脊髓损伤脊髓损伤SPINAL CORD INJURY2021/6/161脊髓损伤脊髓损伤l脊髓原发性损伤(ASCI)l脊髓继发性损伤 (SSCI)2021/6/162原发性脊髓损伤原发性脊髓损伤l机械压迫，出血，细胞内外电解质改变l一般4 h 内l不可逆2021/6/163继发性脊髓损伤继发性脊髓损伤l包括水肿、局部缺血、炎症反应，再灌注、钙离子通道改变、脂质过氧化等l生物化学变化中，具自体损伤因素及神经保护因素，在分子细胞水平起主动调节过程l可逆性，可被控制l了解其分子机制，对采取治疗措施有重要意义2021/6/164脊髓损伤后病理改变脊髓损伤后病理改变l出血 l水肿 l神经坏死 l轴突碎裂 l脱髓鞘l空洞形成2021/6/165缺血缺血l乳酸水平明显升高l低灌注量程度与脊髓生理功能改变及诱发电位相关l组织氧含量明显减低2021/6/166局部缺血局部缺血l灰、白质血管反应不同，前者在伤后12h 内迅速出现缺血和梗死，白质血流 (SCBF) 与创伤程度有关l引起脊髓坏死或神经功能丧失重要原因l除与血管直接损伤有关外，还与血管活性物质释放引起血管痉挛、血栓形成、血栓素(TXA)有关2021/6/167局部缺血局部缺血l血管内皮损伤与SCBF 同等重要l再灌注后最初数分钟内，细胞死亡有一爆发过程，缺血后40 min, 神经元胞体和轴突有明显免疫组化及病理学损伤，再灌注 4 h，NF 反应阳性，NF 紊乱、稀疏、崩溃、溶解、轴突肿胀、扩大、消失 2021/6/168水肿水肿lSCI 后，血-脑（脊髓）屏障 (BSCB) 破坏，CNS 正常内皮的选择性渗透性受到影响，内皮的损坏将促进血管性水肿的形成，血管外间隙内聚集富含蛋白的血浆样液体l一定程度细胞毒性水肿，对神经组织引起压迫，维持异常电解质环境l白质水肿降低灌注，促进组织继发损伤2021/6/169水肿水肿l伤后立即，水肿局限于脊髓中央部分，逐渐呈离心性向白质扩散lSCI 严重程度与水肿纵向扩展有关，伤后68d 达高峰l水肿可表现为继发形式，血浆超滤液逐渐出现，呈持久血管性水肿l继发性内皮细胞连接的松弛发生毛细管 漏，或超过内皮增加的小泡样输送 2021/6/1610 分为两区 ： 第一区第一区：出血，组织不存活，微血管床逐渐丧失灌注的能力 第二区第二区 ：血管床仍保持畅通 治疗在于尽量不使第一区扩大，同时使第二区仍然存活的组织维持灌注 微循环障碍微循环障碍2021/6/1611微循环障碍微循环障碍正常脊髓血流量脊髓血流量 (SCBF) : 分布呈阶段性 腰膨大 颈膨大 胸腰段 上胸段 中胸段 上颈段 平均 SCBF 为 24.29 5.63 ml/100g/min 灰质与白质血流量比率约为 3.22 : 1 正常脊髓血压在6.7 17.3kPa下可自行调节2021/6/1612影响SCBF的因素l灌注压 ( perfusion pressure, PP )l平均动脉压 ( mean arterial pressure, MAP) lSCI 后，脊髓自动调节血压机制受到损害l脑脊髓压 (cerebrospinal pressure , CSFP ) SCBP 与 MAP呈线性相关 PP = MAP CSFP2021/6/1613巨噬细胞巨噬细胞lSCI 后首先是 PMN 浸润，伤后12 d 开始巨噬细胞浸润， 57 d 达到峰值， SCI 后存活的神经纤维继发脱髓鞘及轴突迟发功能丧失，与巨噬细胞应答时间一致l巨噬细胞具清除细胞碎片、恢复血流及SCI 内环境等保护作用, 但与吞噬细胞活性和刺激瘢痕形成等破坏作用很难分开2021/6/1614星形胶质细胞星形胶质细胞l通过调节细胞外电解质平衡和合成CNS 细胞外基质蛋白 （胶原蛋白、纤维粘连蛋白），以维持CNS的完整和内环境的稳定 l促进内皮细胞的紧密连接（血脊髓屏障组成部分）直接或间接保护神经细胞l通过控制调控因子和基质蛋白的合成对神经起破坏作用2021/6/1615脊髓损伤后电镜观察脊髓损伤后电镜观察l5 min : 皮质小静脉扩张，红细胞膨胀l1530 min : 血管周围间隙出血，轴突变化l1 h ：染色质溶解，前角细胞缺血l4 h ：中央区出血坏死，灰白质交界处进行性水肿l1 w ：中央区出现囊形变l4 w : 囊腔内有星形胶质细胞或残存脱髓鞘的轴突2021/6/1616脊髓损伤后细胞凋亡脊髓损伤后细胞凋亡l凋亡是以细胞或细胞核皱缩、染色质密度增加，膜芽出为特征，其过程需要精确的基因转录和一定量蛋白质合成，是一种主动性、不同于坏死的死亡形式lSCI 后，神经元及胶质细胞都产生凋亡，但就分布范围及持续时间来说，后者更具意义2021/6/1617脊髓损伤后凋亡脊髓损伤后凋亡l应用原位末端标记法 (TUNEL) 与免疫组化结合， l大鼠脊髓横断后，断端两侧白质脱髓鞘区 P53 和 Bax 表达增强，Bcl-2 仅少量表达 ；出现大量 TUNEL 标记阳性细胞；TEM 见少突胶质细胞典型凋亡改变，说明大鼠脊髓横断后白质内胶质细胞出现凋亡2021/6/1618细胞内外细胞内外K离子的变化离子的变化lK+ 从受伤的神经元释放，细胞外 K+ ，神经元丧失传导冲动的能力l细胞外 K + 浓度 20 mmol/L 可使动作电位传导终止l严重SCI后，白质细胞外 K+ 在6 min 内可由4 mmol/L 到 50 mmol/L, 甚至更高l此现象可持续达 2 h,直到细胞外 K+ 浓度降低到 15mmol/L 以下时，抑制方能逆转2021/6/1619细胞内外细胞内外Ca离子的变化离子的变化l细胞内Ca 2+ 后，可激活蛋白溶酶和脂质溶酶，引起细胞损伤和坏死 lSCI 后，细胞外 Ca2+ 内流超载，损伤周围组织 Ca 2+ 也流向损伤组织，使组织总 Ca 2+ 和细胞内 Ca 2+ 都过度增高，细胞内 Ca 2+ 超载称为细胞死亡最后公共通路2021/6/1620Ca2+内流的机制内流的机制l细胞膜缺损处的泄露，去极化，特异性Ca2+通道的开放lN-甲基D-天冬氨酸(NMDA)依赖性通道的活化l清除功能障碍 （Na+-Ca2+交换减少、Ca2+泵失能等）l细胞内储库释放Ca2+l脊髓组织坏死的磷脂膜局部自溶或许是SCI区域内细胞外液Ca2+过高的一种主动机制，以获得自身修复或保护的足够时间2021/6/1621Mg2+的变化的变化脊髓损伤后，局部组织 Mg2+ 含量下降，其程度与 SCI 损伤程度呈正相关。说明 Mg2+ 的降低参与了 SSCI早期补充 Mg2+ 可减轻因 Mg2+ 下降造成的 SSCIMg2+是一种非竟争性 NMDA 受体拮抗剂 ，可阻滞 NMDA 受体的离子通道，并调节 EAAs 的释放，从而拮抗由 EAAs 所致损伤 Mg2+ 对的保护作用有赖于对 Ca2+ 的拮抗作用 2021/6/1622Mg2+的变化的变化lSCI 后 24h 和 48 h，局部组织总 Ca2+ 含量显著增高，Ca2+ 大量细胞内流，导致细胞内 Ca2+ 浓度大大升高lMg2+ 通过与 Ca2+ 竞争细胞膜上的结合位点而抑制 Ca2+ 内流；通过 Mg2+ - Na+ 交换从而抑制 Ca2+-Na+ 交换，阻止Ca2+_内流l细胞外 Mg2+ 上可通过 Mg2+ - Ca2+ 交换促进 Ca2+ 外流2021/6/1623脂质过氧化脂质过氧化l内源性抗氧化剂减少，自由基 (FR) 生成增加l主要来自遭受损害或破裂的磷脂细胞膜，膜的通透性或完整性受到破坏，甚至引起细胞死亡lFR 抑制 PGI2，使TXA2 合成及血小板凝聚作用增强，微血管闭塞和痉挛，间接造成脊髓缺血2021/6/1624兴奋性氨基酸兴奋性氨基酸(EXCITORY AMINO ACIDS, EAAs)lEAAs 主要包括 谷氨酸及天门冬氨酸，是重要兴奋性神经递质，正常存在于神经末梢的囊泡中lEAAs通过其受体介导，启动一系列神经损伤，最终导致死亡细胞的病理生化反应，称为EAAs神经毒性2021/6/1625兴奋性氨基酸兴奋性氨基酸(EXCITORY AMINO ACIDS, EAAs)lEAAs 有三种具特性的受体 ：kainate, quisqualte 及 NMDARlNMDA 是一种兴奋性极强的 EAA，作用强度为 Asp 的1000倍lNMDAR 可使神经细胞Na+, Ca2+内流，K+外流，造成细胞内Na+, Ca2+浓度升高, K+ 浓度降低2021/6/1626兴奋性氨基酸兴奋性氨基酸(EXCITORY AMINO ACIDS, EAAs) EAAs 在 SSCI 的神经毒素表现 ： 1. 伤后数小时内因 EAAs 受体过度兴奋，介导神经细胞急性渗透性肿胀，以Na+内流和Cl-及水分被动内流为特征 2. 伤后数小时至数日内, 因NMDAR 过度兴奋引起的神经细胞延迟性损伤, 以Ca2+内流为特征2021/6/1627NMDARlNMDAR 主要分布于神经元细胞体和树突的突触后膜 lNMDAR 数量的减少可能起一种代偿性神经保护作用 lNMDAR 数量的减少并不是神经元原发损伤变性坏死的结果，而是在继发性损伤过程中起了作用2021/6/1628内源性阿片肽内源性阿片肽l类阿片受体主要有 、 及 三种，纳络酮对受体最具选择性，但大剂量对三种受体的配体均有活性l强腓肽强腓肽(dynorphin)即 类阿片受体的配体，在SCI最易被累及，SCI后，强腓肽的免疫反应有选择性地增加，与损伤严重程度相关2021/6/1629内源性阿片肽内源性阿片肽l纳络酮纳络酮可逆转颈段脊髓横切后引起的低血压，可改善SCBFl强腓肽强腓肽在内源性类阿片中是唯一在大鼠腰蛛网膜下腔注射后能产生后肢瘫痪者，部分系非类阿片剂作用2021/6/1630自由基自由基( FREE RADICAL, FR )lFR 是具异常反应的分子，继发于其外轨道不成对电子l氧FR链反应累及 LPO, 生物膜的磷脂及胆固醇成分被FR反应所破坏l正常还原的细胞代谢途径可产生 ：O2，OH-, H2O2l正常通过一些天然抗氧化物可管制FR产生的有害作用2021/6/1631自由基自由基( FREE RADICAL, FR )l病理性 FR 的产生及其有害作用可引起 SCI 后的缺血 lASCI 后，FR 可引起 LPO 并使细胞膜节裂，表现为过氧化多不饱和脂肪酸(PUSFA) 分解产物增多，胆固醇减少，伴胆固醇氧化产物。鸟苷酸环化酶的活化及相应 cGMP 增加；组织内抗氧化物如坏血酸及生育酚减少；磷脂依耐性膜结合Na+ K+ ATP 酶的抑制等2021/6/1632甘烷类甘烷类 ( EICOSANOIDS )lSCI 后，花生四烯酸从膜磷脂释出，很快游离，被环氧化酶代谢形成过氧化类及甘烷类，或经脂氧化酶代谢为羟脂肪酸和白三烯l甘烷类中两个具最强活性，能影响血液阻断及血管完整性的为 : 血栓素( thromboxane, TXA2 ) 前列环素 ( prostacyclin, PGI2 ) 2021/6/1633甘烷类甘烷类 ( EICOSANOIDS )lTXA2 刺激血小板聚集及血管收缩，细胞内 Ca2+ 增加，cAMP 降低lPGI2 作用相反，抑制血小板聚集和使血管扩张，细胞内 Ca2+ 外流，cAMP增加l猫 L2髓节从腹侧打击后 6h，TXB2 5倍， 6KetoPGF1 TXB2/6KetoPGF1 近三倍2021/6/1634甘烷类甘烷类 ( EICOSANOIDS )lTXA2 和 PGI2是一对重要前列腺素产物，具有非常强烈相互对立的血管活性l生理情况下，TXA2 和 PGI2的产生和分解保持相对平衡，以维持机体循环功能正常lTXA2/PGI2失衡后，一方面病理性FR增加，加重LPO；另一方面加重血管内皮损害，血管渗透性增加，发生微循环障碍l两者互为因果，形成恶性循环2021/6/1635花生四烯酸的代谢花生四烯酸的代谢l细胞破裂时，花生四烯酸丛磷脂结构释放，作为环氧化酶或脂氧化酶底物发挥作用，生成PG, PG-I, TXA2和白三烯lTXA2 和白三烯是强力血管收缩剂和中性粒细胞的趋化因子，在炎症前效应中有广泛作用l这些化合物与脂质过氧化生成密切相关2021/6/1636内皮素内皮素 （ ENDOTHELIN, ET )lET 是血管内皮细胞产生具强烈收缩血管作用的生物活性多肽， 正常血浆 ET 水平较低，缺血、缺氧条件下， ET 水平明显升高 lET 缩血管效应起效慢，持续时间长，微血管较大血管对ET 更敏感 lET 在 CNS 中起神经递质作用，可引起脑血管持久性收缩及蛛网膜下腔出血lET水平越高，脊髓损害程度越重 2021/6/1637内皮素（内皮素（ ENDOTHELIN, ET )ET 在ASCI 的作用机理 ： 1. 引起血管痉挛, 导致脊髓缺血缺氧 2. 作用于受体后, 细饱内游离 Ca2+ , 导 致脊髓缺血, 线粒体功能受损, EAAs , 中性蛋白酶活化, 加剧脊髓损伤 3. 破坏BSCB2021/6/1638血小板活化因子血小板活化因子( PLATELET ACTIVATING FACTOR, PAF )( PLATELET ACTIVATING FACTOR, PAF )l在创伤应激条件下，血小板、血管内皮细胞和神经细胞均能产生大量 PAF，与靶细胞膜上的 PAF 特异性受体结合后即产生生物效应 lPAF 可使 Na+、K+、Ca2+、Mg2+ 通道开放，细胞外 Na+、Ca2+ 内流，细胞内 K+ 外流 lPAF 加重脊髓损伤后水肿，抑制 Na+K+ATP酶及 Ca2+Mg2+ATP酶的活性，结果是 Na+、Ca2+浓度升高， K+ Mg2+浓度降低 2021/6/1639血小板活化因子血小板活化因子( PLATELET ACTIVATING FACTOR, PAF )( PLATELET ACTIVATING FACTOR, PAF )lPAF 是生物活性很强的多功能脂质炎性介质，也是SSCI的启动因子，能介导神经毒性水肿作用l组织损伤可刺激、介导中性粒细胞和血管内皮细胞间的粘附作用，与细胞间粘附分子 ICAM1，内皮细胞和白细胞粘附分子ELAM1及颗粒膜蛋白GMP140有关lPAF 可使血管内皮细胞ICAM1、RNA、ELAM1、mRNA表达2021/6/1640腺苷腺苷 (ADENOSINE )l腺苷是 CNS 内重要抑制性保护递质之一， SCI 后，腺苷含量立即升高，1 h 达高峰， 2 h 降为正常，腺苷含量与损伤程度成正比，大量兴奋性毒性物质释放，损伤细胞释放 K+以及缺血、缺氧均可刺激腺苷的合成与释放l腺苷是 CNS 内一种突触传递及神经元活动的抑制性调节因子，腺苷激活突触前膜 A1 受体，影响 Ca2+ 的内流，以抑制 Ca2+ 依赖的兴奋性递质的释放，腺苷还可激活 A2受体，使血管平滑肌松弛，防止血栓形成2021/6/1641SCI后生长因子后生长因子和细胞因子的变化和细胞因子的变化 lTNF-, IL-1, IL-6 : 在脂质过氧化生成过程中起重要作用，促进炎症反应，不利于修复l TGF- 2021/6/1642SCI后生长因子和细胞因子的变化后生长因子和细胞因子的变化 TGF- ：l多功能多肽性生长因子l对急、慢性炎症有重要对抗性调节作用l通过抑制质脂过氧化生成能防止缺氧性损伤l通过细胞表面受体调节基因表达，调节细胞外基质合成、细胞分化和增殖l通过刺激NGF生成及抑制细胞增殖，调节星形胶质细胞功能2021/6/1643NOlNO 对 SCI 同时起保护作用及破坏作用l在CNS内，主要由血管内皮细胞、神经细胞和神经胶质细胞中 NOS 催化精氨酸胍基末端氮原子与氧结合生成l NO 作为一种血管舒张剂， 可舒张血管，增加血流，同时也抑制中性白细胞、血小板和巨噬细胞贴附于血管内皮，避免血栓形成，有助于维持正常血管通透性 2021/6/1644NOlNO 将增强炎症细胞的粘附和从血管内渗出，白细胞渗入组织中的破坏作用，减少促炎症反应细胞因子（ TNF、 IL-1） 防止 LPO 的生成 lNO 与 TGF- 可相互作用，促进 TGF- 抗炎症反应l NO 是 CNS 中强有力的信息传递介质，不需细胞表面受体应答而奏效2021/6/1645继发性脊髓损伤继发性脊髓损伤的药物治疗的药物治疗2021/6/1646 大剂量甲基强的松龙大剂量甲基强的松龙 的应用的应用(METHYLPREDNISOLONE SODIUM SUCCINATE, MP) 2021/6/1647MPl抑制LPOl保存生物膜的结构和功能完整性l促进神经功能恢复2021/6/1648大剂量大剂量MPlNASCISI : 首次1000mg，以后 1000mg/d，连续 10d. 与100 相比,感觉与运动功能均无明显差异lNASCISII: 首次 30mg/kg,以后5.4mg/kg/h, 共 23h. 与大剂量纳络酮及安慰剂(5.4g/kg/h, 然后是 3.6mg/kg/h) 相比,结果显示,伤后8 h 内应用大剂量者, 其神经功能改善在统计学上有显著意义2021/6/1649大剂量大剂量MPlNASCIS II: 伤后3 8 h内首次 30mg/kg, 分为 24h 及 48h 组,后者在伤后6周、6月和 1年时运动功能显著改善。在 3h 以内接受治疗时，应维持 24h；在伤后 38h 治疗者，应维持 48h2021/6/1650大剂量大剂量MPl需要静脉大剂量给药l早期治疗 （8 h 以内）l神经保护时间曲线与组织药代学平行l神经保护作用独立于糖皮质激素活性 2021/6/1651NMDAR拮抗剂拮抗剂lCPP 3- ( 2-carboxypiparazin-4-yl) propyl-1-phosphonic acid 鞘内注射能有效地减轻神经功能和组织的损害，拮抗Na+,Ca2+通过受体门控通道的内流, 而减轻神经细胞的损伤 lDizocilpine maleate (MK801) : 强有力非竟争性NMDAR拮抗剂，在局灶型脑缺血可使组织损伤减少3090% MK801可改善脊髓损伤或缺血病变2021/6/1652阿片肽受体拮抗剂阿片肽受体拮抗剂l在大鼠后鞘内注射相对无选择性受体拮抗剂 win44, 4413, nalmefene及高选择性受体拮抗剂 norbinaltorplimine ( norbin )，较纳络酮能更好保护肢体运动功能, 而阿片受体拮抗剂ICI154，,129无此作用l特异性拮抗剂norbin 和AndynA113分别从阿片肽受体水平和阿片肽配体水平阻断dynA的作用，药理剂量足以拮抗或中和脊髓全部受体和dynA，4周后显示AndynA113对脊髓的保护作用强于norbin，残留脊髓面积最大 2021/6/1653钙通道阻滞剂钙通道阻滞剂l尼莫地平尼莫地平( nimodipine ) 对脑血管有选择性扩张作用，大剂量因引起的血压而无效。加用肾上腺素以维持一定平均全身动脉压（MSAP）非常重要lSCI后，低血压将加重缺血，单纯应用升压药不能恢复SCBFl尼莫地平虽能改善SCBF，能否促进神经功能仍不明确，但对 Ca2+诱导细胞死亡具有保护作用2021/6/1654自由基清除剂自由基清除剂l皮质类固醇能抑制AA的释放，降低LPO的形成，增强Na+K+ATP酶的活性lMP, 环氧化酶抑制剂如消炎痛，甲氯灭酸的结合碱（ meclofenamate），SOD， 维生素C，维生素 E 及尼莫地平可在不同环节打断 FR 反应 lTirilazad 为强有力自由基清除剂及抗氧化剂，特别是 LPO 强有力的抑制剂， Tirilazad 也能降低损伤部位释放的 AA 量 2021/6/1655NO抑制剂抑制剂l小剂量非特异性NOS 竞争性抑制剂 L NAME ( L NG硝基精氨酸甲酯）可减轻组织损害，但大剂量可使组织破坏加重，神经功能不能恢复，说明 NO在参与SSCI 中， 既具保护作用，又具破坏作用lLNAME 对神经细胞和血管内皮细胞具抑制作用，并呈剂量依赖性2021/6/1656血小板活化因子拮抗剂血小板活化因子拮抗剂lPAF受体拮抗剂BN52021是一种二萜化合物，能抑制3HPAF与血小板、血管内皮细胞、神经细胞特异性结合，有很强竞争专一性lBN52021能减轻脊髓组织水肿，防止血管内皮细胞损害以及因血管通透性增高所致BBB障碍 lBN52021对SCBF有重要调节作用，通过阻断PAF受体，间接抑制PLA2及TXA2合成酶的活性，减少AA代谢产物释放lBN52021抑制Ca2+内流、LPO反应及EAAs的产生和释放2021/6/1657神经节苷脂神经节苷脂 ( GANGLIOSIDE, Gg ) lGg 是组织细胞膜上含糖鞘脂的唾液酸， CNS 含量最高lGg 至少有四种，即GM1、 GD1a、 GD1b 和 GT1b，其中 GM1 最为重要，被认为是继大剂量 MP 后治疗 ASCI 有价值的药物lGM1 能激活 Na+K+ATP 酶，防止神经组织因缺血造成的细胞水肿及神经细胞在缺氧状态下的存活率，并能促进神经细胞轴突、树突发芽和再生 lGM1能抑制NOS 的活性，降低NO的合成及因此造成的神经损害2021/6/1658神经节苷脂神经节苷脂 ( GANGLIOSIDE, Gg )lGeisler (1991) : SCI 后，先采用 MP，伤后 72 h 内，静脉注射 GM1 100 mg/d，共1832次，1年随访 ASIA 运动评分较对照组提高，但受到质疑lGeisler （1992）再次进行总结， GM1组应用 Frankel 评分平均提高23级，主要能促进白质神经纤维通过损伤平面l临床观察应用小剂量MP和 GM1比单用 MP好lMP与GM1最佳配伍剂量、给药时间及是否可与 NGF联合应用尚需进一步研究2021/6/1659脊髓损伤实验性治疗脊髓损伤实验性治疗EXPERIMENTAL TREATMENTOFSPINAL CORD INJURY2021/6/1660神经元再生神经元再生 l出芽出芽l延长延长l功能性连接功能性连接2021/6/1661影响脊髓再生的因素影响脊髓再生的因素l环境因素环境因素 (ENVIRONMENTAL FACTORS)l内在因素内在因素 (INTRINSIC FACTORS)2021/6/1662影响脊髓再生的环境因素影响脊髓再生的环境因素l缺乏缺乏NTFs的营养、促进作用的营养、促进作用l缺乏适宜引导通路基质缺乏适宜引导通路基质l胶质瘢痕阻碍生长胶质瘢痕阻碍生长l存在髓鞘相关抑制因子存在髓鞘相关抑制因子2021/6/1663影响脊髓再生的内在因素影响脊髓再生的内在因素l生长相关蛋白生长相关蛋白 (GAP 43)l降钙素基因相关肽降钙素基因相关肽 (CGRP)l原癌基因原癌基因 (Bcl 2)lNMDA 受体受体2021/6/1664 脊髓损伤实验性治疗脊髓损伤实验性治疗l继发性脊髓损伤治疗继发性脊髓损伤治疗l神经营养因子神经营养因子l神经组织或细胞移植神经组织或细胞移植l基因治疗基因治疗2021/6/1665神经营养因子神经营养因子NEUROTROPHIC FACTORS（NTFs)l神经营养因子神经营养因子 ：l 神经生长因子神经生长因子 (NGF)l 脑源性神经营养因子脑源性神经营养因子 (BDNF)l 神经营养素神经营养素3 (NT3)l 神经营养素神经营养素4/5 ( NT4/5)l睫状体神经营养因子（睫状体神经营养因子（CNTF)2021/6/1666NTFsl低亲和力受体低亲和力受体 (LNGFR)l高亲和力受体高亲和力受体 (HNGFR)2021/6/1667NTFsl与神经膜、轴膜上受体高选择性结合与神经膜、轴膜上受体高选择性结合l调控神经细胞内相关细胞因子及钙离子调控神经细胞内相关细胞因子及钙离子重新分布重新分布l改善损伤部位的微循环改善损伤部位的微循环l促进神经元纤维再生促进神经元纤维再生2021/6/1668神经组织或细胞移植神经组织或细胞移植l周围神经移植周围神经移植l胚胎脊髓移植胚胎脊髓移植l雪旺细胞移植雪旺细胞移植l混合移植混合移植l其它其它2021/6/1669胚胎脊髓移植胚胎脊髓移植l胚胎脊髓块移植胚胎脊髓块移植 (FSC)l胚胎脊髓悬液移植胚胎脊髓悬液移植 (FSCS)2021/6/1670胚胎脊髓移植胚胎脊髓移植l抑制胶质瘢痕抑制胶质瘢痕l营养神经组织营养神经组织l诱导作用诱导作用l传导作用传导作用l中继作用中继作用l救援作用救援作用l替代作用替代作用 2021/6/1671雪旺细胞（雪旺细胞（SCs）移植）移植 l产生的产生的NTFs对神经元的存活有协同对神经元的存活有协同作用作用l表面细胞粘附分子（表面细胞粘附分子（CAM) 与轴突与轴突生长锥表面相应分子亲和性结合生长锥表面相应分子亲和性结合l分泌细胞外基质（分泌细胞外基质（ECM)，如层粘蛋，如层粘蛋白白(LN)、纤维连接蛋白、纤维连接蛋白(FN)等等 2021/6/1672基因治疗基因治疗(GENE THERAPY) 利用外源基因在靶细胞中的利用外源基因在靶细胞中的表达，改变神经元内在特性，促表达，改变神经元内在特性，促进神经元存活、再生，达到功能进神经元存活、再生，达到功能恢复恢复 2021/6/1673基因转移基因转移（GENE TRANSFER)l活体外法活体外法(EXVIVO APPROACH)：将：将经过遗传修饰的特定细胞移植到活经过遗传修饰的特定细胞移植到活体神经组织，表达或分泌特定分子，体神经组织，表达或分泌特定分子，促使神经功能恢复促使神经功能恢复l在体法（在体法（INVIVO APPROACH) ：利用病毒或非病毒载体将外源基因利用病毒或非病毒载体将外源基因直接导入神经组织而使其表达直接导入神经组织而使其表达2021/6/1674基因转移基因转移（GENE TRANSFER)l重组分子的构建重组分子的构建l受体细胞的选择受体细胞的选择l载体的选择载体的选择2021/6/1675重组分子的构建重组分子的构建l目的基因目的基因cDNAl启动子启动子/增强子增强子l载体载体2021/6/1676目的基因目的基因l通过基因克隆化、人工合成、通过基因克隆化、人工合成、PCR 扩增及人体基因组降解而扩增及人体基因组降解而获得获得l通过粘性末端连接法、平头末端通过粘性末端连接法、平头末端直接连接法或同聚物结尾法进行直接连接法或同聚物结尾法进行构建构建2021/6/1677启动子启动子/增强子增强子l强组成型强组成型 （STRONG CONSTITUTIVE）l管家型（管家型（HOUSE KEEPING）l组织特异型组织特异型 （TISSUE SPECIFIC）2021/6/1678受体细胞选择的条件受体细胞选择的条件l易于获取或培养增殖易于获取或培养增殖l易于接纳重组分子易于接纳重组分子l易于移植、存活，长期表达外源易于移植、存活，长期表达外源基因基因l无免疫原性及形成肿瘤危险无免疫原性及形成肿瘤危险2021/6/1679较常用受体细胞较常用受体细胞l雪旺细胞雪旺细胞l成纤维细胞成纤维细胞l成肌细胞成肌细胞l胚胎干细胞胚胎干细胞l神经干细胞神经干细胞l嗅鞘细胞嗅鞘细胞2021/6/1680胚胎干细胞胚胎干细胞（EMBRYONIC STEM CELLS, EMC)l多能干细胞多能干细胞l通过体细胞核转移而获得通过体细胞核转移而获得l一定条件下可分化为神经元或支一定条件下可分化为神经元或支持细胞持细胞l分泌生物活性物质，促进脊髓组分泌生物活性物质，促进脊髓组织再生织再生2021/6/1681神经干细胞神经干细胞（NEURAL STEM CELLS, NSC)l产生神经元或胶质细胞的前体细产生神经元或胶质细胞的前体细胞胞l由胚胎或成年哺乳动物由胚胎或成年哺乳动物 CNS 组组织分离获得织分离获得l易于遗传调控易于遗传调控l组装表达外源基因组装表达外源基因2021/6/1682神经干细胞神经干细胞（NEURAL STEM CELLS, NSCs)l自我复制更新，维持稳定细胞储备自我复制更新，维持稳定细胞储备l处于较原始未分化状态处于较原始未分化状态l具多向分化的潜能具多向分化的潜能l在胞浆内表达巢素（在胞浆内表达巢素（nestin) 的特异的特异性蛋白性蛋白2021/6/1683嗅鞘细胞嗅鞘细胞（OLFACTORY ENSHEATHING CELLS, OECs) lOECs和嗅神经轴索来源于嗅基板，属外周起和嗅神经轴索来源于嗅基板，属外周起源源lOECs分布在嗅上皮、嗅神经和嗅球分布在嗅上皮、嗅神经和嗅球(OB) 第第1、2层层l嗅神经元终生具再生能力，嗅神经元终生具再生能力，OB 除星形胶质细除星形胶质细胞外，还有胞外，还有 OECsl嗅觉传导纤维兼有嗅觉传导纤维兼有 SCs 和星形胶质细胞特点，和星形胶质细胞特点，其特殊胶质细胞是嗅神经再生基础其特殊胶质细胞是嗅神经再生基础 2021/6/1684OECs的取材的取材l1416d 胚胎鼠的嗅神经胚胎鼠的嗅神经l新生动物的嗅上皮和嗅球新生动物的嗅上皮和嗅球l新生或成年动物的逆转录病毒新生或成年动物的逆转录病毒 感染的感染的OECs传代，或自然增殖传代，或自然增殖的成熟的成熟OECs培养产生子代细胞培养产生子代细胞2021/6/1685OECs对对SCI的治疗作用的治疗作用l分泌神经营养因子和粘附分子，分泌神经营养因子和粘附分子，使成年动物保持轴突再生髓鞘或使成年动物保持轴突再生髓鞘或迁徙能力迁徙能力l促进轴突生长促进轴突生长l自体移植有可能成功自体移植有可能成功2021/6/1686载体选择的条件载体选择的条件l有自身复制子有自身复制子l有限制性内切酶的酶切位点有限制性内切酶的酶切位点l有可供选择的遗传标志有可供选择的遗传标志l可容纳较大的外源基因可容纳较大的外源基因l靶向性，可调控导入基因表达靶向性，可调控导入基因表达l转移方法简便易行转移方法简便易行2021/6/1687载体载体l病毒载体病毒载体 腺病毒腺病毒 腺病毒相关病毒腺病毒相关病毒 复制缺陷性单纯疱疹病毒复制缺陷性单纯疱疹病毒 逆转录病毒逆转录病毒l脂质体脂质体2021/6/1688载体载体l常用乳腺病毒、莫罗尼小鼠白血病病毒常用乳腺病毒、莫罗尼小鼠白血病病毒等等l病毒的长末端重复序列（病毒的长末端重复序列（LTR) 对插入的对插入的外源基因可有效进行转录外源基因可有效进行转录l先在体外构建返转录病毒前病毒先在体外构建返转录病毒前病毒 DNA 载载体，产生缺陷型返转录病毒，使外源基体，产生缺陷型返转录病毒，使外源基因带入宿主细胞得以表达因带入宿主细胞得以表达l靶细胞需具增殖或分裂特性靶细胞需具增殖或分裂特性2021/6/1689基因治疗问题与展望基因治疗问题与展望l细胞迁移导向机制细胞迁移导向机制l功能性突触连接功能性突触连接l胶质细胞调节微环境和神经递质功胶质细胞调节微环境和神经递质功能能l神经因子长期供应神经因子长期供应l与靶区建立联系与靶区建立联系l控制免疫反应控制免疫反应2021/6/1690基因治疗问题与展望基因治疗问题与展望l了解了解 NTFs在在 SCI再生修复的整合机制，再生修复的整合机制，同时转入多种同时转入多种 NTFs，使其相互作用调节，使其相互作用调节l了解了解 SCs整合分化机制，结合整合分化机制，结合 NTFs转基转基因技术，长期发挥生物学和性因技术，长期发挥生物学和性l掌握干细胞扩增技术，培育与受体掌握干细胞扩增技术，培育与受体 MHC匹配的特异性供体细胞系，提供广泛来匹配的特异性供体细胞系，提供广泛来源，避免免疫排斥反应源，避免免疫排斥反应2021/6/1691 结束语结束语若有不当之处，请指正，谢谢！若有不当之处，请指正，谢谢！