第一章第一章 食品安全的微生物食品安全的微生物指标和质控制体系指标和质控制体系 第一节 食品安全的微生物指标一、食品微生物指标的设定 二、食品微生物指标及其检验（一）菌落总数测定 （二）大肠菌群检测（三）致病菌检验（四）霉菌和酵母菌测定第二节 食品安全的HACCP质量控制体系 一、食品微生物指标的设定一、食品微生物指标的设定食品中微生物的污染食品微生物危害变质食源性疾病如何避免食品中微生物的危害对微生物数量的限定对微生物种类的限定食品微生物指标的设定食品微生物指标的设定对终产品的卫生监督管理 生产过程的卫生质量控制的监测手段 HACCP质量控制体系 食品微生物指标的设定v指指标标微生物（微生物（indicator microorganismindicator microorganism）定义）定义：v在常规卫生监测中，用以反映检品卫生状况及安全性的指示性微生物。v设定指设定指标标微生物的原因微生物的原因v微生物（包括致病和非致病的）种类繁多，不可能一一检测v环境中致病微生物往往数量少，检测困难，需要用相对易于检测的微生物来间接反映指示微生物的选择全部食品中可检测存在的微生物，并可通过检测的微生物评价食品的质量；微生物的生长和数量应与产品质量有一定直接的互为对立的关系；易于检测和计数，并可从其他微生物中明确地区分开所要检测的微生物；在短时间内可以有检测结果；微生物生长不应受食品微生物群落中其他成分的负面影响。 检测简便： （易检出，易定量计数。）指示性好： （与食品卫生状况与安全性的相 关性好。）指示微生物的种类：指示微生物的种类：反映微生物综合污染：细菌、霉菌和酵母菌落总数反映微生物污染来源：粪便污染指示菌（大肠菌群、粪大肠菌群）大肠菌群，包括肠肝菌科的埃希氏菌属、枸椽酸杆菌属、肠杆菌属和克雷伯氏菌属。几乎都来自人或温血动物的粪便，因此可作为粪便污染食品的指示菌，食品中检出大肠菌群表示食品受到人与温血动物粪便的污染。肠道致病菌与大肠菌群的来源，在外环境中生存的时间基本一致，只是致病菌数量少，检出率低，因此，大肠菌群也可作为肠道致病菌污染食品的指示菌。不得检出的致病微生物食品微生物指标及其检验食品微生物指标及其检验 细菌菌落总数大肠菌群致病菌: 肠道致病菌、致病性球菌金黄色葡萄球菌霉菌和酵母菌计数霉菌分类鉴定真菌毒素检测样品的采集样品的采集(sampling)(sampling)样品种类样品种类大样（一整批样）、大样（一整批样）、中样（中样（200g,200g,食品各部食品各部分的混合样）、分的混合样）、小样（检样，小样（检样，25g 25g ）。）。采样数量（sampling rate）由食品的种类和总量大小而定肉类生生肉肉：取取屠屠宰宰后后两两腿腿内内侧侧肌肌或或背背最最长长肌肌100g/只只熟熟肉肉：酱酱卤卤制制品品，熏熏肉肉及及灌灌肠肠取取样样应应不不少少于于200g，烧烧烤烤制制品品应应取取样样50cm2熟禽：每份样品熟禽：每份样品1只只肉松：每份样品肉松：每份样品200g香肚：每份样品香肚：每份样品1个个要在容器的不同部位采取样品的处理 (treatment of sample) 以无菌操作，将检样25g置于灭菌生理盐水或其它稀释液中处理，做成110的均匀稀释液.意义意义：判定食品被污染的程度预测食品耐存放的程度和期限 猪肉的细菌总数在500010000个g时沙门氏菌污染率为117，当在1000020000个g时，污染率为1914，而在50000100000个g时，污染率超过574 方法方法：倾注平板法。培养基一般加了显色剂培养基一般加了显色剂TTC, 使菌落呈红色使菌落呈红色25ml225ml,细菌细菌菌落总数测定菌落总数测定v规定为:食品检样经过处理，在一定条件下培养后，食品检样经过处理，在一定条件下培养后，1g 1g 、lmllml或或cmcm2 2食品检样中所含有的菌落数。（本食品检样中所含有的菌落数。（本方法只包括一群在方法只包括一群在营养琼脂营养琼脂上生长发育的上生长发育的嗜中温嗜中温性、需氧性、需氧的菌落总数。）的菌落总数。）报告： cfu/每单位样品量，如： cfu/ g、 cfu/ ml 、 cfu/ cm2 。(cfu ，colony forming unit) 注意：细菌菌落总数，不能说细菌总数大肠菌群(coliform group)概念：大肠菌群系指一群能在37、24h内发酵乳糖产酸产气，需氧或兼性厌氧的革兰阴性无芽孢杆菌。种类 ：总大肠菌群 、耐热大肠菌群（粪大肠菌群 ）大肠菌群的卫生学意义：是常规检测的卫生指示菌，饮用水、生活用水、各类产品（食品、药品、化妆品等）都要进行检测，推断检样中有无被肠道致病菌污染的可能。测定方法：多管发酵法、滤膜法、纸片法。大肠菌群检测：检测：37生长：培养于这个温度下24h内发酵乳糖产酸产气：培养基中加乳糖，24小时内观察是否产酸产气需氧或兼性厌氧：一般孵箱可革兰阴性无芽孢杆菌：革兰染色，光镜下观察测定方法：多管发酵法、滤膜法、纸片法。一般采用100克或100毫升食品中的最近似数(MPN，Maximun Probable Number )来表示（多管发酵法）。 MPN法利用统计学的方法对样品中的微生物计数。方法方法是把样品分成多个小份，根据小份样小份样品品待检微生物（大肠菌群）出现的阳性阳性情况来推断样品中的菌数。 37 24h 37 24hG-杆菌杆菌 ，无，无芽孢芽孢orpositive 37 24h多管发酵法多管发酵法:乳糖发酵试验分离培养证实试验出报告：根据阳性管数，查MPN检索表Fan hui致病菌检验致病菌检验q指肠道致病菌和致病性球菌（指肠道致病菌和致病性球菌（1111种），我种），我国规定国规定金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌、溶血性链球菌氏菌、溶血性链球菌进行常规检测。进行常规检测。q我国规定致病菌我国规定致病菌“不得检出不得检出”q1111种：种：沙门氏菌、志贺氏菌、变形杆菌、金黄沙门氏菌、志贺氏菌、变形杆菌、金黄色葡萄球菌、肉毒杆菌、副溶血性弧菌、致病色葡萄球菌、肉毒杆菌、副溶血性弧菌、致病性大肠杆菌、蜡样芽胞杆菌、溶血性链球菌、性大肠杆菌、蜡样芽胞杆菌、溶血性链球菌、李斯特菌李斯特菌 、弯曲菌等、弯曲菌等奶粉中金黄色葡萄球菌的检验样品样品25g+225ml灭菌生理盐水灭菌生理盐水5ml7.5%NaCl肉汤肉汤37BairdParker琼脂平板琼脂平板 37 24h涂片、染涂片、染色、镜检色、镜检观察菌观察菌落形态落形态生化试验生化试验甘露醇试验甘露醇试验血浆凝固酶试验血浆凝固酶试验24h报告结果报告结果制样制样增菌增菌鉴定鉴定分离分离霉菌和酵母菌计数霉菌和酵母菌计数倾注平板直接计数直接镜检计数法 郝氏计测玻片 （血球计数板）霉菌：显微镜按放大率90125倍调节标准视野，使其直径为1.382mm。观察视野 霉菌菌丝其长度超过标准视野(1.382mm)的1/6或三根菌丝总长度超过标准视野的1/6（即测微器的一格）时即为阳性（），否则为阴性（一）。 按100个视野计，其中发现有霉菌菌丝体存在的视野数，即为霉菌的视野百分数。 酵母菌：真菌的分类鉴定真菌的分类鉴定真菌的分类鉴定真菌的分类鉴定则主要是依据形态特征，包括繁殖器官的形态、构造、孢子形态、大小、颜色、表面特征、着生形态及数目等。粮食内部常见产毒霉菌的初步鉴定粮食内部常见产毒霉菌的初步鉴定1 1、酵母菌、酵母菌 yeastyeast 形态形态：多为圆形或卵圆形单细胞。有时出现大小细胞相连的假菌 丝。菌落菌落：与细菌相仿， 但较细菌菌落大、 较厚、外观较稠、 较不透明。颜色有乳白 色、矿烛色，少数红色， 个别黑色。真菌形态真菌形态：2、霉菌 mould形态形态：由菌丝和孢子组成。孢子为繁殖体。 菌落：菌落：菌落大，疏松，呈绒毛状、絮状、蜘蛛网状。菌丝和孢子产生不同色素，使菌落正反面呈现不同的颜色。 青霉青霉曲霉曲霉曲霉曲霉串珠镰刀菌串珠镰刀菌第二节 食品安全的HACCP质量控制体系HACCP的基本概念 HACCP体系的七项基本原理例子:HACCP的基本概念HACCP (hazard analysis and critical control point)即“危害分析与关键控制点”，是一个保证食品质量与安全的预防性管理系统。它运用食品加工、微生物学、质量控制和危险评价等有关原理和方法，对食品原料、加工工序以及最终食用产品等过程实际存在和潜在性的危害进行分析判定，找出对最终产品质量有影响的关键控制环节，并采取相应控制措施，使食品的危险性减少到最低限度，从而达到最终产品有较高安全性的目的。HACCP的起源20世纪60年代，美国的拜尔斯堡（Pillsbury）公司承担太空计划中宇航食品的开发任务。在开发过程中，研究人员认识到，基于传统的质量控制技术和最终产品检验的检查系统，在食品生产中并不能提供充分的安全措施来防止污染。为了尽可能减少风险，确保食品安全，他们不得不大量地对最终产品进行检测。这样除了费用昂贵以外，每生产一批食品的很大部分都必须用于检验，用于检验的产品越多，最终可提供的宇航食品就越少。为了解决这一问题，他们提出应该建立一个预防性体系，在生产系统中对生产全过程实施危害控制，从管理控制上来保证食品安全。因此，Pillsbury公司率先提出了HACCP概念（虽然当时不是这样命名的）。Pillsbury公司在正确使用这一预防性体系之后生产出了高度安全的食品。由于实施了HACCP管理，使得该公司除了对加工过程中的关键工序和环节进行监测之外，只需对少量的成品做检验就可以了。尽管当时的HACCP只有三个原理，但从那时起，Pillsbury的预防性体系作为食品安全控制的有效方法被广泛认可。 HACCP体系的七项基本原理 原理1：进行危害分析(hazard analysis, HA)并确定预防措施( preventive meas-ures)，危害分析与预防控制措施是HACCP原理的基础，也是建立HACCP计划的第一步，应根据所掌握的食品中存在的危害以及控制方法，结合工艺特点，进行详细的分析。原理2：确定关键控制点(critical control point, CCP)，即确定能够实施控制且可以通过正确的控制措施达到预防危害、消除危害或将危害降低到可接受水平的CCP,例如加热、冷藏、灭菌、特定的消毒程序等。原理3:确定CCP的关键控制限值(critical limit)，即指出与CCP相应的预防措施必须满足的要求，例如温度的高低、时间的长短、pH的范围以及盐浓度等。原理4:建立监控程序（monitoring)，即通过一系列有计划的观察和测定（例如温度、时间、pH值、水分等）活动来评估CCP是否在控制范围内，同时准确记录监控结果，以备用于将来核实或鉴定之用。原理5：建立纠正措施（corrective actions），如果监控结果表明加工过程失控，应立即采取适当的纠正措施，减少或消除失控所导致的潜在危害，使加工过程重新处于控制之中。原理6：建立有效的记录保存体系(record-keeping procedures)，监测记录应包括体系文件，HACCP体系的记录，HACCP小组的活动记录，HACCP前提条件的执行、监控、检查和纠正记录等。原理7：建立验证程序(verification procedures)，用来确定HACCP体系是否按照HACCP计划正确运转，或者计划是否需要修改，以及再被确认生效使用的方法、程序、检测及审核手段等。例子：HACCP在瓶装饮用水生产中的应用某市,瓶(桶)装水,由于部分企业在生产过程中缺乏有效的安全控制，卫生管理不到位，产品抽检合格率一直较低，在50 70之间徘徊，不合格的原因主要是微生物超标。市疾控于2005年5月开始在瓶装饮用水生产过程中进行危害分析关键控制点(HACCP)系统的试点应用，现报告如下。对象为了保证选择的试点企业具有代表性，在全面了解乐清市境内几十家瓶装饮用水生产企业基本情况的基础上，综合平衡，最终确定一家持有有效卫生许可证，已通过OS认证，中等生产规模的企业做为研究的试点。步骤按照WHOFAO食品法典委员会推荐的(HACCP原理及其应用准则和卫生部食品企业HACCP实施指南，结合瓶装饮用水生产实际建立和实施HACCFP体系。包括组建HACCP工作小组；进行产品描述并确定预期用途；绘制生产工艺流程图并现场验证；进行危害分析(原理一)； 确定关键控制点(原理二)； 确定每一个关键控制点的关键限值(原理三)；建立每个关键控制点的监控体系(原理四)；建立关键控制点偏离关键限值时的纠偏措施(原理五)；建立验证程序(原理六)；建立文件记录保持系统(原理七)方法过程水、成品水菌落总数和大肠菌群的测定参照GBT4789212003食品卫生微生物学检验冷冻饮品、饮料检验进行。灌装车间空气菌落总数测定参照GBT16294 1996医药工业洁净室(区)沉降菌的测试方法。瓶、瓶盖的细菌总数测定参照GBT1820422OOO公共场所茶具微生物检验方法细菌总数测定。结结 果：果：1 、瓶装饮用水生产工艺流程现场验证后的流程包括粗滤和超滤：浅层地下水经粗滤和超滤主要去除悬浮颗粒及大直径微生物；活性碳吸附：主要吸附异味及部分有机物； 臭氧消毒：合理掌握水流速和臭氧流量就可以达到灭菌的目的；CIP管路消毒清洗：CIP(clean in place)即原位清洗，通过洗涤、消毒液和水的循环冲洗，去除密闭的设备和管路中的杂质和微生物 ；瓶和瓶盖的清洗消毒：用二氧化氯消毒液浸泡消毒后，臭氧水冲洗； 灌装与旋盖：灌装和旋盖均在全自动灌装车间完成。灌装车间为万级净化车间，灌装局部达到百级。2 、危害分析根据工艺流程图，评估在生产过程中所用的原料、产品加工的每一步骤所用的设备、清洗消毒剂、终产品及储存和销售方式等可能出现的潜在危害，对每一个危害发生的可能性及其严重程度进行评价，最终确定出对终产品的安全性有重要意义的危害因素。我市瓶装饮用水的主要危害因素是微生物，产生的原因是各生产环节的污染及消毒不彻底等。3 建立HACCP工作计划在危害分析的基础上，按照“关键控制点决定树”方法中关键控制点的确定原则和思路，查阅有关文献、资料，结合危害分析的结果，确定瓶装饮用水生产的关键控制点和关键控制限值 ，引。同时通过制定关键限值监控体系、纠偏措施、验证程序和文字记录系统，建立起HACCP工作计划，见表1，并按此计划在瓶装饮用水生产中实施应用HACCP。4 关键控制点的验证为了获得评价HACCP系统的运行和应用效果的客观数据，需要有针对性的对该企业实施HACCP管理前后各生产环节的相关指标进行监测，以证明关键控制点的监控效果。该企业既往产品检测报告中不合格项目绝大多数是菌落总数超标，没有致病菌、霉菌和酵母菌不合格，因此监测指标中未涉及这些项目。检测结果见表2。臭氧杀菌后水、灌装水、瓶、盖、灌装间空气的菌落总数在实施HACCP前后有统计学意义(总体方差不齐两小样本近似t检验，P均小于OO1)。对4个关键控制点采取有效的预防措施，并按HACCP计划工作表运行监控体系、纠偏后，能有效地降低或消除上述生产环节的微生物提高了瓶装饮用水的安全5 HACCP系统的验证在实施HACCP管理体系3个月后，由HACCP工作小组不定期对10个批次的瓶装饮用水进行了随机抽检。结果微生物和各项理化指标均符合瓶(桶)装饮用水卫生标准(GB192982003)，抽检合格率100。其中菌落总数在010efimL之间，远远低于标准规定的菌落总数50efumL。通过验证，结果表明该企业的HACCP管理体系运行良好。讨论通过试点研究，了解了瓶装饮用水生产的一般工艺流程I在对生产过程进行危害分析的基础上，确定了臭氧消毒、CIP管路消毒、瓶和盖消毒、灌装环境为关键控制点，建立和实施了HACCP体系，其他瓶(桶) 装饮用水企业可参考本研究建立HACCP系统。对关键控制点采取预防、纠偏措施后，各生产环节的微生物可消除或降低至可接受水平。本次研究中各环节臭氧杀菌后水、灌装水、瓶、盖、灌装间空气的菌落总数在实施HACCP管理前后有统计学意义(P001)，试点企业实施HACCP管理后产品质量100符合国家标准。因此我们认为瓶装饮用水生产企业在建立健全各项规章制度基础上，实施HACCP管理，能有效控制瓶装饮用水生产过程中的危害，是保证饮用水卫生质量的最好方法。