温故知新温故知新1:1:组成组成DNADNA分子的分子的基本单位基本单位是什么是什么? ?这些基本单位是如何连接成这些基本单位是如何连接成DNADNA分子的分子的? ?DNADNA分子结构有什么特点？分子结构有什么特点？2脱氧脱氧核糖核糖含氮碱基含氮碱基磷酸磷酸A G C T1 1、DNADNA的基本单位的基本单位脱氧核苷酸脱氧核苷酸一、一、DNADNA分子的结构分子的结构12345OCGA3123454碱基OHOOPOHOOHOOPOHO碱基OHOH152435OOPOHO碱基碱基OOHOOPOHOOH碱基碱基碱基碱基脱氧核糖脱氧核糖磷酸基团磷酸基团碱基碱基脱氧核糖脱氧核糖碱基碱基脱氧核糖脱氧核糖53脱氧核苷酸链结构简图脱氧核苷酸链结构简图磷酸二酯键磷酸二酯键655337DNADNA分子的复制过程是怎样的？分子的复制过程是怎样的？DNADNA分子的复制需要哪些条件？分子的复制需要哪些条件？温故知新温故知新2 282 2、时间：、时间：细胞分裂细胞分裂间期间期（有丝（有丝分裂间期分裂间期，减数，减数第一次分裂的间期）第一次分裂的间期）1 1、概念：、概念：以亲代以亲代DNA为模板，根据碱基互补配为模板，根据碱基互补配对合成子代在对合成子代在DNA的过程。的过程。3 3、场所：、场所：主要是细胞核主要是细胞核 （其次是线粒体、叶绿体）（其次是线粒体、叶绿体）二细胞内二细胞内DNADNA复制的过程复制的过程94 4、 条件：条件： 模板：模板： 亲代亲代DNADNA的两条母链的两条母链 原料：原料： 游离的四种脱氧核苷酸游离的四种脱氧核苷酸 能量：能量： ATPATP 酶：酶： 解旋酶解旋酶 、DNADNA聚合酶聚合酶 引物：一小段引物：一小段RNARNA，能与，能与DNADNA母链的一段碱基序列互补配母链的一段碱基序列互补配对对5 5、过程、过程（1）解旋：解旋酶）解旋：解旋酶 、ATP（2）以）以DNA的两条母链为模板，根据碱基互补配对的两条母链为模板，根据碱基互补配对规则，合成子链。规则，合成子链。（3）子链、母链螺旋构成子代）子链、母链螺旋构成子代DNA106 6、复制特点复制特点半保留复制，边解旋边复制，多起点复制。半保留复制，边解旋边复制，多起点复制。7、DNA复制的方向DNA的合成方向总是从子链的的合成方向总是从子链的5端向端向3端延伸端延伸11121、 PCRPCR（多聚酶链式反应）技术：（多聚酶链式反应）技术：是一种是一种体体外外迅速扩增迅速扩增DNADNA片段的技术，它能以极少量的片段的技术，它能以极少量的DNADNA为模板，在几小时内复制出上百万份的为模板，在几小时内复制出上百万份的DNADNA拷贝。拷贝。2 2、原理：、原理：利用了利用了DNADNA的热变性的热变性原理，通过控制温原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合。度来控制双链的解聚与结合。一、基础知识一、基础知识（一）（一）PCRPCR原理：原理：13体内体内DNA复制与复制与PCR的技术区别：的技术区别：体内复制体内复制PCRPCR技术技术解旋解旋在解旋酶作用下，细胞提在解旋酶作用下，细胞提供供ATPATP，部分解开，部分解开加热到加热到9494o oC,C,双链全部解双链全部解开，不需解旋酶开，不需解旋酶引物引物一小段一小段RNARNA一般用一般用DNADNA片段片段DNADNA聚合酶聚合酶细胞自身的细胞自身的DNADNA聚合酶（不聚合酶（不耐高温）耐高温）TaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶复制特点复制特点半保留复制，边解旋边复半保留复制，边解旋边复制，多起点复制。制，多起点复制。半保留复制，完全解旋半保留复制，完全解旋后复制，从模板链的一后复制，从模板链的一端开始复制。端开始复制。复制的方向复制的方向子链的子链的5 5端向端向 3 3端延伸端延伸 子链的子链的5 5端向端向 3 3端延端延伸伸14DNADNA母链：母链：提供复制的模板提供复制的模板解旋酶：解旋酶： 打开打开DNADNA双链双链4 4种脱氧核苷酸：种脱氧核苷酸：合成子链的原料合成子链的原料DNADNA聚合酶：聚合酶： 催化合成催化合成DNADNA子链子链ATPATP：为复制过程提供能量为复制过程提供能量引物：引物：使使DNADNA聚合酶从引物的聚合酶从引物的3 3端开始连端开始连 接脱氧核苷酸接脱氧核苷酸( (一小段一小段RNARNA) )3 3、PCRPCR反应的条件反应的条件8080100100：耐热的耐热的DNADNA聚合酶：聚合酶：缓冲溶液：缓冲溶液：维持反应的维持反应的pHpH值不变值不变( (一般是一小段单链一般是一小段单链DNA)DNA)15( (二二)PCR)PCR反应的过程反应的过程1 1、变性：、变性： 温度上升到温度上升到9090以上以上时时, ,双链双链DNADNA解解聚聚成为单链。成为单链。2 2、复性（退火）：、复性（退火）： 温度下降到温度下降到5050左右左右, ,引物与引物与模板模板DNADNA单链单链的互补序列配对的互补序列配对结合结合。3 3、延伸：、延伸： 温度上升到温度上升到7272左右左右, ,溶液中的溶液中的4 4种种脱氧核苷酸在脱氧核苷酸在Taq Taq DNADNA聚合酶聚合酶的作用下的作用下, ,根据根据碱基互补配对的原则碱基互补配对的原则合成新的合成新的DNADNA链链。16PCR PCR 循环第一步循环第一步 ：加热变性加热变性: :双链双链DNADNA解聚成为单链解聚成为单链17模板序列模板序列模板序列模板序列模板序列模板序列模板序列模板序列引物引物引物引物 引物引物引物引物 5 5 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 5 5 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 3 3 3 3 PCR PCR 循环第二步循环第二步 ：引物与模板序列：引物与模板序列复性（退火）复性（退火）: :引物与模板引物与模板DNADNA单链单链的互补序列配对结合的互补序列配对结合18模板序列模板序列模板序列模板序列引物引物引物引物5 53 35 55 53 35 53 33 3Taq DNATaq DNA聚合酶聚合酶PCR PCR 循环第三步循环第三步 ：引物延伸引物延伸: :合成新的合成新的DNADNA链链19模板序列模板序列模板序列模板序列模板序列模板序列模板序列模板序列第第1 1个个 PCR PCR 循环完成后循环完成后 ：得到：得到两个两个拷贝的序列拷贝的序列20循环循环次数次数DNADNA数量数量1 12 22 24 43 38 820201,048,5761,048,57630301,073,741,8241,073,741,8243030次循环后扩增的数量次循环后扩增的数量214 4、PCR PCR 循环的结果循环的结果 DNADNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的之间的DNADNA序列序列，使这段固定长度的序列，使这段固定长度的序列呈指呈指数扩增数扩增。从第二轮循环开始，从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作上一次循环的产物也作为模板参与反应为模板参与反应，并且由，并且由引物引物延伸而成的延伸而成的DNADNA单链会与引物单链会与引物结合结合，进行，进行DNADNA的延伸。的延伸。22第一轮结果第一轮结果12341234第二轮结果第二轮结果23二、二、 实验操作实验操作1 1、PCRPCR仪仪（一）设备及用具（一）设备及用具实质上一台能够实质上一台能够自动调控温度自动调控温度的仪器。的仪器。2 2、微量离心管、微量离心管一种一种薄壁塑料管薄壁塑料管，总容积为，总容积为0.5ml0.5ml。3 3、微量移液器、微量移液器用于用于定量转移定量转移PCRPCR配方中的配方中的液体，液体，其上的其上的一一次性吸液枪头用一次更换一次。次性吸液枪头用一次更换一次。24PCRPCR仪仪25微量离心管微量离心管微量移液器微量移液器261 1、准备、准备2 2、移液、移液（二）实验操作步骤（二）实验操作步骤按照按照PCRPCR反应体系的配方将所需用的试剂摆反应体系的配方将所需用的试剂摆放在实验桌上放在实验桌上用微量移液器按照用微量移液器按照PCRPCR反应体系配方往微量离反应体系配方往微量离心管里面加入各种试剂心管里面加入各种试剂27过程：盖严微量离心管口的盖子，用手指轻过程：盖严微量离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁。轻弹击管壁。注意：注意：3 3、混合、混合B B、手指轻轻弹击微量离心管的管壁，、手指轻轻弹击微量离心管的管壁，目的是使目的是使反应液混合均匀。反应液混合均匀。A A、离心管口的盖子一定盖严，、离心管口的盖子一定盖严，防止实验中脱防止实验中脱落或液体外溢。落或液体外溢。28将离心管放入将离心管放入PCRPCR仪上，设置好仪上，设置好PCRPCR仪的循环仪的循环程序。程序。过程：将微量离心管放在离心机上过程：将微量离心管放在离心机上, ,离心约离心约10s10s。4 4、离心、离心5 5、反应、反应离心目的：使反应液体集中在离心管底部，离心目的：使反应液体集中在离心管底部，提高反应效果。提高反应效果。29循环数循环数变性变性复性复性延伸延伸预变性预变性9494，5min5min3030次次9494，30s30s5555，30s30s7272，1min1min最后一次最后一次 9494，1min1min5555，30s30s7272，1min1min30PCRPCR技术技术高度灵敏，高度灵敏，为了避免为了避免外源外源DNADNA等因素等因素的污染的污染而造成干扰实验，而造成干扰实验，PCRPCR操作时要注意做到：操作时要注意做到：6 6、注意事项、注意事项隔离操作区隔离操作区，所用微量离心管、枪头、缓冲液以，所用微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用必须进行及蒸馏水等在使用必须进行高压灭菌高压灭菌；分装试剂，简化操作程序，使用分装试剂，简化操作程序，使用一次性枪头一次性枪头, ,一一次性吸液枪头次性吸液枪头用一次更换一次用一次更换一次。 31（一）理论上（一）理论上DNADNA扩增数目的计算扩增数目的计算三、课题成果评价三、课题成果评价1 1 、一条、一条DNADNA，复制，复制n n次，次， DNADNA为：为：2 2n n2 2 、 a a条条DNADNA，复制，复制n n次，次， DNADNA为：为：a2a2n n（二）实验中（二）实验中DNADNA含量的测定含量的测定1 1 、原理、原理可以通过计算可以通过计算DNADNA含量来评价扩增的效果，含量来评价扩增的效果，DNADNA在在260nm260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的峰值的大小与大小与DNADNA的含量有关的含量有关。322 2 、过程、过程稀释稀释2uL2uLPCRPCR反应液，加入反应液，加入98uL98uL蒸馏水，即将样品进蒸馏水，即将样品进行行5050倍稀释倍稀释。对照调零对照调零以蒸馏水作为以蒸馏水作为空白对照空白对照，在波长，在波长260nm260nm处，将紫处，将紫外分光光度计的外分光光度计的读数调节至零读数调节至零。取取DNADNA稀释液稀释液100uL100uL至比色杯中，测定至比色杯中，测定260nm260nm处的处的光吸收值光吸收值。计算计算33计算计算DNADNA含量（含量（ g g ） 50 x 50 x（260nm260nm的读数）的读数）x x稀释倍数稀释倍数公式中公式中5050的含义的含义：5050 g g /ml /ml的的DNADNA在标准厚度为在标准厚度为1cm1cm比色杯中的吸光值为比色杯中的吸光值为1 1。34比色杯比色杯35（三）（三）DNADNA片段扩增失败的原因片段扩增失败的原因可能的原因有：可能的原因有：漏加了漏加了PCRPCR的反应成分，各反应成的反应成分，各反应成分的用量不当，分的用量不当，PCRPCR程序设置不当等。程序设置不当等。36四、四、 课题延伸课题延伸例如：例如：PCRPCR产物每轮循环增加一倍，产物每轮循环增加一倍，3030轮循环轮循环扩增量达扩增量达2 23030个拷贝。个拷贝。PCRPCR技术是技术是8080年代中期发展起来的体外核酸扩年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。增技术。 它具有它具有特异性强、敏感性高、产率特异性强、敏感性高、产率高、高、 快速、快速、 简便、重复性好、易自动化简便、重复性好、易自动化等突等突出特点。出特点。37五、实验小结五、实验小结 PCRPCR仪仪加加热热使使（ ）变变性性, , 复复性性使使引引物物与与模模板板DNADNA（ ） , ,延延 伸伸 需需 将将 反反 应应 温温 度度 升升 至至 中中 温温 ( ( ),),在在 （ ）的的作作用用下下, ,以以 （ ）为为原原料料, ,以以（ ）为为复复制制的的起起点点, ,合合成成新新链链。 如如此此重重复复改改变变反反应应温温度度, ,经经（ ）三三个个阶阶段段为为一一个个循循环环, ,每每一一次次循循环环使使特特异异区区段段的的基基因因拷拷贝贝数数放放大大一一倍倍, ,一一般般样样品品是是经经过过3030次次循循环环, ,最最终终使使基基因因放放大大了了数数百百万万倍倍; ; 将将扩扩增增产产物物进进行行电电泳泳, ,经经溴溴化化乙乙锭锭染染色色, ,在在紫紫外外灯灯照照射射下下肉肉眼眼能能见见到到扩扩增增特异区段的特异区段的DNADNA带。带。模板模板互补互补TaqTaq聚合酶聚合酶四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸引物引物变性、复性和延伸变性、复性和延伸727238课堂小结课堂小结多多聚聚酶酶链链式式反反应应扩扩增增DNA片片段段PCR原理原理DNA的复制需要酶、原料、能量、引物的复制需要酶、原料、能量、引物DNA的变性和复性受温度影响的变性和复性受温度影响PCR过程过程变性变性复性复性延伸延伸操作步骤操作步骤配制配制PCR反应体系反应体系移入离心管移入离心管放入放入PCR仪仪仪仪设置工作参数设置工作参数DNA扩增扩增测定含量测定含量稀释稀释调零调零测定并读数测定并读数计算计算39练习巩固练习巩固1、关于、关于PCR技术的应用，错误的一项是技术的应用，错误的一项是A 古生物学、刑侦破案、古生物学、刑侦破案、DNA序列测定序列测定B 诊断遗传疾病、基因克隆、古生物学诊断遗传疾病、基因克隆、古生物学C DNA序列测定、基因克隆、刑侦破案序列测定、基因克隆、刑侦破案D 诊断遗传疾病、合成核苷酸、诊断遗传疾病、合成核苷酸、DNA序列测定序列测定402、DNA的合成方向总是从子链的哪一端向哪的合成方向总是从子链的哪一端向哪一端延伸？一端延伸？3、PCR技术最突出的优点是技术最突出的优点是A 原理简单原理简单 B 原料易找原料易找C TaqDNA聚合酶有耐热性聚合酶有耐热性D 快速、高效、灵活、易于操作快速、高效、灵活、易于操作从子链的从子链的5端向端向3端延伸端延伸414、做、做PCR使用的微量离心管、枪头、缓冲液及蒸馏使用的微量离心管、枪头、缓冲液及蒸馏水使用前必须进行的关键步骤是水使用前必须进行的关键步骤是A 反复洗涤反复洗涤 B 不怕外源不怕外源DNA污染污染C 高压灭菌高压灭菌 D 在在20 储存储存42