荧光免疫层析技术的原理与进展介绍人：罗敏 荧光免疫层析技术的基本原理层析法(chromatography)的原理是利用混合物中各组分的物理性质之差(如吸附力、分子形状和大小、分子极性、分子亲和力、分配系数等)而建立来的一种分离技术。层析系统是由固定相(stationary phase)和流动(Mobile Phase)相组成。固定相是固体物质或固定于固体物质上的成分。流动相是可以流动的物质，如水或各种溶剂。层析过程：当待分离混合物随流动相通过固定相时，由于混合物各组分的理化性质的差异，与固定相相互作用弱的组分随流动相移动时受到的阻滞作用小，向前移的速度快；与固定相相互作用强的组分向前移动的速度慢。从而实现混合物中各组分的分离。 免疫层析法免疫层析技术是建立在层析技术和抗原一抗体特异性免疫反应基础上的一项新兴免疫检测技术。免疫层析技术以固定有检测线和控制线的条状纤维层析材料为固定相，测试液为流动相，通过毛细作用使待测物在层析条上移动。待测物在T线处发生特异性免疫反应。游离物在C线处发生免疫反应。待测物层析方向免疫反应TC免疫层析技术基本原理示意图荧光荧光（fluorescencefluorescence） 荧光物质吸收激发光的能量后，电子从基态跃荧光物质吸收激发光的能量后，电子从基态跃迁到激发态，当其回复至基态时，以发射光形式迁到激发态，当其回复至基态时，以发射光形式释放出能量，称为荧光。释放出能量，称为荧光。 发射光谱和激发光谱发射光谱和激发光谱发射光谱是指固定激发波长，在不同波长下发射光谱是指固定激发波长，在不同波长下记录的样品发射荧光的强度。记录的样品发射荧光的强度。激发光谱是指固定检测发射波长，用不同波激发光谱是指固定检测发射波长，用不同波长的激发光激发样品记录的相应的荧光发射长的激发光激发样品记录的相应的荧光发射强度。强度。荧光效率荧光效率定义定义: :荧光物质分子将光能转变成荧光的百分率荧光物质分子将光能转变成荧光的百分率计算公式计算公式: : 荧光效率荧光效率= = 荧光寿命荧光寿命定义定义: :荧光物质被激发后所产生的荧光衰减到一定程荧光物质被激发后所产生的荧光衰减到一定程度时所用的时间。度时所用的时间。各种荧光物质的荧光寿命不同。各种荧光物质的荧光寿命不同。 荧光淬灭荧光淬灭定义定义: :荧光物质在某些理化因素作用下，发荧光物质在某些理化因素作用下，发射荧光减弱甚至消退称为荧光淬灭。射荧光减弱甚至消退称为荧光淬灭。引起荧光淬灭的因素：有如紫外线照射、引起荧光淬灭的因素：有如紫外线照射、高温高温、某些硝基化合物、重氮化合物等。某些硝基化合物、重氮化合物等。免疫层析技术以固定有检测线和控制线的条状纤维层析材料为固定相，测试液为流动相，通过毛细作用使待测物在层析条上移动。待测物在T线处发生特异性免疫反应。游离物在C线处发生免疫反应。待测物层析方向免疫反应TC免疫层析技术基本原理示意图常用荧光免疫层析法夹心法竞争法双抗原夹心法双抗体夹心法竞争法 待测物中的某种抗原与T（检测线）线处同种抗原竞争性地与标记抗体相结合的过程。 竞争法含抗原AY1:A的单抗与标记物的偶联体Y2：抗原AY3:羊抗鼠二抗结合垫免疫层析法检测的实物图夹心法待测物中某种抗体（抗原）与T线处抗原A（抗原A）以及荧光标记的抗原（抗体）特异性相结合的过程，在T线处形成抗体A+抗原+抗体B形式的夹心结构。结合垫免疫层析法检测的实物图双抗体夹心法(k)Ab1-Ag-Ab2(k)Ab1(k)Ab1-AgAb2Ab3-(k)Ab1TC阳性结果T,C均有颜色待测液含抗原Ag待测液，不含抗原Ag(k)Ab1(k)Ab1(k)Ab1Ab2TCAb3-(k)Ab1阴性结果T无颜色，C有颜色双抗体加心法检测原理图 K代表某一标记物结合垫免疫层析法检测的实物图双抗原夹心法双抗原夹心反应模式阳性检测（左）与阴性检测（右）利用荧光免疫层析试纸条可以实现对待测物的定性或者定量检测.其他碳纳米管纳米磁性材料有机纳米粒子镧系元素量子点胶体金标记物金颗粒之间存在的静电斥力使其在水中保持相对稳定的状态，形成稳定的水溶性胶体，即称为胶体金胶体金胶体金既有明亮的色彩，又有高电子密度，可以吸附生物大分子，且不影响生物分子的活性，故可作为生物分子的标志物，用于免疫反应中抗原或抗体的标记定位，定性甚至定量研究。层析试纸标记用金颗粒的直径大多在 20 40 nm，呈深红色。胶体金标记蛋白质的过程是蛋白被动吸附到金颗粒表面的过程。由于蛋白分子牢固地结合在金颗粒表面，形成一个蛋白层，阻止了胶体金颗粒的相互接触，而使胶体金处于稳定状态。胶体金作为标志物有以下优势: 几乎可标记所有的蛋白分子，过程简单，效率高，用量少，便宜，基本不改变被标记蛋白的活性。且稳定，无毒，使用方便，保质期长。不同直径的纳米金可以用于多重标记。结果判断只需普通光学仪器或直接肉眼观察。胶体金作为标记物的应用试孕纸 应用（定量）08天津大学精密仪器与光电子工程学院与天津市进出口检验检疫局合作开发研发一种便携式仪器。竞争法原理用于农药残留定量检测2 镧系元素镧系元素又称为稀土金属元素，指元素周期表中原子序数 5771 的所有元素。两种不同镧系元素离子( 分别作为光吸收子和发射子) 掺杂入亚微米尺寸的陶瓷颗粒( 作为主基质) 中，会构成一类能上转发光产生荧光的特殊材料。 UCP( up-converting phosphor，UCP) 颗粒。UCP 颗粒主要含有如下三种成分: 主基质：氧硫化物（Y2O2S,GdO2S）、氟化物(YF3,GdF3）、硅酸盐(YSi2O5,YSi3O7）.吸收子Yb3+ Er3+ Sm3+发射子Er3+ Ho3+ Tm3+ A2S1S2A1A3UCP独特的优势高敏感性，有报道 UCP 的灵敏度可达胶体金的 100 倍。高稳定性，UCP 的发光信号不受检测环境或样品腐蚀或标志物自身衰变等的影响，可长期存放和可重复。使用简便，安全无毒，可适用于定量分析与多重分析，在一般的实验室或野外现场都可轻松应用.中科院报道了一种用于免疫活性检测的UCP试纸条读数计，采用半导体激光器作为光源，CCD作为光电接收器，步进电机带动控制试纸条移动的装置 UCP应用举例军事医学科学院研制出一种UPT十通道免疫层析试纸盘，同时检测多种抗体以确证是否感染鼠疫菌霍乱弧菌霍乱烈性肠道传染病甲胎蛋白(AFP）-肝癌的特异性指标。3 量子点量子点( quantum dots，QDs)，主要指主族 ( 如 CdSe) ， ( 如 InP、InAs、GaSe) ，副族化合物以及 Si 等元素组成的纳米颗粒QDs 有可精确调谐的发射波长，通过调整粒子尺寸可得到不同发射光谱，即可使用大小不同的同种 QDs 颗粒实现不同颜色标记。较大的Stokes 位移和狭窄对称的荧光谱峰。使得用同一激发光源可同时激发不同大小的量子点，产生不同发射光谱，使同步检测多样本成为可能。QDs 荧光性质稳定，可长期保存，经受反复多次激发。生物相容性好 物理结合 化学偶联量子点是一种新的荧光标记物，目前在免疫层析中得应用相对UCP，胶体金较少见报道。张国华，赖卫华等，量子点标记免疫层析试纸条快速检测莱克多巴胺的研究J，2009，以CdSe为标记物，对莱克多巴胺(一种苯酚胺类-肾上腺素激动剂)快速定量检测。胡华军，付 涛等，CdTe / ZnSe 核壳量子点免疫层析试纸条检测克伦特罗的研究，2010,检测克伦特罗( Clenbuterol，CLE) 属于 -兴奋剂类药物,又称“瘦肉精”量子点在免疫层析中的应用4有机纳米粒子荧光素衍生物等荧光染料类有机纳米粒子是早期常用于免疫层析技术中的一大类标志物，如异硫氰酸酯荧光素，标记原理基本都是利用荧光分子中的异硫氰酸根为反应基团，与蛋白分子中的氨基结合，实现对蛋白的标记，同时以分子中的荧光素为检测信号，早期应用研究较多。有机纳米粒子的荧光发射依赖于粒子本身的化学发光集团不具有无机纳米粒子的波长可调控的尺寸效应。5纳米磁性颗粒纳米磁性颗粒( magnetic nanoparticle，MNs) 也被称为超顺磁颗粒，它结合了磁性粒子和纳米材料的优点，具有粒径小、超顺磁性和比表面积大等特性。典型的是以磁性材料四氧化三铁.表面引入活性基团，通过耦联反应与酶、抗体等生物分子结合形成生物标志物.超顺磁性. 6碳纳米管碳纳米管( carbon nanotubes，CNTs) 的结构可看成是石墨的六角形网格结构发生一定弯曲而形成的空间拓扑结构。CNTs 作为生物分子标志物的原理与胶体金类似，其明显的黑色在定性或半定量检测中肉眼即可见。目前无论用何种方法制备 CNTs，均难以去除其中混杂的无定形碳、石墨碳碎片等杂质，这些杂质与 CNTs 混杂在一起，严重限制了 CNTs的研究与应用1.1王倩倩，颜红侠，李朋博，等 碳纳米管的纯化、性能及应用J 化学工业与工程，2010，27( 3) : 259-265