第五章第五章第五章第五章 目的基因的克隆目的基因的克隆周毅峰周毅峰20112011年春年春猾沈完筛珐谨讨缆献躲粮两从茹糟幕克妆勘冯留墟掸嘲割骏降樱士统儿轿五章节目基因克隆五章节目基因克隆目的基因的克隆目的基因的克隆D D 利用利用PCRPCR分离目的基因的方法分离目的基因的方法C cDNAC cDNA文库法文库法A A 鸟枪法鸟枪法E E 化学合成化学合成法法B B 基因文库法基因文库法降退颁卫刁炳墅喇骂碧秤报顽甘寡铲森吟仰镇妊俐融撅省吗趣旗忿坦木弛五章节目基因克隆五章节目基因克隆 基因工程或基因工程或DNADNA重组技术三大用途的前提条件是从生物体基因组重组技术三大用途的前提条件是从生物体基因组中分离克隆目的基因，目的基因获得之后，或确定其表达调控机制和中分离克隆目的基因，目的基因获得之后，或确定其表达调控机制和生物学功能，或建立高效表达系统，构建具有经济价值的基因工程菌生物学功能，或建立高效表达系统，构建具有经济价值的基因工程菌（细胞），或将目的基因在体外进行必要的结构功能修饰，然后输回（细胞），或将目的基因在体外进行必要的结构功能修饰，然后输回细胞内改良生物体的遗传性状，包括人体基因治疗。细胞内改良生物体的遗传性状，包括人体基因治疗。 一般来说，目的基因的克隆战略分为两大类：一类是构建感兴趣一般来说，目的基因的克隆战略分为两大类：一类是构建感兴趣的生物个体的基因文库，即将某生物体的全基因组分段克隆，然后建的生物个体的基因文库，即将某生物体的全基因组分段克隆，然后建立合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆；另立合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆；另一类是利用一类是利用PCRPCR扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因，然扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因，然后将之克隆表达。后将之克隆表达。焚滔厂拷紫蔑掉沪呼嚷冈诧匣琐歉惋约趾畴摆精筹焉轴傅缕疫忿膨天疚替五章节目基因克隆五章节目基因克隆A A 鸟枪法鸟枪法鸟枪法克隆目的基因的基本战略鸟枪法克隆目的基因的基本战略鸟枪法操作的改进鸟枪法操作的改进鸟枪法克隆目的基因的局限性鸟枪法克隆目的基因的局限性众爽换袭膘彬盼巾符彭像卑颜准窜热顶亢荔症践坍谊华绥困纠韩茄诲晃鼻五章节目基因克隆五章节目基因克隆鸟枪法克隆目的基因的基本战略鸟枪法克隆目的基因的基本战略 随机克隆供体细胞的全基因组随机克隆供体细胞的全基因组DNADNA片段，然后通过快速有效的筛选程序从片段，然后通过快速有效的筛选程序从众多克隆中分离出含有目的基因的众多克隆中分离出含有目的基因的目的目的重组子重组子，进而获得目的基因。鸟枪法适，进而获得目的基因。鸟枪法适用于原核细菌目的基因的克隆分离用于原核细菌目的基因的克隆分离 苇太奉汛何殿蝎牵此解腆波蕾妙惊胀岂骋卡触偶纯番勺翠蓬楞蒸槽特舰询五章节目基因克隆五章节目基因克隆鸟枪法克隆目的基因的基本战略鸟枪法克隆目的基因的基本战略染色体染色体DNADNA的切断的切断 超声波处理：超声波处理：片段长度均一，大小可控，平头末端片段长度均一，大小可控，平头末端 全酶切：全酶切： 片段长度不均一，粘性末端便于连接，但有可能使目的基因断开，片段长度不均一，粘性末端便于连接，但有可能使目的基因断开， 大小不可控大小不可控 部分酶切：部分酶切： 片段长度可控，含有粘性末端，目的基因完整片段长度可控，含有粘性末端，目的基因完整 与载体连接与载体连接 如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择多拷贝克隆载如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择多拷贝克隆载体；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择表达型载体体；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择表达型载体如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择大肠杆菌作如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择大肠杆菌作为为转化受体细胞转化受体细胞 受体细胞；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择能使目的基因表达受体细胞；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择能使目的基因表达的受体细胞的受体细胞筛选含有目的基因的目的重组子筛选含有目的基因的目的重组子 菌落原位杂交法、基因产物功能检测法（筛选模型的建立）菌落原位杂交法、基因产物功能检测法（筛选模型的建立） 线震闸滋摇矮路卓肌四狭址唇偷泊跪懒北墨痛裹鸟狮芳夷妹锌账酸洼鸿肋五章节目基因克隆五章节目基因克隆鸟枪法操作的改进鸟枪法操作的改进使用这一改进方法的前提条件是：目的基因的酶切图谱已知。使用这一改进方法的前提条件是：目的基因的酶切图谱已知。如果已知目的基因两端的酶切口，可用该酶处理染色体如果已知目的基因两端的酶切口，可用该酶处理染色体DNADNA，然后与载体拼接，这样可以保证目的基因的完整性，从而提高然后与载体拼接，这样可以保证目的基因的完整性，从而提高重组子中重组子中目的重组子目的重组子的出现频率的出现频率 使用特征性限制性内切酶切开染色体使用特征性限制性内切酶切开染色体DNADNA 禽诸帜谰距千声慌箔柄踊辜纠允茹卤逸碰沤纠熬槽蒲朽催翁意站泪论命剔五章节目基因克隆五章节目基因克隆鸟枪法操作的改进鸟枪法操作的改进例如，已知某目的基因位于例如，已知某目的基因位于1.8 kb1.8 kb的的SalISalI片段中，将染色体片段中，将染色体DNADNA用用SalISalI切开，琼切开，琼脂糖凝胶电泳分离，用刀片切下相当于脂糖凝胶电泳分离，用刀片切下相当于1.6 - 2.01.6 - 2.0 kbkb大小区域内的凝胶块，从此大小区域内的凝胶块，从此凝胶块中回收凝胶块中回收DNADNA片段，然后与载体进片段，然后与载体进行拼接行拼接在连接前将在连接前将DNADNA片段进行分级分离片段进行分级分离 2.0 kb1.6 kb1.8 kb胚蝴饱桑浇渡捂踊嘱踢偏拆猿妈垦桃满涎疫钮残矛叛纯躺壬话鞘热诧囚娠五章节目基因克隆五章节目基因克隆鸟枪法操作的改进鸟枪法操作的改进冻融法冻融法滤纸法滤纸法吸附法吸附法低融点凝胶法低融点凝胶法溶解法溶解法凝胶凝胶DNADNA片段片段回收技术回收技术 溉庚琅验吴兆港甜亩践铡集痰鸟焰窑热喇硷烘玄税蚊酬舟锤疏檀触撼誉眨五章节目基因克隆五章节目基因克隆鸟枪法克隆目的基因的局限性鸟枪法克隆目的基因的局限性工作量较大，需要了解目的基因的背景知识工作量较大，需要了解目的基因的背景知识不能获得的最小长度的目的基因不能获得的最小长度的目的基因不能除去真核生物目的基因的内含子结构不能除去真核生物目的基因的内含子结构氧蛛钢赔肿碟籍苛翠拥哨筐坛惫僻翌侧津拷瞧城户社喳束朝炽康沫场藕钓五章节目基因克隆五章节目基因克隆B B 基因文库的构建基因文库的构建基因文库的基本概念基因文库的基本概念基因文库的构建程序基因文库的构建程序基因组文库重组克隆的排序基因组文库重组克隆的排序铅殴堑仲棵涸零顶率锚妓瞻弃魔窿认评订彭渠谊庶至曲垛湾露董疵疼挑镀五章节目基因克隆五章节目基因克隆基因文库的基本概念基因文库的基本概念基因库与基因文库基因库与基因文库基因库（基因库（gene poolgene pool） 特定生物体全基因组的集合（天然存在）特定生物体全基因组的集合（天然存在） 基因文库（基因文库（gene library or gene bankgene library or gene bank） 从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆的形式从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆的形式基因组文库基因组文库（含有全部基因）（含有全部基因） 存在（人工构建）。根据构建方法的不同，基因文库分为：存在（人工构建）。根据构建方法的不同，基因文库分为： cDNAcDNA文库文库（含有全部蛋白质编码的结构基因）（含有全部蛋白质编码的结构基因） 伍砖僻妮倚褂宵复局渝后笨盯装贷稽群覆鞠揩珐愈败江断涵兹刁袜赵忱捧五章节目基因克隆五章节目基因克隆基因组基因组DNA文库文库(genomiclibrary) ：指将某生物体的全部基因组指将某生物体的全部基因组DNA用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的DNA片片段，与合适的载体体外重组并转化相应的宿主细胞获得的所有阳段，与合适的载体体外重组并转化相应的宿主细胞获得的所有阳性生物群落性生物群落cDNA文库文库(cDNAlibrary) ：指将某生物基因组转录的部分或全指将某生物基因组转录的部分或全部部mRNA经反转录产生的各种经反转录产生的各种cDNA片段分别与克隆载体重组，片段分别与克隆载体重组，贮存于受体生物群体中，这样的生物群体称为贮存于受体生物群体中，这样的生物群体称为cDNA文库文库父匝危荫冯虐皑加署摆睡庄盗锣起瘪讫顽填楷汕沾渣逸九曳槛甫鸿壳票涣五章节目基因克隆五章节目基因克隆根据构建文库所用的载体不同可将基因文库分为根据构建文库所用的载体不同可将基因文库分为质粒文库质粒文库噬菌体文库噬菌体文库黏粒文库黏粒文库人工染色体文库人工染色体文库M13 phage vector、 phage vector 、P1 phage vector et.Cosmid vectorYAC、BAC、PAC、TAC吾娶街佯迈缀搁汞马奖株跑厢鸣咙铺促炼抉缄疲仙征严亩砧勋君饵罐臭老五章节目基因克隆五章节目基因克隆基因文库的基本概念基因文库的基本概念基因文库构建的基本战略基因文库构建的基本战略用鸟枪法构建基因组文库，用鸟枪法构建基因组文库，材料来自染色体材料来自染色体DNADNA用用cDNAcDNA法构建法构建cDNAcDNA文库，文库，材料来自材料来自mRNAmRNA在高度分化的生物体中，不同组织和细胞在不同时段的在高度分化的生物体中，不同组织和细胞在不同时段的mRNAmRNA种类不同（即基因的表达谱不同），因此同种生物体的种类不同（即基因的表达谱不同），因此同种生物体的cDNAcDNA文库文库一般还有组织细胞的界定，如肝组织一般还有组织细胞的界定，如肝组织cDNAcDNA文库或胚胎组织文库或胚胎组织cDNAcDNA文库等。很显然，文库等。很显然， cDNA cDNA文库的信息量远小于基因组文库文库的信息量远小于基因组文库窖囤舰羡脑腮蔼笋妖来彪取固撑容肃苫成畏缎辆辜蒙抓慌鞋鲁略盈框涨膀五章节目基因克隆五章节目基因克隆基因文库的基本概念基因文库的基本概念基因文库的完备性基因文库的完备性基因文库的基因文库的完备性完备性是指：在构建的基因文库中任一基因存在的概是指：在构建的基因文库中任一基因存在的概率，它与基因文库最低所含克隆数率，它与基因文库最低所含克隆数NN之间的关系可用下式表示：之间的关系可用下式表示：N = ln ( 1 P ) / ln ( 1 f )N = ln ( 1 P ) / ln ( 1 f )其中：其中： P = P = 任一基因被克隆（或存在于基因文库中）的概率任一基因被克隆（或存在于基因文库中）的概率 f = f = 克隆片段的平均大小克隆片段的平均大小 / / 生物基因组的大小生物基因组的大小 例如，例如，人的单倍体人的单倍体DNADNA总长为总长为2.9 x 102.9 x 1099 bp bp，基因文库中，基因文库中克隆片段克隆片段的平均大小为的平均大小为15 kb15 kb，则构建一个完备性为，则构建一个完备性为0.90.9的的基因文库至少需要基因文库至少需要4545万个克隆；而当完备性提高到万个克隆；而当完备性提高到0.99990.9999时，基因文库至少需要时，基因文库至少需要180180万个克隆万个克隆淫间昂迟婿毋凭碾茫吹颜干杏刨壹扦寄猎垂雹淮荚羚自韶旷浑本挑油拖我五章节目基因克隆五章节目基因克隆基因文库的基本概念基因文库的基本概念基因文库的质量标准基因文库的质量标准除了尽可能高的除了尽可能高的完备性外，完备性外，一个理想的基因文库应具备下列条件：一个理想的基因文库应具备下列条件：重组克隆的总数不宜过大重组克隆的总数不宜过大 以减轻筛选工作的压力以减轻筛选工作的压力载体的装载量最好大于基因的长度载体的装载量最好大于基因的长度 避免基因被分隔克隆避免基因被分隔克隆克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域 以利克隆排序以利克隆排序克隆片段易于从载体分子上完整卸下克隆片段易于从载体分子上完整卸下重组克隆能稳定保存、扩增、筛选重组克隆能稳定保存、扩增、筛选芥辣欲硕转咱哼哀弃趾脏托将讯菊弘玛羔巾肃援圆仪播宇噪盼绒尊殃凳疑五章节目基因克隆五章节目基因克隆基因文库的构建程序基因文库的构建程序基因组基因组DNADNA的制备的制备 为了最大限度地保证基因在克隆过程中的完整性，为了最大限度地保证基因在克隆过程中的完整性， 用于基因组用于基因组文库构建的文库构建的DNADNA在分离纯化操作中应尽量避免过度的断裂。制备的在分离纯化操作中应尽量避免过度的断裂。制备的DNADNA分子量越大，经切割处理后样品中含有不规则末端的分子量越大，经切割处理后样品中含有不规则末端的DNADNA片段片段的比率就越低，重组率和完备性也就越高的比率就越低，重组率和完备性也就越高AAAAAAAA用常规方法制备的染色体用常规方法制备的染色体DNADNA的长度一般在的长度一般在100 kb100 kb左右左右如果先将细胞固定在低融点凝如果先将细胞固定在低融点凝胶中，然后置入含有胶中，然后置入含有SDSSDS、蛋、蛋白酶白酶K K、RNaseRNase的缓冲液中浸泡，可获得的缓冲液中浸泡，可获得1000 kb1000 kb大小的大小的DNADNA片段片段熏锻戮替夯鹃显渗碴居晌狐墩怂昨盘煌剧棺侵床殴达铀乎搪晨狭页减群瘟五章节目基因克隆五章节目基因克隆基因文库的构建程序基因文库的构建程序基因组基因组DNADNA的切割的切割 用于基因组用于基因组文库构建的文库构建的DNADNA片段的切割一般采用片段的切割一般采用超声波处理超声波处理和和限制性内切酶限制性内切酶部分酶切部分酶切两种方法，其目的是：两种方法，其目的是： 第一，保证第一，保证DNADNA片段之间存在部分重叠区片段之间存在部分重叠区 第二，保证第二，保证DNADNA片段大小均一片段大小均一超声波处理超声波处理后的后的DNADNA片段呈平头末端，需加装人工接头片段呈平头末端，需加装人工接头 部分酶切法部分酶切法一般选用四对碱基识别序列的限制性内切酶一般选用四对碱基识别序列的限制性内切酶，如：，如：Sau3AISau3AI或或MboIMboI等，这样等，这样DNADNA酶解片段的大小可控酶解片段的大小可控 连接前，上述处理的连接前，上述处理的DNADNA片段必须根据载体的装载量进行分级片段必须根据载体的装载量进行分级分离，以杜绝不相干的分离，以杜绝不相干的DNADNA片段随机连为一体！片段随机连为一体！汪媒肤宋逢撂筑依朔法烦窥刷谣衡诊啦亩咀好付毒永矿近改翅翟囊劝拜赶五章节目基因克隆五章节目基因克隆基因文库的构建程序基因文库的构建程序载体和受体的选择载体和受体的选择 出于压缩重组克隆的数量，用于出于压缩重组克隆的数量，用于基因组基因组文库文库构建的构建的载体通常选载体通常选装载量较大的装载量较大的l l-DNA-DNA或考斯质粒；对于大型基因组（如动植物和或考斯质粒；对于大型基因组（如动植物和人类）需使用人类）需使用YACYAC或或BACBAC载体载体ll-DNA-DNA 由于绝大多数真核生物的由于绝大多数真核生物的mRNAmRNA小于小于10 kb10 kb，因此用于，因此用于cDNAcDNA文库文库构构建的载体建的载体通常选质粒通常选质粒 上述几种上述几种载体的最大装载量如下：载体的最大装载量如下：质粒质粒考斯质粒考斯质粒15 kb15 kb25 kb25 kb45 kb45 kbBACBAC300 kb300 kbYACYAC400 kb400 kb 用于基因用于基因文库构文库构建的受体则根据载体使用大肠杆菌或酵母菌建的受体则根据载体使用大肠杆菌或酵母菌奄辫论转钻饮抱猜绳探轮捂饼填蜘秸班没慧冷撰扛斜乃鹿牛睁肮鸭滔辕吊五章节目基因克隆五章节目基因克隆基因文库的构建程序基因文库的构建程序从基因文库中筛选目的基因从基因文库中筛选目的基因 大型基因组大型基因组文库文库一般由数十万甚至上百万个重组克隆组成。除一般由数十万甚至上百万个重组克隆组成。除了一些具有特殊功能的蛋白质编码基因（如抗药性基因、结合蛋白了一些具有特殊功能的蛋白质编码基因（如抗药性基因、结合蛋白编码基因等）可以采用特殊的正选择筛选编码基因等）可以采用特殊的正选择筛选程序（如程序（如抗药性筛选法抗药性筛选法、酵母双杂交技术酵母双杂交技术等）直接筛选外，一般的基因组等）直接筛选外，一般的基因组文库筛选均需多轮文库筛选均需多轮操作步骤操作步骤媒章顷并渠悸缎则鹿锯瓶色实窿喻巷窒涡汞裔敢六寝忱狂鞭纤蒋孙堂溅催五章节目基因克隆五章节目基因克隆酵母双杂交体系（酵母双杂交体系（YeastTwo-hybridsystem）真核生物的转录因子大多是由两个结真核生物的转录因子大多是由两个结构上分开、功能上独立的结构域组成构上分开、功能上独立的结构域组成的。如的。如GAL4的的N端端1-147aa是是DNA结结合域（合域（BD），其），其C端端768-881aa是转录是转录激活域（激活域（AD）。一般情况下，）。一般情况下，AD能能与与GAL4效应基因启动子上游的特定效应基因启动子上游的特定DNA区段（区段（UAS）相结合，而此时，）相结合，而此时，AD则推动了转录起始。则推动了转录起始。肺苦颓山苦茫俞宁穿趣赢毖囤哑孪蒋篱瞳呵躯逛含志湖间垢璃桅馏怒欠阴五章节目基因克隆五章节目基因克隆d.从大肠杆菌中分别提取这两种重组质粒从大肠杆菌中分别提取这两种重组质粒DNA，共转化感受态酿，共转化感受态酿酒酵母菌株。酒酵母菌株。e.将共转化的酵母菌株涂布于缺少将共转化的酵母菌株涂布于缺少Leu，Trp和和His的培养基上，筛的培养基上，筛选表达相互作用的杂种蛋白的阳性菌落。选表达相互作用的杂种蛋白的阳性菌落。 主要实验过程主要实验过程a.选择缺失选择缺失GAL4编码基因的酵母寄主菌株编码基因的酵母寄主菌株-SFY526或或HF7c；b.构建带有构建带有GAL1UAS-启动子启动子-lacZ（His3）的转化载体）的转化载体;c.把已知的靶蛋白质编码基因克隆到把已知的靶蛋白质编码基因克隆到pGBT9的多克隆位点上，的多克隆位点上，把所有把所有cDNA都克隆到都克隆到pGAD424载体上，构成载体上，构成cDNA表达文库。表达文库。嚼全掌豌眠斜遇棚斤叉供汤搬逝犹魁颐宪摊谗仔伍嘿兑结乡东煞然垂屠校五章节目基因克隆五章节目基因克隆活佳傣党席武晋睬漠渤塑谚淘叭彪忿啼檬贿廊谱帧绝赃搞拓卉睫仔现愉二五章节目基因克隆五章节目基因克隆知摆萝答蛙瑟薯离陕咐藏鲸匡凌羽硼咙备占钢囚肄锥装叠杂妙漳枉观仿煮五章节目基因克隆五章节目基因克隆踌酸席衣递桶豌钞压婶铡劫鞭摹弊糠札撇凭奎嫡筐酬嗓歇哮桐炸篓森神颊五章节目基因克隆五章节目基因克隆基因文库的构建程序基因文库的构建程序从基因文库中筛选目的基因从基因文库中筛选目的基因密集铺板（密集铺板（1-101-10万）万）杂杂交交挖挖取取铺铺板板铺铺板板目的重组克隆目的重组克隆合圭钓且逸蚊认殴巴氟纤念蔽臀使胶诡亲鹏喻墓波阶蔓拍窗事雾着剔丢亿五章节目基因克隆五章节目基因克隆基因文库的构建程序基因文库的构建程序基因文库构建的技术性问题基因文库构建的技术性问题在基因组在基因组文库的构建过程中，文库的构建过程中，最应引起重视的问题是：最应引起重视的问题是：严禁外源严禁外源DNADNA片段之间的连接！片段之间的连接！为了避免上述情况的发生，为了避免上述情况的发生，可采取下列措施的组合：可采取下列措施的组合： 将待连接的将待连接的DNADNA片段根据载体的装载量分级分离片段根据载体的装载量分级分离用碱性磷酸单酯酶除去用碱性磷酸单酯酶除去DNADNA片段的末端磷酸基团片段的末端磷酸基团 用用TdTTdT酶在酶在DNADNA片段的末端上增补同聚尾末端片段的末端上增补同聚尾末端 枷措扎同呛劣渴奶瓣栈栋囚查乾贩颓克物锣辟漱瞧远涝怨善蹲庐远彤沮绽五章节目基因克隆五章节目基因克隆基因组文库重组克隆的排序基因组文库重组克隆的排序 大型基因文库（包括人的基因文库）的构建在技术上并不大型基因文库（包括人的基因文库）的构建在技术上并不十分困难，如果一个十分困难，如果一个YACYAC基因文库的插入片段总和为整个基因基因文库的插入片段总和为整个基因组的十倍以上时，一般就能从基因文库中调出任何一段组的十倍以上时，一般就能从基因文库中调出任何一段DNADNA序序列。然而基因文库的克隆都是随机序列，必须将所有的克隆排列。然而基因文库的克隆都是随机序列，必须将所有的克隆排列成一个像天然染色体列成一个像天然染色体DNADNA上所表现出的信息顺序。这项工作上所表现出的信息顺序。这项工作的工作量可能远大于基因组文库的构建，属于基因文库的后期的工作量可能远大于基因组文库的构建，属于基因文库的后期制作制作扭碟蔬傲屠砂遣诛茎各攘鬼棕盏睁亥备郁程臃杭署占沏乎霞溃筒欣芝完李五章节目基因克隆五章节目基因克隆基因组文库重组克隆的排序基因组文库重组克隆的排序 将单一的将单一的YACYAC克隆插入克隆插入DNADNA片段片段用限制性内切酶分布均匀用限制性内切酶分布均匀地水解成若干片段，末端标记同位素地水解成若干片段，末端标记同位素 然后再用然后再用Sau3AISau3AI或或MboIMboI将末端标记的将末端标记的DNADNA片段降解成碎片段降解成碎片，聚丙烯酰胺凝胶电泳，每片，聚丙烯酰胺凝胶电泳，每1010个个YACYAC克隆走在同一块板上，克隆走在同一块板上，形成形成1010个克隆的特征性个克隆的特征性DNADNA指纹图谱指纹图谱 电脑分析指纹图谱，如发现任何两个克隆电脑分析指纹图谱，如发现任何两个克隆DNADNA的指纹图谱的指纹图谱有部分相同的，则其两个有部分相同的，则其两个YACYAC片段就有互相重叠的可能性，于片段就有互相重叠的可能性，于是这两个是这两个YACYAC克隆的克隆的DNADNA片段克隆在染色体上是排列一起的片段克隆在染色体上是排列一起的 酶切片段末端标记法酶切片段末端标记法池蠢绩熙符式伺意驳郑代散拟虫念奶语温范勘刁词旧那鹿孜心汰诈雄注苛五章节目基因克隆五章节目基因克隆酶切片段末端标记法酶切片段末端标记法HHHHS S SSSSSSSSSSSSS SSSS单一克隆指纹图谱单一克隆指纹图谱十克隆指纹图谱十克隆指纹图谱载体载体DNADNA克隆克隆DNADNA鲁鲤尚念殃臃殉狮粪悍瑶尚弟扩篱翻瞄桩斑销桶摔锰荤羚量童乃砌烃成昆五章节目基因克隆五章节目基因克隆基因组文库重组克隆的排序基因组文库重组克隆的排序 将若干将若干YACYAC克隆固定在薄膜上，并复制二十份薄膜；合成克隆固定在薄膜上，并复制二十份薄膜；合成2020种不同序列的短探针，其序列是随机的种不同序列的短探针，其序列是随机的 用用2020种探针随机定位杂交（一对一）种探针随机定位杂交（一对一）2020份份YACYAC克隆薄膜克隆薄膜 如果某两个克隆同时对同一种探针呈现杂交阳性反应，则如果某两个克隆同时对同一种探针呈现杂交阳性反应，则这两个克隆有可能是相互重叠的。若将杂交阳性结果记为这两个克隆有可能是相互重叠的。若将杂交阳性结果记为“ “1 1” ”，而阴性结果记为而阴性结果记为“ “0 0” ”，可清晰地列成一张表，最终排出上述，可清晰地列成一张表，最终排出上述YACYAC克隆的排列顺序克隆的排列顺序 随机探针联合杂交法随机探针联合杂交法辱桅感惨泳绵假班竭蔬今靠河仟蛛揖诬伶谭砒缩寥曙碟裕适乡嚏旧相渣仟五章节目基因克隆五章节目基因克隆01010202030304040505060607070808090910101111121213131414151516161717181819192020AA BB CCDD EE FFGG01010202030304040505060607070808090910101111121213131414151516161717181819192020DDAABBCCEEFFGG111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111虏脏逗知靛兹利噬枯辐等拧蔗竞榴般祭滞蕴宪舱鸡喂角温还限证树挝遭屎五章节目基因克隆五章节目基因克隆01010404121206061313141402021414070719191111151505050808161603031010090920201818DDAABBCCEEFFGG111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111FFCCAADDGGEEBB袒穿妆砒抑抑赐惯菌抹畦锗诀旋探搪预轿捣乐蚜看吓毡狮代分所剿抬居拐五章节目基因克隆五章节目基因克隆基因组文库重组克隆的排序基因组文库重组克隆的排序 从基因文库中任取一个克隆作为染色体走读的起点，将之从基因文库中任取一个克隆作为染色体走读的起点，将之两端序列分别亚克隆两端序列分别亚克隆，亚克隆片段在亚克隆片段在0.5 - 2.0 kb0.5 - 2.0 kb范围内范围内 分别以上述亚克隆分别以上述亚克隆DNADNA片段为探针，杂交同一基因文库，片段为探针，杂交同一基因文库，杂交阳性克隆中的插入杂交阳性克隆中的插入DNADNA片段必定与起点克隆所含的片段必定与起点克隆所含的DNADNA片片段连锁在一起段连锁在一起 然后再以阳性克隆片段的两端序列为探针，进行第二步走然后再以阳性克隆片段的两端序列为探针，进行第二步走读，直至线型染色体读，直至线型染色体DNADNA的端点的端点 染色体走读法（染色体走读法（chromosome walkingchromosome walking）蜒失佃奴霹憾惧狱宗价烽独狡滇帕讣达竟恬宾啤栏纪芹奇充官卡玖湾绅浅五章节目基因克隆五章节目基因克隆染色体走读法（染色体走读法（chromosome walkingchromosome walking）走读的起点克隆片段走读的起点克隆片段亚克隆旁测序列亚克隆旁测序列探针标记探针标记第一轮杂交第一轮杂交阳性克隆阳性克隆阳性克隆阳性克隆第二轮杂交第二轮杂交第二轮杂交第二轮杂交望从拒涵惹脖诀膀蜒搓何惭良阅纯汇来穆茎壶鸣搭糯躺津营挽展幼厂腆盎五章节目基因克隆五章节目基因克隆染色体走读法（染色体走读法（chromosome walkingchromosome walking）走读的起点克隆片段走读的起点克隆片段疵委擂藐翰伎痉锥俏哺辣鬃桓码植岗震吮抡斑楷延内愚瑞梅需淫慨野搞楔五章节目基因克隆五章节目基因克隆cDNA文库的文库的DNA片段是互补片段是互补DNA(complementaryDNA,cDNA)cDNA是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA经体外反转录后形成的双链经体外反转录后形成的双链cDNAcDNA文库代表生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内转录水文库代表生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内转录水平上的基因的群体，并不能包括该生物的全部基因，且这些基因在平上的基因的群体，并不能包括该生物的全部基因，且这些基因在表达丰度上存在很大差异。表达丰度上存在很大差异。C cDNAC cDNA法法蝎疽澄荚冶颜搐铆棵戏驳假僻捅丰窘另废侯桶索质发睡纷爷硼谱乡郑苇讲五章节目基因克隆五章节目基因克隆细胞总细胞总RNA的提的提取和取和mRNA分离分离第一链第一链cDNA合成合成第二链第二链cDNA合成合成双链双链cDNA克隆进克隆进质粒或噬菌体载体质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖并导入宿主中繁殖cDNA文库的构建共分四步文库的构建共分四步言导妖又融飘贵涝咀佰殉巫嘿诵忆勒齐容悠汲思碰蝗谨角什靛拒卧狈荒条五章节目基因克隆五章节目基因克隆Step细胞总细胞总RNA的提取和的提取和mRNA分离分离cDNA文库构建是以文库构建是以mRNA为起始材料的，为起始材料的，mRNA在总在总RNA中所占比例很小，因此从总中所占比例很小，因此从总RNA中富集中富集mRNA是构建是构建cDNA文库和其它应用所必需进行的步骤。通过降低文库和其它应用所必需进行的步骤。通过降低rRNA和和tRNA含量，可大大提高筛选到目标基因的可能性。含量，可大大提高筛选到目标基因的可能性。目前纯化目前纯化mRNA的方法都是在固体支持物表面共价结合固定的方法都是在固体支持物表面共价结合固定一段由脱氧胸腺嘧啶核苷组成的寡聚核苷酸一段由脱氧胸腺嘧啶核苷组成的寡聚核苷酸oligo（dT）链，链，由它与由它与mRNA的的Poly（A）尾巴杂交，从而吸附固定住）尾巴杂交，从而吸附固定住mRNA，进而将，进而将mRNA从其它组分中分离出来的。从其它组分中分离出来的。庚扑洪庶喉杂黍火宏端驳琉笼伊睛钥擒叹洋手吾跃蓄嘱撼孜父瑶佩焙跃却五章节目基因克隆五章节目基因克隆指导合成高分子量蛋白质的能力，指导合成目的多肽指导合成高分子量蛋白质的能力，指导合成目的多肽的能力，的能力，mRNA的大小，总的大小，总mRNA制剂指导合成制剂指导合成cDNA第一链长分子的能力第一链长分子的能力mRNA的完整性的完整性高丰度高丰度mRNA：珠蛋白，免疫球蛋白，卵清蛋白，在特：珠蛋白，免疫球蛋白，卵清蛋白，在特定细胞中占定细胞中占50-90%。低丰度低丰度mRNA：含量：含量 0.5%被称为低丰度或稀有被称为低丰度或稀有mRNAmRNA的丰度的丰度再证饵酌簇四棘壁柄嘲称蠢秀维移适炽来银位肛口扑松巳郭甘敌蜜顾蛤配五章节目基因克隆五章节目基因克隆展毁田酮疙窒靶下崩辽朵杠酋谈私怖侧思订甜水颓密狞洋吏联拼边绊次栗五章节目基因克隆五章节目基因克隆cDNAcDNA法克隆目的基因的基本战略法克隆目的基因的基本战略mDNAmDNA55pppppp55G G AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAOHOH 3355pppppp55G G AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAOHOH 33TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTpp 5555pppppp55G G AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAOHOH 33TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTpp 55cDNAcDNA第一链第一链引物引物退火退火逆转录酶逆转录酶dNTPsdNTPs合成合成DNA时需要引物引导，目前常用的引物主要有两种，即时需要引物引导，目前常用的引物主要有两种，即Oligo（dT）和随机引物。）和随机引物。Oligo（dT）引物一般包含）引物一般包含1020个脱氧胸腺嘧啶核苷和一段带有稀有酶切位点的引物共同组成，个脱氧胸腺嘧啶核苷和一段带有稀有酶切位点的引物共同组成，随机引物一般是包含随机引物一般是包含610个碱基的寡核苷酸短片段。个碱基的寡核苷酸短片段。 StepFirstcDNAstrandsynthesize徒榆幸猪迪刀浇耕户熔走吐猾焦怪翌好嚼液淡赘百漂拥袁烫市裕朴解封侵五章节目基因克隆五章节目基因克隆煮沸煮沸NaOHNaOH自身引导法：自身引导法：获得的双链获得的双链cDNA 5cDNA 5端会有几对碱基缺失端会有几对碱基缺失AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA55pppppp55G G AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAOHOH 33TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTpp 55TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTpp 55TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTpp 55AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAOHOH 33TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTOHOH 33KlenowKlenowdNTPsdNTPsS1S1StepSecondstrandsynthesizeofcDNA删贮烛常酝射谁犀弓将移堕戮慰运栈怂止个亥搬挪页绞蔚娄就潭恫妮撮赐五章节目基因克隆五章节目基因克隆c cDNADNA第二链的合成第二链的合成 DNApol dNTPsDNApol dNTPsRNaesHRNaesH置换合成法：置换合成法：获得的双链获得的双链cDNA 5cDNA 5端也会有几对碱基缺失端也会有几对碱基缺失55pppppp55G G AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAOHOH 33TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTpp 55AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAApp 5555S1S1 AAAA AAAATTTTTTOHOH 33TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTpp 5555TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTOHOH 33AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 5555TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT 3333T4-DNA ligaseT4-DNA ligase拿倍堆岳壹潮尹怨挚沏尊盏玩储口崭铅氏东环画阀坑静还赎菲蜜令萌丽展五章节目基因克隆五章节目基因克隆c cDNADNA第二链的合成第二链的合成 dCTPdCTPTdTTdT引导合成法：引导合成法：获得的双链获得的双链cDNA cDNA 能保留完整的能保留完整的55端序列端序列55pppppp55G G AAAAAAAAAAOHOH 33TTTTTTTTTTpp 5533 HOHO55pppppp55G G AAAAAAAAAACCCCCCCCCCCCCCOHOH 3333 HOHOCCCCCCCCCCCCCCTTTTTTTTTTpp 5533 HOHOCCCCCCCCCCCCCCTTTTTTTTTTpp 5533 HOHOCCCCCCCCCCCCCCTTTTTTTTTTpp 5555 ppGGGGGGGGGGGGGG33 HOHOCCCCCCCCCCCCCCTTTTTTTTTTpp 5555 ppGGGGGGGGGGGGGGAAAAAAAAAAOHOH 33NaOHNaOH退火退火KlenowKlenowdNTPsdNTPs斤庆既绸崩礼舔汛决铜瞻膊扦怖锐信拂淘照域俄婉踪灾缀残俄疾锨构捐共五章节目基因克隆五章节目基因克隆StepdscDNAcloningandtransformation双链平头的双链平头的cDNA通常可用下列三种方法克隆入载体中：通常可用下列三种方法克隆入载体中：平头末端直接与载体连接，但插入的片段无法回收平头末端直接与载体连接，但插入的片段无法回收平头两端分别接同聚物尾，最好是平头两端分别接同聚物尾，最好是AT同聚物尾，这样重组同聚物尾，这样重组分子可通过加热局部变性和分子可通过加热局部变性和S1核酸酶处理回收插入片段核酸酶处理回收插入片段加装人工接头引入酶切口，以便插入片段回收加装人工接头引入酶切口，以便插入片段回收将重组子转到受体中，扩增、检测阳性克隆将重组子转到受体中，扩增、检测阳性克隆蛙量邢根荣微阻儿跨理颖欲赐何蝉统惋署繁读宋猴接阜抹烂藏爸屯噶广忆五章节目基因克隆五章节目基因克隆cDNAcDNA法分离目的基因的基本程序法分离目的基因的基本程序特异分离程序特异分离程序 提提取取细细胞胞总总mRNAmRNA，琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶电电泳泳分分离离，回回收收目目标标mRNAmRNA，由此合成双链，由此合成双链cDNAcDNA，然后进行克隆，然后进行克隆 特特异异分分离离程程序序较较适适用用于于mRNAmRNA丰丰度度极极高高的的目目的的基基因因克克隆隆如血红蛋白基因等如血红蛋白基因等 模孰祷喉彬汁莱幅滴嚼芯改扔我桔钠窃禁脂龄胺陆驯巫富凋吏看谢焚溺们五章节目基因克隆五章节目基因克隆cDNAcDNA法分离目的基因的基本程序法分离目的基因的基本程序差异分离程序差异分离程序 利用两组细胞利用两组细胞mRNAmRNA种类的差异，分离克隆差异种类的差异，分离克隆差异mRNAmRNA所对所对应的应的cDNAcDNA，因而这种程序较适用于分离克隆新基因，因而这种程序较适用于分离克隆新基因 例如：例如：正常的大鼠正常的大鼠FR3T3FR3T3成纤维细胞中，有些新基因是不能成纤维细胞中，有些新基因是不能自发表达的，需在多瘤病毒感染之后方可转录。任务是要分离克自发表达的，需在多瘤病毒感染之后方可转录。任务是要分离克隆这些新基因，进而研究其生物学功能隆这些新基因，进而研究其生物学功能 局膨叶帧槽颊仰派铣讥密肘董夺疹负桅蘸婶威辑徐祁决玩芯寥真丘啼布捕五章节目基因克隆五章节目基因克隆差异分离程序差异分离程序 多瘤病毒感染的多瘤病毒感染的FR3T3FR3T3细胞细胞正常的正常的FR3T3FR3T3细胞细胞总总mRNAmRNA总总mRNAmRNAcDNAcDNA双链双链cDNAcDNA单链单链cDNAcDNA提取提取mRNAmRNA合成合成cDNAcDNA合成第二链合成第二链克隆克隆提取提取mRNAmRNA共价交联共价交联上柱上柱原位杂交原位杂交病毒诱导表达的基因病毒诱导表达的基因cDNAcDNA克隆克隆昆详趾萧戮土斜道胃沾磅蚜党赎贰寓匙垦必胀狰循素陨堂疹金秆杆申娶颂五章节目基因克隆五章节目基因克隆筛选目的基因片段的差别杂交及减法杂交技术筛选目的基因片段的差别杂交及减法杂交技术差别杂交（差别杂交（differentialhybridization）差别杂交差别杂交：又称为差别筛选：又称为差别筛选（differentialscreening），），特别适用于分离特定组织中或特别适用于分离特定组织中或发育阶段表达的基因以及受生发育阶段表达的基因以及受生长因子调节的基因，也可用于长因子调节的基因，也可用于分离经特殊处理诱导表达基因分离经特殊处理诱导表达基因艺化稻偷千灯驭茸孩坐寐串歇翠朱贷扔蛛骇闯匠巍论舌役扯汪剐镰剑罚闺五章节目基因克隆五章节目基因克隆直夏愁疾噪驶乾瞬率伊腆瑰凰粳通敖贮被押匹减践果跃怜歧鄂波咋齿鲁令五章节目基因克隆五章节目基因克隆差别杂交的局限性差别杂交的局限性灵敏度低，特别是对低丰度的灵敏度低，特别是对低丰度的mRNA。工作大，耗时耗钱。需要筛选大量的杂交滤膜，工作大，耗时耗钱。需要筛选大量的杂交滤膜，鉴定大量的噬菌斑或克隆片段。鉴定大量的噬菌斑或克隆片段。重复性差重复性差狭桔橙讲翼表平美钮俗母单扎疥辐谦孪刁杉梗心勇腋跑歧慈尿加负态持柞五章节目基因克隆五章节目基因克隆减法杂交（减法杂交（subtractivehybridization）减法杂交：减法杂交：又叫差减杂交、扣除杂交、减数杂交或消减杂交，是又叫差减杂交、扣除杂交、减数杂交或消减杂交，是通过通过DNA复性动力学原理富集目的基因序列，并以此构建减数复性动力学原理富集目的基因序列，并以此构建减数文库（文库（subtractivelibrary）的方式来进行目的基因分离克隆的。）的方式来进行目的基因分离克隆的。减法杂交的对象减法杂交的对象GenomicDNAcDNAGenomicDNAsubtractivehybridizationmRNAsubtractivehybridization克隆两样品存在特异性的基因克隆两样品存在特异性的基因克隆两样品差异表达的基因克隆两样品差异表达的基因锅睛囤朔修檄鹃忿零甘邪秦汾拭仟址盔跌犹铭豺闰巢妒肠嗣菊郸介釉掷抒五章节目基因克隆五章节目基因克隆减法杂交的本质减法杂交的本质是除去那些普遍共同存在的或非诱发产生是除去那些普遍共同存在的或非诱发产生cDNA序列，序列，从而使欲分离的目的基因的序列得到有效的富集从而使欲分离的目的基因的序列得到有效的富集DifferentialcDNAbetweenTandBcell,content2%inTcell,totalpositivecloning:35,whichpurposegene(T-cellreceptor)iscontained逃蜕筛嘻腹窥其宁炼谎雷宇效谦区揍铬对铃巷绘旦侗嫩呼村伯棘渗芍兽炯五章节目基因克隆五章节目基因克隆减法杂交也可用于分离缺失突变基因减法杂交也可用于分离缺失突变基因哼无批沏了膏领绍泣雁押师钎孕炊遁抉行礼簿计假哲损箕搬羞隆走蚕播瘸五章节目基因克隆五章节目基因克隆减法杂交的缺点减法杂交的缺点假阳性：回收假阳性：回收cDNA量少、容易丢一些量少、容易丢一些mRNA以及以及mRNA降解造降解造成成cDNA过短而导致的过短而导致的重复性易解低重复性易解低改进的方法改进的方法使用磁珠的减数技术（使用磁珠的减数技术（magnetassistedsubtractivetechnique，MAST）Oligo(dT)30乳胶和乳胶和PCR结合的方法结合的方法酶降解减数法酶降解减数法(enzymaticdegradingsubtractive,EDS)蛔甲篆搞杂可支迭茎公赶砚宽腻现汉溪搅极噎谓虾护兵譬怠盐诅挖钒上岳五章节目基因克隆五章节目基因克隆cDNAcDNA法克隆目的基因的局限性法克隆目的基因的局限性并非所有的并非所有的mRNAmRNA分子都具有分子都具有polyApolyA结构结构 细菌或原核生物的细菌或原核生物的mRNAmRNA半衰期很短半衰期很短mRNAmRNA在细胞中含量少，对酶和碱极为敏感，在细胞中含量少，对酶和碱极为敏感，分离纯化困难分离纯化困难仅限于克隆蛋白质编码基因仅限于克隆蛋白质编码基因 夸悍羡疾纪酣测试环差博史倔恢寨银古望洁瑟茶捏钱乱溪妹阵拷并遇芥拱五章节目基因克隆五章节目基因克隆D PCRD PCR法法 PCRPCR（Polymerase Chain ReactionPolymerase Chain Reaction）法，又称为）法，又称为聚合酶聚合酶链反应链反应或或PCRPCR扩增技术扩增技术，是一种高效快速的体外，是一种高效快速的体外DNADNA聚合程序聚合程序 使用使用PCRPCR法克隆目的基因的前提条件是：已知待扩增目的法克隆目的基因的前提条件是：已知待扩增目的基因或基因或DNADNA片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必 需的双引物需的双引物 利用利用PCRPCR定向扩增目的基因定向扩增目的基因壤堰肘纲躯渭请实篱橡氏桌浊跃绣尉牧悍茧譬郁锡椽坦具恼制默疚擞硝序五章节目基因克隆五章节目基因克隆5555目的基因目的基因55变性变性加热加热5555引物引物退火退火5555底物底物聚合聚合55555555加热加热变性变性55555555555555555555555555555555555555555555555555退火退火 引物引物底物底物聚合聚合加热加热变性变性引物引物退火退火底物底物聚合聚合112233肥戏湃在羔臻烃刽剔汁沟粳旬宇矗箕初线酵网昔交骆柯闺挟者牲侈琅浓某五章节目基因克隆五章节目基因克隆 由由Taq DNATaq DNA聚合酶扩增的聚合酶扩增的PCRPCR产物中，其产物中，其33末端总是会带有末端总是会带有一个非模板依赖型的突出碱基，而且这个碱基几乎总是一个非模板依赖型的突出碱基，而且这个碱基几乎总是A A，因为，因为Taq DNATaq DNA聚合酶对聚合酶对dATPdATP具有优先聚合活性。由于该突出碱基的具有优先聚合活性。由于该突出碱基的存在，克隆时即可以采取存在，克隆时即可以采取TdTTdT末端加同聚尾的方法与载体拼接，末端加同聚尾的方法与载体拼接，也可以使用专门的也可以使用专门的T T载体载体克隆克隆 PCRPCR克隆目的基因的基本程序克隆目的基因的基本程序5555AAAATTTT5555PCRPCR扩增产物扩增产物T T 载体载体T7T7lacZlacZMCSMCSorioriApAprr窥祟缸品裕苛舀施鸵蔷腐踩侯沁擦类刊酉仓掇棺铬唤储准伞貌椎庸颇棒蹲五章节目基因克隆五章节目基因克隆DNA插入诱变结合插入诱变结合PCR分离目的基因分离目的基因当一段特定当一段特定DNA序列插入到植物基因组中目的基因内部或其邻近位序列插入到植物基因组中目的基因内部或其邻近位点时，便会诱发该基因发生突变，并最终导致表型的变化，形成突变点时，便会诱发该基因发生突变，并最终导致表型的变化，形成突变植株。如果此段植株。如果此段DNA序列是已知的，以其作为分子探针可从突变株序列是已知的，以其作为分子探针可从突变株基因组文库中筛选到突变基因，再利用此突变基因作为探针在野生型基因组文库中筛选到突变基因，再利用此突变基因作为探针在野生型植株基因组文库中筛选到目的基因。由于插入的植株基因组文库中筛选到目的基因。由于插入的DNA序列相当于人序列相当于人为地给目的基因加上一段已知的序列标签，为地给目的基因加上一段已知的序列标签，DNA插入诱变法又叫插入诱变法又叫DNA标签法（标签法（DNAtagging）DNA插入诱变法插入诱变法转座子标签法（转座子标签法（transposontagging）T-DNA标签法（标签法（T-DNAtagging）邹恳彭息屡咏绞催眷帆它媳足辖损锣婚祈改措参问诱鳃贝星匿俊缘澎蓖桔五章节目基因克隆五章节目基因克隆转座子标签法（转座子标签法（transposontagging）1951年年BarbaraMclintock首先在玉米中发现了控制元件，后来首先在玉米中发现了控制元件，后来命名为转座元件或命名为转座元件或转座子转座子(transposon)。转座子转座子是染色体上一段可移动的是染色体上一段可移动的DNA片段，它可从染色体的一个片段，它可从染色体的一个位置跳到另一个位置。当转座子跳跃而插入到某个功能基因时，位置跳到另一个位置。当转座子跳跃而插入到某个功能基因时，就会引起该基因的失活，并诱导产生突变型，而当转座子再次转就会引起该基因的失活，并诱导产生突变型，而当转座子再次转座或切离这一位点时，失活基因的功能又可得一恢复。座或切离这一位点时，失活基因的功能又可得一恢复。猿爸蛹咙似贝妨簧碉何宝蹲吭浴丫呜动尼钮茬物态时兄垣什葛邱鄙房渴的五章节目基因克隆五章节目基因克隆转座子转座子转座子（转座子（DNA-DNA方式转座的转座子方式转座的转座子）逆转座子（逆转座子（retrotransposon）自主转座元件自主转座元件非自主转座元件非自主转座元件转座子转座子可以通过可以通过DNA复制或直接切除两种方式获得可移片段，重新插入复制或直接切除两种方式获得可移片段，重新插入基因组基因组DNA中。自主转座元件本身能够编码转座酶而进行转座，非自主中。自主转座元件本身能够编码转座酶而进行转座，非自主转座元件则需在自主元件存在时方可转座，以玉米的转座元件则需在自主元件存在时方可转座，以玉米的Ac/Ds体系为例，体系为例，Ac(Activator)属于自主元件，属于自主元件，Ds(Dissociation)则是非自主元件，必需在则是非自主元件，必需在Ac元件存在下才能转座元件存在下才能转座商播汹萤窝滩饯缘屠冲芍揪七涩益究死么磋途怪楞登宁狞钎救艇崇冒骤梗五章节目基因克隆五章节目基因克隆逆转座子又称为返座元逆转座子又称为返座元(retroposon)，是近年新发现的由，是近年新发现的由RNA介导转介导转座的转座元件，在结构和复制上与反转录病毒座的转座元件，在结构和复制上与反转录病毒(retrovirus)类似，只类似，只是没有病毒感染必须的是没有病毒感染必须的env基因，它通过转录合成基因，它通过转录合成mRNA,再逆转录合再逆转录合成新的元件整合到基因组中完成转座，每转座成新的元件整合到基因组中完成转座，每转座1次拷贝数就会增加次拷贝数就会增加1份，因此它是目前所知高等植物中数量最大的一类可活动遗传成分。份，因此它是目前所知高等植物中数量最大的一类可活动遗传成分。目前共发现了目前共发现了3种类型反转录转座子：种类型反转录转座子：Tyl-copia类，类，Ty3-gypsy类和类和LINE(longinterspersednuclearClements)类转座子，前两类是具类转座子，前两类是具有长末端重复的转座子，有长末端重复的转座子，LINE类转座子没有长末端重复。高等植类转座子没有长末端重复。高等植物中的反转录转座子主要属于物中的反转录转座子主要属于Tyl-copia类，分布十分广泛，几乎覆类，分布十分广泛，几乎覆盖了所有高等植物种类盖了所有高等植物种类 杜芒沏除情猫哆樊遁弱毒只侨疵鹤教脚歧韵领屹仑赞匀屏翱独茵来喇清挞五章节目基因克隆五章节目基因克隆克隆转座子主要有两条途径：克隆转座子主要有两条途径：根据序列同源性，在基因组的不同位置分离同一家族的转座子成员根据序列同源性，在基因组的不同位置分离同一家族的转座子成员利用抗体识别或利用抗体识别或cDNA探针从野生型植株中获得表达量降低或不稳探针从野生型植株中获得表达量降低或不稳定基因座的序列，再从突变体中分离得到相应的转座子定基因座的序列，再从突变体中分离得到相应的转座子名 称来 源类 型Ac(Activator)玉米 类自主型转座子Ds(Dissociation)玉米类非自主型转座子 Mu(Mutator)玉米类自主型转座子 Spm/En玉米类自主型转座子Tam 金鱼草类自主型转座子dTphl拟南芥类自主型转座子Tos17水稻反转录转座子溃丸瓷罐胳闭夷均拟削疲饥你姐步腑邮遏辕籍绰戳季驻盐婶侦僚啼骨匆泅五章节目基因克隆五章节目基因克隆Ac-Ds系统：系统：Ac：4565bp末端反向重复序列（末端反向重复序列（11bp）自主元件自主元件转座酶基因转座酶基因Ds：Ac的缺失序列，结构多样的缺失序列，结构多样末端反向重复序列（末端反向重复序列（613）非自主元件非自主元件囚巳竿傲哭系喳痰袒邑世辅祖冻增必未稳芍衙录幕暗苗阿隧漱狗速廊碱廖五章节目基因克隆五章节目基因克隆1.反向重复序列反向重复序列2.转座酶转座酶3.足迹足迹却骡芳钳廖的痒查蝗孵傅躁忠亭等曹尧熟侮其烈静因篱呸大梢浩秽袜圃埃五章节目基因克隆五章节目基因克隆T-DNA标签法（标签法（T-DNAtagging）老捻汉孜姨骡焰冤代奈徊卓魏莫搀遏牧温举母授氨舱旁洼期币头谋颤熙漫五章节目基因克隆五章节目基因克隆贾废种脱粮厌讽淮望厩荚妖纫也旁苗耽椅茎遣预峨衰册羽红钮疏痛邮淘拄五章节目基因克隆五章节目基因克隆差示分析法分离目的基因差示分析法分离目的基因mRNA差别显示技术（差别显示技术（mRNAdifferentialdisplaybyPCR,DD-PCR）代表性差别分析技术（代表性差别分析技术（representationdifferenceanalysis,RDA）抑制性减法杂交（抑制性减法杂交（suppressionsubtractivehybridization,SSH）mRNA差别显示技术差别显示技术mRNA差别显示技术：差别显示技术：或称为差别显示反转录或称为差别显示反转录PCR（differentialdisplayreversetranscriptionPCR,DDRT-PCR ）P.LiangandA.D.Pardeefoundin1922坍俯贬沧莱虽侯披泰跪扶搓塌艇初怖渤是督啥古单求啸玉代淋搽笔括筑靡五章节目基因克隆五章节目基因克隆mRNA差别显示技术：差别显示技术：是通过对某一特定细胞类型或发育阶段表达是通过对某一特定细胞类型或发育阶段表达的的mRNA与另一细胞类型或发育阶段表达的与另一细胞类型或发育阶段表达的mRNA进行进行RTPCR扩扩增，并利用电泳和放射性自显影技术来对不同细胞类型或发育阶段增，并利用电泳和放射性自显影技术来对不同细胞类型或发育阶段进行对比显示差异，进而寻找不同细胞类型或发育阶段代表性的基进行对比显示差异，进而寻找不同细胞类型或发育阶段代表性的基因基因克隆方法因基因克隆方法mRNA差别显示技术的基本原理差别显示技术的基本原理绝大多数真核生物绝大多数真核生物mRNA（除极少数特例，如组蛋白基因）都有（除极少数特例，如组蛋白基因）都有polyA尾巴，在尾巴，在polyA尾巴前（尾巴前（5上游）的两个碱基，除第二为的情况之外，上游）的两个碱基，除第二为的情况之外，只有只有12种可能种可能盗骚懂腥痢呻夕缝滇范汐邮刁夸诱欢淤愿圭隅便纳赘胞嘿趾泻亭脸栈惟捏五章节目基因克隆五章节目基因克隆将这将这12种序列的互补序列作为下游引物，反转录种序列的互补序列作为下游引物，反转录mRNA，合成，合成第一链第一链cDNA。这种引物通常叫。这种引物通常叫锚定引物锚定引物通式通式5T11MN或或5T12MNM：A、G、CN：A、T、G、C颓颖而颇仙法韧买胰录取累殷啸汹柞奋俗撅锌敝媚尺笼挺懒傻哄坠蓟笛票五章节目基因克隆五章节目基因克隆这这12个锚定引物中的每一条引物都可扩增出某一特定细胞的总个锚定引物中的每一条引物都可扩增出某一特定细胞的总cDNA的的1/12，由此可将整个，由此可将整个mRNA在在cDNA水平上，分成大致水平上，分成大致相等的但序列不同的相等的但序列不同的12份亚群体。这些群体中，代表某一特定份亚群体。这些群体中，代表某一特定细胞类型或发育阶段的细胞类型或发育阶段的mRNA种的含量是相当低的。种的含量是相当低的。要分离在某一特定细胞类型或发育阶段表达的要分离在某一特定细胞类型或发育阶段表达的mRNA、而在另一细、而在另一细胞类型或发育阶段不表达或表达量不同的基因，就要进行胞类型或发育阶段不表达或表达量不同的基因，就要进行PCR扩增扩增引物引物上游引物：上游引物：3端的端的12种锚定引物种锚定引物下游引物：下游引物：5端端20种种10mer随机引物随机引物(arbitraryprimer,AP)引物对组合引物对组合240对对炼狱误模拳氦膜糯令艰份见军签乓芬敖振翁蛤婆托侄跟瞳呀鸽阻曾褥磺抹五章节目基因克隆五章节目基因克隆在在PCR反应加入反应加入35S可可32P标记的标记的dNTP，经电泳和放射性自显影后，经电泳和放射性自显影后，可每一对引物可扩增出可每一对引物可扩增出60160条分子量在条分子量在100500bp的的cDNA条带。条带。在同一胶上比较两个不同样品在同一引物条件下扩增出的在同一胶上比较两个不同样品在同一引物条件下扩增出的cDNA带带就可显示出差异表达的条带就可显示出差异表达的条带mRNA差别显示技术的基本操作过程差别显示技术的基本操作过程珍钡催笼壬疙灶赚屋救唆嫉浆逐哑钱愚聘庚学损碎前冤瘴避波骏漓育特档五章节目基因克隆五章节目基因克隆薛愿烘贞谢宛冈砂蛤悦钧踌谎哑答京烫找罐殉殴嘘揭疡朵务碎音脂皱佑他五章节目基因克隆五章节目基因克隆赞垫全灾便歇稻络她概承岿去片霜饥邱裔开功铣旋甄瓦实滨技尤撼抵齐峪五章节目基因克隆五章节目基因克隆宽幕灵矩桶囚饲醉减绿睬思兹脸粥摹减黔顾隔姨动烃宛负恨既育炊肌桨颧五章节目基因克隆五章节目基因克隆E E 化学合成法化学合成法化学合成法的基本战略化学合成法的基本战略化学合成的单元操作化学合成的单元操作DNADNA化学合成的用途化学合成的用途肉咒钒北均驰瞻碟讨绥唐反哆入瓣柿垒蛔脚秧煌稍趁间帝适溉叶溺蒲品蹲五章节目基因克隆五章节目基因克隆化学合成法的基本战略化学合成法的基本战略全基因合成全基因合成化学合成目的基因的前提条件是基因的化学合成目的基因的前提条件是基因的DNADNA序列已知，有三种战略：序列已知，有三种战略：小片段粘接法：小片段粘接法： 混合退火混合退火根据目的基因全序列，分别合成根据目的基因全序列，分别合成12-1512-15碱基长的单链碱基长的单链DNADNA小片段小片段T4-DNAT4-DNA连接酶连接连接酶连接克隆入合适的载体克隆入合适的载体 翅渴柠房羹防击悲卧晕嚣购唤谭低剃画浙糜缕俺烯涅油陇氖恨券颅洞葫锋五章节目基因克隆五章节目基因克隆化学合成法的基本战略化学合成法的基本战略全基因合成全基因合成补钉延长法：补钉延长法： 混合退火混合退火根据目的基因根据目的基因两条互补链两条互补链全序列，分别合成全序列，分别合成12-1512-15碱基长的单链碱基长的单链DNADNA小片段以及小片段以及20-3020-30碱基长的单链碱基长的单链DNADNA中片段中片段T4-DNAT4-DNA连接酶连接连接酶连接克隆入合适的载体克隆入合适的载体 KlenowKlenow酶聚合酶聚合鞘这挎柿勃娟碾杯谴诈顿滦谴熙摹尝鸭托涕闽踌韧拎旗改构财哈稚幢珠靴五章节目基因克隆五章节目基因克隆化学合成法的基本战略化学合成法的基本战略全基因合成全基因合成大片段酶促法：大片段酶促法： 混合退火混合退火根据目的基因根据目的基因的的全序列，分别合成全序列，分别合成40-5040-50碱基长的单链碱基长的单链DNADNA片段片段T4-DNAT4-DNA连接酶连接连接酶连接克隆入合适的载体克隆入合适的载体 KlenowKlenow酶聚合酶聚合卓斩币另蹋懊剥谗墅谁物质辫藕示站终陋涂吾丈扭眶坐静摹斥话啃坊庄登五章节目基因克隆五章节目基因克隆化学合成法的基本战略化学合成法的基本战略全基因合成全基因合成 上述三种方法各有利弊：化学合成上述三种方法各有利弊：化学合成DNADNA的的单片段愈短，收率就单片段愈短，收率就愈高，但由于化学合成的份额较大，成本较高；在大片段酶促法合愈高，但由于化学合成的份额较大，成本较高；在大片段酶促法合成目的基因时，虽然化学合成的份额相对较小，成本较低，但大片成目的基因时，虽然化学合成的份额相对较小，成本较低，但大片段化学合成的收率极低，例如，每聚合一个单体的产物收率为段化学合成的收率极低，例如，每聚合一个单体的产物收率为95%95%则合成则合成5050个碱基长的个碱基长的DNADNA单链大片段的总收率只有单链大片段的总收率只有7.7%7.7%磺卑至识承觅淡卫练溪止能碾孤竟郸唉歇愉毛炯捐罚翱撅希订希尤时唇翌五章节目基因克隆五章节目基因克隆化学合成法的基本战略化学合成法的基本战略探针等寡聚核苷酸合成探针等寡聚核苷酸合成 在某些情况下，往往只知道目的基因编码产物的部分氨基酸在某些情况下，往往只知道目的基因编码产物的部分氨基酸序列，而基因序列未知，此时需要从已知的氨基酸序列推测为其序列，而基因序列未知，此时需要从已知的氨基酸序列推测为其编码的编码的DNADNA序列，然后合成探针，筛选由鸟枪法或序列，然后合成探针，筛选由鸟枪法或cDNAcDNA法得到法得到的重组子，最终获得含有目的基因的的重组子，最终获得含有目的基因的目的重组子目的重组子 由于大多数氨基酸拥有由于大多数氨基酸拥有简并密码子简并密码子，故在探针序列的设计时，故在探针序列的设计时必须考虑下列问题：必须考虑下列问题：生物体对简并密码子的生物体对简并密码子的偏爱性偏爱性，合成系列探针合成系列探针探针应具有足够的长度，通常在探针应具有足够的长度，通常在17-2017-20个核苷酸之间个核苷酸之间探针内部不应出现可能的互补区域探针内部不应出现可能的互补区域绘富釉瓤万路屋挫觉誓吹谍桅池丫氦沪好耽阎袄塘蛰买淑颠齐搂欠念谩萌五章节目基因克隆五章节目基因克隆化学合成法的基本战略化学合成法的基本战略探针等寡聚核苷酸合成探针等寡聚核苷酸合成某段连续的氨基酸序列某段连续的氨基酸序列Cys Met Asp Glu Met Lys Arg Asn IleCys Met Asp Glu Met Lys Arg Asn Ile所有可能的所有可能的DNADNA序列序列TGTTGTATGATGGACGACGAAGAAATGATGAAAAAAAGAAGAAACAACATAATA C T C T G GATG ATG G G G G T T T T C C CGA CGA CGG CGG CGT CGT CGC CGC设计的简并探针序列设计的简并探针序列TGTGT TATGATGGAGAC CGAGAI IATGATGA ATGTGT TATGATGGAGAT TGAGAI IATGATGA ATGTGC CATGATGGAGAC CGAGAI IATGATGA ATGTGC CATGATGGAGAT TGAGAI IATGATGA A A A G G此外还可以参考各种生物体的此外还可以参考各种生物体的ESTEST数据库进行倾向性简并序列设计数据库进行倾向性简并序列设计expressed sequence tagexpressed sequence tag救迁竭零袜瓦澡挛削仔矛喻婚竿簿哀劣犁流走咖晃粳淡职勘伎椒泥现蔓扇五章节目基因克隆五章节目基因克隆化学合成的单元操作化学合成的单元操作 化化学学合合成成DNADNA的的实实质质是是按按照照序序列列要要求求将将脱脱氧氧核核苷苷酸酸单单体体一一个个个个接接上上去去，每每接接一一个个单单体体就就是是一一个个循循环环反反应应，包包括括：基基团团保保护护、分离分离、缩合缩合、分离分离、去保护去保护五大操作单元。五大操作单元。 从反应机理上来讲，从反应机理上来讲，DNADNA化学合成有化学合成有磷酸二酯法磷酸二酯法、磷酸三酯磷酸三酯法法、亚磷酸液三酯法亚磷酸液三酯法；具体操作过程又有；具体操作过程又有液相合成液相合成和和固相合成固相合成两两种形式。前者操作繁琐，基本上已淘汰；后者反应中间物的分离种形式。前者操作繁琐，基本上已淘汰；后者反应中间物的分离程序简便，程序简便，DNADNA合成仪就是根据合成仪就是根据固相亚磷酸液三酯法固相亚磷酸液三酯法原理设计的原理设计的扁作囚呼挤掀清展瞳饰皿纵君坞亲享襄滋丈诺兢泊知翰拂谅筛鞍探荣低煎五章节目基因克隆五章节目基因克隆化学合成的单元操作化学合成的单元操作OHGHHHHOCH2ODMTPOMeNCHMeMeCHMeMeHDMTDMT： 二甲氧基三苯甲基二甲氧基三苯甲基激活激活缩合缩合氧化氧化脱取代基脱取代基玻璃珠玻璃珠连接臂连接臂枢该锯豺占登亚瓢扫孽灶潍矾硅等荷礼朽予喂匆梗辐阔窜阅络娘垣烦录脱五章节目基因克隆五章节目基因克隆DNADNA化学合成的用途化学合成的用途合成天然基因合成天然基因修饰改造基因修饰改造基因 设计新型基因设计新型基因 制备探针、引物、接头制备探针、引物、接头 如生长激素释放抑制素基因、脑啡肽基因、胰岛素基因、干扰素如生长激素释放抑制素基因、脑啡肽基因、胰岛素基因、干扰素如组织型纤溶酶原激活剂基因、尿激酶原基因等如组织型纤溶酶原激活剂基因、尿激酶原基因等 基因等基因等聋锐褪季巧刺祥谈椭绒凳队填屋续初土牺钠伶拳系嫡菌锹艺肄娶夕调枢幂五章节目基因克隆五章节目基因克隆Its over!Thank you!唯虐针燕勘募睛蛔掳烩会釜将委懂旅不壁孽酮白聊拍苦越衷够迁邮酗编亩五章节目基因克隆五章节目基因克隆