究的乙型肝炎病毒研究的临床意义临床意义 第第 一一 首先是改变了我们既往对乙型肝首先是改变了我们既往对乙型肝炎病毒存在状态的看法。炎病毒存在状态的看法。 概念：概念： 1 1 差异，差异，2 2 相似，相似， 3 3 种群，种群，4 4 动态。动态。第第 二二 提高了我们的科研设计水平，以提高了我们的科研设计水平，以及学术论文的鉴赏水平。及学术论文的鉴赏水平。治疗前后比较治疗前后比较病情变化前后比较病情变化前后比较 印度寓言：盲人摸象印度寓言：盲人摸象 第第 三三 提高了我们对于乙型肝炎病毒提高了我们对于乙型肝炎病毒标准株或参考株的判断水平。标准株或参考株的判断水平。 早期克隆的病毒株早期克隆的病毒株早期克隆的病毒株早期克隆的病毒株为标准为标准为标准为标准序列？序列？序列？序列？ ConsensusConsensusConsensusConsensus序列为标准序列？序列为标准序列？序列为标准序列？序列为标准序列？ 第第 四四 有利于深入、正确认识拉米夫有利于深入、正确认识拉米夫定用药过程中定用药过程中YMDDYMDD变异等问题。变异等问题。 是药物选择的结果，不是诱导的结果。是药物选择的结果，不是诱导的结果。是药物选择的结果，不是诱导的结果。是药物选择的结果，不是诱导的结果。 拉米夫定对野生型拉米夫定对野生型HBV的抑制的抑制核苷类似物核苷类似物拉米夫定拉米夫定ss (-) DNA抑制抑制HBV 聚合酶聚合酶 (野生型野生型)高亲和力高亲和力MDYDY = 酪氨酸酪氨酸M = 蛋氨酸蛋氨酸D = 天门冬氨酸天门冬氨酸拉米夫定和拉米夫定和 YMDD 变异株变异株HBVY = 酪氨酸酪氨酸V = 缬氨酸缬氨酸D = 天门冬氨酸天门冬氨酸 I =异亮氨酸异亮氨酸核苷类似物核苷类似物拉米夫定拉米夫定ss （-） DNA弱抑制弱抑制HBV 聚合酶（变异株）聚合酶（变异株）亲和力下降亲和力下降VDYD在细胞培养体系中在细胞培养体系中YMDD变异株复制水平显著低于野生株变异株复制水平显著低于野生株 Melegari et al， Hepatology 1998; Allen et al, Hepatology 1998YMDD 变异株变异株 YVDD and YIDD与核苷类似物的结合能力显著下降与核苷类似物的结合能力显著下降 (Chayama et al，Hepatology1998; Back et al，EMBO J，1996) 第第 五五 正确认识将来的乙肝疫苗的免正确认识将来的乙肝疫苗的免疫预防效果。疫预防效果。 应该及早设计新型疫苗！应该及早设计新型疫苗！ 第第 六六 正确认识目前的诊断试剂的漏正确认识目前的诊断试剂的漏检率会不会逐渐提？检率会不会逐渐提？ 应该及早试验新型诊断试剂！应该及早试验新型诊断试剂！ 第第 七七 献血员的筛选方法是否继续有效，献血员的筛选方法是否继续有效，输血是否平安？输血是否平安？ 应该及早重视新的献血员筛选方法！应该及早重视新的献血员筛选方法！ 第第 八八 多少药物，什么样的药物才能多少药物，什么样的药物才能完全解决抗乙型肝炎病毒的治疗问完全解决抗乙型肝炎病毒的治疗问题？题？ 越来越多的抗生素也不能完全解决细菌感越来越多的抗生素也不能完全解决细菌感染问题？染问题？ 第第 九九 如何选择抗病毒药物？不同的乙如何选择抗病毒药物？不同的乙肝病毒准种群对不同的抗病毒药物敏肝病毒准种群对不同的抗病毒药物敏感性存在差异，为什么没有把乙肝病感性存在差异，为什么没有把乙肝病毒的准种特点这一因素，作为选择抗毒的准种特点这一因素，作为选择抗病毒药物选择的条件之一？病毒药物选择的条件之一？ 细菌体外药敏试验有什么提示？细菌体外药敏试验有什么提示？ 第第 十十 我们不能全部消灭细菌，我们我们不能全部消灭细菌，我们最终能全部消灭病毒吗？最终能全部消灭病毒吗？ 人与细菌的长期共存有什么提示？人与细菌的长期共存有什么提示？ 结结 论论 准种是乙型肝炎病毒存在的根本准种是乙型肝炎病毒存在的根本方式。如果不充分重视乙型肝炎病毒方式。如果不充分重视乙型肝炎病毒准种的研究，将来的某一天，目前的准种的研究，将来的某一天，目前的诊断方法不再有效、治疗的药物不再诊断方法不再有效、治疗的药物不再敏感、输血不再平安、疫苗的预防覆敏感、输血不再平安、疫苗的预防覆盖率显著下降，乙型肝炎病毒感染的盖率显著下降，乙型肝炎病毒感染的问题将持续存在。问题将持续存在。新北京地坛医院全貌图新北京地坛医院全貌图由近及远：行政办公楼、门诊医技楼、病房楼由近及远：行政办公楼、门诊医技楼、病房楼谢谢 谢！谢！