实验三实验三琼脂糖凝胶电泳技术的琼脂糖凝胶电泳技术的原理和方法原理和方法主主讲教教师和和实验员：张运峰运峰一一实验目的实验目的n学学习琼脂糖凝胶脂糖凝胶电泳分离泳分离DNA的原理和方法的原理和方法n检测碱裂解法提取碱裂解法提取质粒的粒的结果果n检测双双酶切法切法鉴定重定重组质粒的粒的结果果（后（后续实验）n检测PCR法法鉴定定质粒的粒的结果果（后（后续实验）二二实验原理实验原理（1 1）某物）某物质在在电场作用下的迁移速度叫做作用下的迁移速度叫做电泳的速率，泳的速率，电泳的速率与泳的速率与核酸分子大小和构型有关。核酸分子大小和构型有关。 DNA DNA分子在碱性分子在碱性缓冲液中冲液中带负电荷，在外加荷，在外加电场作用下向正极泳作用下向正极泳动。分子分子质量越小跑得越快，量越小跑得越快，紧密构型快于松散型开密构型快于松散型开环分子或分子或线性分子，从性分子，从而可以分离大小不同的而可以分离大小不同的DNADNA或或RNARNA分子。分子。（2 2）琼脂糖是一种脂糖是一种线性多糖聚合物性多糖聚合物，可以形成具有，可以形成具有刚性的性的滤孔，凝胶孔，凝胶孔径的大小决定于孔径的大小决定于琼脂糖的脂糖的浓度度。浓度越高，孔隙越小，其分辨能力度越高，孔隙越小，其分辨能力就越就越强。琼脂糖浓度琼脂糖浓度(%)(%)线型线型DNADNA分子的分离范围分子的分离范围(Kb)(Kb)0.30.35 560600.60.61 120200.70.70.80.810100.90.90.50.57 71.21.20.90.96 61.51.50.20.23 312.012.00.10.12 2 配制多大配制多大浓度的度的琼脂糖凝胶，要根据被脂糖凝胶，要根据被检的的DNADNA分子大小来确定。分子大小来确定。琼脂糖是一种脂糖是一种线性多糖聚合物。性多糖聚合物。浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。（3 3）溴化乙）溴化乙锭为扁平状分子，在紫外光照射下扁平状分子，在紫外光照射下发射射荧光。光。EBEB可与可与DNADNA分子形成分子形成EB-DNAEB-DNA复合物，其复合物，其荧光光强度与度与DNADNA的含量成正比。据此可判断的含量成正比。据此可判断DNADNA分子量大小和粗分子量大小和粗略估略估计样品品DNADNA浓度度。 表表1 1 琼脂糖凝胶的脂糖凝胶的浓度与度与DNADNA分子大小的关系分子大小的关系三 仪器、材料与试剂1.1.质粒粒样品、品、酶切切样品和品和PCRPCR样品。品。 2.2.凝胶凝胶电泳系泳系统和和电泳泳图像分析系像分析系统( (凝胶成像系凝胶成像系统) )等。等。 3.3.琼脂糖、脂糖、 1XT 1XTAE电泳泳缓冲液、冲液、GoldviewGoldview、 6X 6X载样缓冲冲液液 （ 6X loading buffer 6X loading buffer）和）和DNADNA分子量分子量标准准（Marker Marker ）等。）等。1.1.凝胶电泳系统凝胶电泳系统DYY-6CDYY-6C型型 双双稳定定时电泳泳仪电源（北源（北京六一）京六一） 输出范围（显示分辨率）：6-600V(1V) 4-400mA(1mA)240W美国美国Bio-radBio-rad伯伯乐 小型水平小型水平电泳槽泳槽Mini-Sub Mini-Sub Cell GT Cell Cell GT Cell 2.凝胶成像分析系统凝胶成像分析系统3.Marker3.Marker一一个个已已知知分分子子质量量的的DNADNA样品品做做最最对照照，用用来来确确定定待待测样品的相品的相对分子分子质量。量。4.4.常用电泳缓冲液常用电泳缓冲液缓冲液缓冲液缓冲容量缓冲容量迁移速度迁移速度分辨率分辨率用途用途TAETAE最低最低最快最快( (高高1010) )高分子量高高分子量高高度复杂高度复杂DNADNA混混合物；超螺旋合物；超螺旋DNADNATBETBE很高很高较慢较慢低分子量高低分子量高价格昂贵，不常价格昂贵，不常用用TPETPE 电泳指示泳指示剂溴酚溴酚兰在碱性液体中呈紫在碱性液体中呈紫兰色，一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖色，一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400400组成上成上样缓冲液。冲液。作用：作用：增加增加样品比重，以确保品比重，以确保DNADNA均匀沉入加均匀沉入加样孔内。孔内。形成肉眼可形成肉眼可见的指示的指示带，预测核酸核酸电泳的速度和位置。泳的速度和位置。使使样品呈色，使加品呈色，使加样操作更方便。操作更方便。5.上样缓冲液上样缓冲液4.4.常用核酸染料常用核酸染料名称名称优点优点缺点缺点 EB （溴化乙锭）（溴化乙锭）染色操作简便，快速，室温下染色操作简便，快速，室温下15-2015-20minmin；不会使核酸断裂；不会使核酸断裂；灵敏度高，灵敏度高，1010ngng或更少的或更少的DNADNA即可检出；可以加到样品中或即可检出；可以加到样品中或胶中。胶中。 EB EB是诱变剂，使用时是诱变剂，使用时一定要戴手套。一定要戴手套。 EBEB废废液要经过处理才能丢弃。液要经过处理才能丢弃。Gldview 低毒，灵敏度较高的染料；低毒，灵敏度较高的染料；可以加入样品中。可以加入样品中。dsDNAdsDNA呈现呈现绿色荧光绿色荧光, ,而而ssDNAssDNA呈红色荧光呈红色荧光, ,能较好地区分能较好地区分dsDNAdsDNA与与ssDNAssDNA。 价格稍高，灵敏度价格稍高，灵敏度 较较低。背景强烈。低。背景强烈。SYBR新型低毒，高灵敏度染料，可新型低毒，高灵敏度染料，可以加入样品中。以加入样品中。 价格昂贵。对小于价格昂贵。对小于50 bp染色缺失，小于染色缺失，小于100的染色效果较差。稳定的染色效果较差。稳定性差性差GenefinderGenefinder 花青类染料花青类染料,毒性很低；最大吸收毒性很低；最大吸收峰为峰为 470nm。具有安全、灵敏、。具有安全、灵敏、经济的特点经济的特点 重复性较差。能引起重复性较差。能引起有机体突变。有机体突变。溴化乙锭 溴溴化化乙乙锭（ 3 3，8-8-二二氨氨基基-5-5-乙乙基基-6-6-苯苯基基菲菲啶溴溴盐EBEB），EBEB染染色色（EBEB可可很很好好地地掺入入到到双双链DNADNA中中），在在紫紫外外光光下下会会发出出橙橙红色色的的荧光光，用用于于对DNADNA进行染色和行染色和观察。察。 用用于于观察察的的紫紫外外光光有有种种波波 长 ， 一一 般般 使使 用用 中中 波波 紫紫 外外 光光（302nm302nm）。短短波波紫紫外外光光（254nm254nm）观察察效效果果较好好，但但对DNADNA的的破破环很很大大。长波紫外光（波紫外光（366nm366nm）：回收。）：回收。1.1.制备琼脂糖凝制备琼脂糖凝胶（胶（1%1%）2.2.制备凝胶板制备凝胶板3.3.加样加样4.4.电泳电泳 5.5.染色染色6.6.结果观察结果观察 四四. .实验步步骤1.制制备凝胶和胶板凝胶和胶板： 20ml(120ml(1TAE)+0.2gTAE)+0.2g琼脂糖（脂糖（ 三角瓶三角瓶 ），煮胶，溶解，冷），煮胶，溶解，冷却至却至60(60(不不烫手手) )，倒板，室温下充分凝固，倒板，室温下充分凝固，竖直拔下梳子直拔下梳子 。胶板设计（胶板设计（27人）：人）：每11孔胶板（4人：2样品+1marker）。5l质质粒粒DNA+1l loading buffer 混匀；混匀；15lPCR产产 物物 +3l loading buffer，混匀；，混匀；10l酶酶 切切 产产 物物 +2l load- ingbuffer混匀；混匀；5l DNA Marker(每板胶一孔每板胶一孔）2.加样加样3.电泳电泳电压电压3-5V/cm，约，约80-90V，注意电极方向，注意电极方向4.观察观察紫外透射分析仪下观察。紫外透射分析仪下观察。六 实验结果 琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质中性物质，不带电荷。琼脂糖链依分子内，不带电荷。琼脂糖链依分子内和分子间氢键及其它力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型凝胶。和分子间氢键及其它力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型凝胶。 琼脂糖凝胶结构形成过程琼脂糖凝胶结构形成过程 琼脂糖单糖分子结构琼脂糖单糖分子结构 琼脂糖粉形成琼脂糖凝胶的过程琼脂糖粉形成琼脂糖凝胶的过程 DNA DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNADNA分子在高于等分子在高于等电点的电点的pHpH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。在一定的电场强度下，溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。在一定的电场强度下，DNADNA分子分子的迁移速度取决于分子筛效应，即的迁移速度取决于分子筛效应，即DNADNA分子本身的大小和构型。当分子本身的大小和构型。当DNADNA分子大小超分子大小超过过20kb20kb时，普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开，此时电泳的迁移率不再依赖于分时，普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开，此时电泳的迁移率不再依赖于分子大小，因此，应用琼脂糖凝胶电泳分离子大小，因此，应用琼脂糖凝胶电泳分离DNADNA时，分子大小不宜超过此值。时，分子大小不宜超过此值。 核酸分子大小及琼脂糖的浓度的关系核酸分子大小及琼脂糖的浓度的关系谢谢 谢！谢！ 放映结束 感谢各位的批评指导！让我们共同进步