http:/www.shsmu.edu.cn/李莉李莉聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 Polyacrylamide Gel Electrophoresis Polyacrylamide Gel Electrophoresis ，PAGEPAGE上海交通大学医学院上海交通大学医学院 小小 结结1.1.掌握（不连续）掌握（不连续）PAGEPAGE的原理的原理2.2.掌握影响掌握影响PAGEPAGE迁移率的因素迁移率的因素3.3.掌握掌握PAGEPAGE的操作注意点、试剂作用的操作注意点、试剂作用4.4.熟悉熟悉PAGPAG的聚合的聚合上海交通大学医学院上海交通大学医学院思思 考考 题题名词解释名词解释1.1.凝胶总浓度凝胶总浓度2.2.交联度交联度问答题问答题1.1.与与CAMECAME相比，相比，PAGEPAGE有哪些特点。有哪些特点。2.2.试比较试比较CAMECAME与与PAGEPAGE操作的区别。操作的区别。3.3.简述不连续简述不连续PAGEPAGE的原理。的原理。上海交通大学医学院上海交通大学医学院讲课内容讲课内容PAGPAG的组成的组成1PAGPAG的聚合的聚合 2PAG的浓度与孔径的关系的浓度与孔径的关系3不连续不连续PAGEPAGE4PAGEPAGE的特点的特点5上海交通大学医学院上海交通大学医学院 一、一、PAG PAG 的的 组成组成 PAGPAGPAGPAG是是是是由由由由丙丙丙丙烯烯烯烯酰酰酰酰胺胺胺胺（acrylamideacrylamideacrylamideacrylamide，AcrAcrAcrAcr）单单单单体体体体和和和和N N N N， N N N N - - - -亚亚亚亚 甲甲甲甲 双双双双 丙丙丙丙 烯烯烯烯 酰酰酰酰 胺胺胺胺 （ N N N N， N N N N， N N N N ， N N N N - - - -methylene methylene methylene methylene bisacrylamidebisacrylamidebisacrylamidebisacrylamide，BisBisBisBis）交交交交联联联联剂剂剂剂通通通通过过过过自自自自由由由由基基基基（ free free free free radicalsradicalsradicalsradicals）聚聚聚聚合合合合而而而而成成成成的的的的一一一一种种种种多多多多孔孔孔孔三三三三维维维维网网网网状结构。状结构。状结构。状结构。Acr + Bis-Acr + Bis- porous matrix porous matrix 上海交通大学医学院上海交通大学医学院v（1 1）丙烯酰胺）丙烯酰胺（acrylamideacrylamide，AcrAcr）结构式结构式上海交通大学医学院上海交通大学医学院（2 2）亚甲双丙烯酰胺）亚甲双丙烯酰胺（N N N N，N N N N，N N N N ，N N N N -methylene bisacrylamide-methylene bisacrylamide-methylene bisacrylamide-methylene bisacrylamide，BisBisBisBis）上海交通大学医学院上海交通大学医学院上海交通大学医学院上海交通大学医学院讲课内容讲课内容PAGPAG的组成的组成1PAGPAG的聚合的聚合 2PAG的浓度与孔径的关系的浓度与孔径的关系3不连续不连续PAGEPAGE4PAGEPAGE的特点的特点5上海交通大学医学院上海交通大学医学院 二、二、PAGPAG的聚合的聚合polymerizationpolymerization of PAG 需要催化剂需要催化剂( (catalyzer)catalyzer)氧化还原系氧化还原系统作用，使统作用，使AcrAcr单体带有游离基单体带有游离基(Free (Free radicals )radicals )，从而与，从而与BisBis进行聚合进行聚合 上海交通大学医学院上海交通大学医学院 （一）化学聚合：（一）化学聚合：AP-TEMED系统系统 过硫酸胺过硫酸胺过硫酸胺过硫酸胺(NHNHNHNH4 4 4 4) ) ) )2 2 2 2S S S S2 2 2 2O O O O8 8 8 8 （Ammonium Ammonium Ammonium Ammonium persulfatepersulfatepersulfatepersulfate，APAPAPAP）作为作为作为作为催化剂催化剂催化剂催化剂，四甲基乙二胺，四甲基乙二胺，四甲基乙二胺，四甲基乙二胺（-N,N,N,N-N,N,N,N-N,N,N,N-N,N,N,N-tetramethylethylene tetramethylethylene tetramethylethylene tetramethylethylene diamine , TEMEDdiamine , TEMEDdiamine , TEMEDdiamine , TEMED）为为为为加加加加速剂速剂速剂速剂。 上海交通大学医学院上海交通大学医学院 APAP在在水水溶溶液液中中能能产产生生游游离离基基SOSO4 42-.2-.，使使丙丙烯烯酰酰胺胺单单体体的的双双键键打打开开，活活化化形形成成自自由由基基丙丙烯烯酰酰胺胺，然然后后游游离离AcrAcr和和BisBis作作用用就就能能聚聚合合形形成凝胶成凝胶TEMEDTEMED的游离碱基能促进的游离碱基能促进APAP形成形成SOSO4 42-. 2-. 注意：注意：注意：注意： TEMEDTEMEDTEMEDTEMED量量量量多多多多少少少少都都都都会会会会影影影影响响响响催催催催化化化化作作作作用用用用，须须须须在在在在碱碱碱碱性性性性条条条条件下聚合件下聚合件下聚合件下聚合 分分分分子子子子氧氧氧氧存存存存在在在在，聚聚聚聚合合合合不不不不完完完完全全全全，须须须须去去去去除除除除分分分分子子子子氧氧氧氧，隔隔隔隔绝氧绝氧绝氧绝氧 升高温度能提高聚合，降低温度能延迟聚合升高温度能提高聚合，降低温度能延迟聚合升高温度能提高聚合，降低温度能延迟聚合升高温度能提高聚合，降低温度能延迟聚合上海交通大学医学院上海交通大学医学院 （二）光聚合：核黄素（二）光聚合：核黄素- -TEMEDTEMED系统系统 有有有有痕痕痕痕迹迹迹迹氧氧氧氧存存存存在在在在下下下下，核核核核黄黄黄黄素素素素（riboflavinriboflavinriboflavinriboflavin）在在在在光光光光照照照照下下下下（可可可可见见见见光光光光或或或或紫紫紫紫外外外外光光光光）分分分分解解解解，其其其其黄黄黄黄素素素素部部部部分分分分被被被被还还还还原原原原成成成成无无无无色色色色型型型型，但但但但在在在在有有有有氧氧氧氧条条条条件件件件下下下下无无无无色色色色型型型型又又又又被被被被氧氧氧氧化化化化成成成成带带带带有有有有游离基的黄素，其也能使游离基的黄素，其也能使游离基的黄素，其也能使游离基的黄素，其也能使AcrAcrAcrAcr和和和和BisBisBisBis聚合形成凝胶。聚合形成凝胶。聚合形成凝胶。聚合形成凝胶。注意：注意：注意：注意： 分分分分离离离离胶胶胶胶的的的的合合合合成成成成一一一一般般般般采采采采用用用用化化化化学学学学聚聚聚聚合合合合。因因因因为为为为若若若若用用用用光光光光聚聚聚聚合合合合，凝凝凝凝胶胶胶胶的的的的孔孔孔孔径径径径受受受受光光光光照照照照强强强强度度度度与与与与时时时时间间间间的的的的影影影影响响响响，导导导导致致致致孔径大小不同，从而影响蛋白质的分离。孔径大小不同，从而影响蛋白质的分离。孔径大小不同，从而影响蛋白质的分离。孔径大小不同，从而影响蛋白质的分离。上海交通大学医学院上海交通大学医学院讲课内容讲课内容PAGPAG的组成的组成1PAGPAG的聚合的聚合 2PAG的浓度与孔径的关系的浓度与孔径的关系3不连续不连续PAGEPAGE4PAGEPAGE的特点的特点5上海交通大学医学院上海交通大学医学院 三、三、PAGPAG的浓度与孔径的关系的浓度与孔径的关系 the the initial initial concentrations concentrations of of acrylamide acrylamide and and BIS BIS control control the the hardness hardness and and degree degree of of crosslinking of the gel.crosslinking of the gel. PAGPAGPAGPAG孔孔孔孔径径径径的的的的大大大大小小小小主主主主要要要要由由由由AcrAcrAcrAcr和和和和BisBisBisBis这这这这两两两两种种种种物物物物质质质质的的的的浓浓浓浓度度度度决决决决定定定定。可可可可以以以以根根根根据据据据要要要要分分分分离离离离物物物物质质质质分分分分子子子子的的的的大大大大小小小小，选选选选择择择择合合合合适的单体浓度。适的单体浓度。适的单体浓度。适的单体浓度。Acr/BisAcr/BisAcr/BisAcr/Bis：20202020 40 40 40 40 完全透明且有弹性完全透明且有弹性完全透明且有弹性完全透明且有弹性 10 10 10 10 很脆，易碎，不透明很脆，易碎，不透明很脆，易碎，不透明很脆，易碎，不透明 100 100 100 100 糊状不成形，易破碎糊状不成形，易破碎糊状不成形，易破碎糊状不成形，易破碎上海交通大学医学院上海交通大学医学院凝胶总浓度凝胶总浓度T T100ml100ml凝胶溶液中含有凝胶溶液中含有AcrAcr和和 Bis Bis的总克数。的总克数。T=T=（a+ba+b）/m/m100%100%T T越大，凝胶孔径越小，适用于分离分子量较小越大，凝胶孔径越小，适用于分离分子量较小的物质。的物质。T T越小，凝胶孔径越大，适用于分离分子量较大越小，凝胶孔径越大，适用于分离分子量较大的物质。的物质。 上海交通大学医学院上海交通大学医学院交联度交联度C CBisBis占单体与交联剂总量的百分比。占单体与交联剂总量的百分比。C=b/C=b/（a+ba+b）100%100%当当T T固定时，固定时，BisBis浓度在浓度在5%5%时孔径最小。时孔径最小。上海交通大学医学院上海交通大学医学院讲课内容讲课内容PAGPAG的组成的组成1PAGPAG的聚合的聚合 2PAG的浓度与孔径的关系的浓度与孔径的关系3不连续不连续PAGEPAGE4PAGEPAGE的特点的特点5上海交通大学医学院上海交通大学医学院 四、不四、不 连连 续续 PAGEPAGE(Discontinuous PAGE)(Discontinuous PAGE) 按具体操作分按具体操作分 垂直板形电泳垂直板形电泳 圆盘电泳圆盘电泳按凝胶系统的均匀性分按凝胶系统的均匀性分 continuous PAGE discontinuous PAGE 上海交通大学医学院上海交通大学医学院Schematic of discontinous electrophoresis technique上海交通大学医学院上海交通大学医学院 Disc-PAGE Disc-PAGE 成分成分成分成分 作用作用作用作用样品样品样品样品胶胶胶胶 T=3% C=20%T=3% C=20%T=3% C=20%T=3% C=20%单体单体单体单体欲分离的样品溶液欲分离的样品溶液欲分离的样品溶液欲分离的样品溶液pH6.7 Tris-HClpH6.7 Tris-HClpH6.7 Tris-HClpH6.7 Tris-HCl缓冲液缓冲液缓冲液缓冲液混在一起，用光聚合方法聚混在一起，用光聚合方法聚混在一起，用光聚合方法聚混在一起，用光聚合方法聚合而成的大孔凝胶合而成的大孔凝胶合而成的大孔凝胶合而成的大孔凝胶有防对流作用有防对流作用有防对流作用有防对流作用 电极槽缓冲液通常为电极槽缓冲液通常为pH8.3 Tris-pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液甘氨酸缓冲液上海交通大学医学院上海交通大学医学院 Disc-PAGEDisc-PAGE成分成分成分成分 作用作用作用作用浓浓浓浓 缩缩缩缩胶胶胶胶除除除除不不不不加加加加样样样样品品品品外外外外，其其其其余余余余组组组组成成成成成成成成分同样品胶相同分同样品胶相同分同样品胶相同分同样品胶相同样品在此胶中样品在此胶中样品在此胶中样品在此胶中被浓缩被浓缩被浓缩被浓缩 上海交通大学医学院上海交通大学医学院 Disc-PAGEDisc-PAGE成分成分成分成分 作用作用作用作用分离分离分离分离胶胶胶胶 T=7%C=2.5%T=7%C=2.5%T=7%C=2.5%T=7%C=2.5%单体溶液单体溶液单体溶液单体溶液pH8.9 Tris-HClpH8.9 Tris-HClpH8.9 Tris-HClpH8.9 Tris-HCl缓冲液缓冲液缓冲液缓冲液化学聚合法聚合成小孔胶化学聚合法聚合成小孔胶化学聚合法聚合成小孔胶化学聚合法聚合成小孔胶主要的电泳分主要的电泳分主要的电泳分主要的电泳分离部分离部分离部分离部分 上海交通大学医学院上海交通大学医学院 分分 离离 原原 理理1. 1. 浓缩效应浓缩效应1 1）凝胶层的不连续性）凝胶层的不连续性 两层凝胶两层凝胶T T与与C C不同不同孔径不同孔径不同 浓缩胶孔径大，分离胶孔径小，蛋白质在大浓缩胶孔径大，分离胶孔径小，蛋白质在大孔径浓缩胶中移动，受阻力小，移动速度快。孔径浓缩胶中移动，受阻力小，移动速度快。 上海交通大学医学院上海交通大学医学院 2 2）缓冲液离子成分的不连续性）缓冲液离子成分的不连续性甘氨酸甘氨酸（pI=6.0pI=6.0）在在pH8.3pH8.3带负电，朝正极移带负电，朝正极移动，进入浓缩胶（动，进入浓缩胶（pH6.7pH6.7），），甘氨酸解离度甘氨酸解离度（ ）很小，有效迁移率（）很小，有效迁移率（M M ）很低，移很低，移动速度较慢，称为动速度较慢，称为慢离子慢离子。HClHCl 是强电解质，是强电解质， =1=1，ClCl- -有效迁移率大，有效迁移率大，移动速度快，称移动速度快，称快离子快离子。蛋白质蛋白质（pIpI6.06.0）带负电荷，带负电荷，有效迁移率介有效迁移率介于两者之间。于两者之间。 上海交通大学医学院上海交通大学医学院pH8.3 Tris-Glycine bufferpH8.3 Tris-Glycine buffer甘氨酸甘氨酸甘氨酸甘氨酸HClHClHClHCl蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质样品胶样品胶浓缩胶浓缩胶分离胶分离胶样品样品样品样品低低电电导导区区上海交通大学医学院上海交通大学医学院 3 3）pHpH值的不连续性值的不连续性 为为了了控控制制慢慢离离子子的的解解离离度度，从从而而控控制制其其有有效效迁迁移移率率，必必须须使使浓浓缩缩胶胶与与分分离离胶胶之之间间pHpH值有所区别。值有所区别。上海交通大学医学院上海交通大学医学院 3.3.分子筛效应与电荷效应分子筛效应与电荷效应 进入分离胶后，进入分离胶后，GlyGly- -成为快离子成为快离子 分分离离胶胶只只有有电电荷荷效效应应和和分分子子筛筛效效应应，根根据据各各蛋蛋白白质质所所带带电电荷荷不不同同、分分子子大大小小不不同同而而分离分离上海交通大学医学院上海交通大学医学院上海交通大学医学院上海交通大学医学院上海交通大学医学院上海交通大学医学院Loadasampleintoapolyacrylamidegelelectrophoresiswell上海交通大学医学院上海交通大学医学院上海交通大学医学院上海交通大学医学院上海交通大学医学院上海交通大学医学院讲课内容讲课内容PAGPAG的组成的组成1PAGPAG的聚合的聚合 2PAG的浓度与孔径的关系的浓度与孔径的关系3不连续不连续PAGEPAGE4PAGEPAGE的特点的特点5上海交通大学医学院上海交通大学医学院 五、五、PAGE PAGE 的的 特特 点点1.1.1.1.具有分子筛效应，分辨率高具有分子筛效应，分辨率高具有分子筛效应，分辨率高具有分子筛效应，分辨率高2.2.2.2.样品不易扩散，用量少，灵敏度可达样品不易扩散，用量少，灵敏度可达样品不易扩散，用量少，灵敏度可达样品不易扩散，用量少，灵敏度可达10101010-6-6-6-6g g g g3.3.3.3.化学性质稳定，分子结构中富含酰胺基具有稳定的化学性质稳定，分子结构中富含酰胺基具有稳定的化学性质稳定，分子结构中富含酰胺基具有稳定的化学性质稳定，分子结构中富含酰胺基具有稳定的亲水基团亲水基团亲水基团亲水基团4.4.4.4.凝胶不带电荷，消除了电渗现象凝胶不带电荷，消除了电渗现象凝胶不带电荷，消除了电渗现象凝胶不带电荷，消除了电渗现象5.5.5.5.机械强度好，有弹性，在一定浓度范围内无色透明机械强度好，有弹性，在一定浓度范围内无色透明机械强度好，有弹性，在一定浓度范围内无色透明机械强度好，有弹性，在一定浓度范围内无色透明6.6.6.6.网孔可调节网孔可调节网孔可调节网孔可调节 上海交通大学医学院上海交通大学医学院 小小 结结1.1.掌握（不连续）掌握（不连续）PAGEPAGE的原理的原理2.2.掌握影响掌握影响PAGEPAGE迁移率的因素迁移率的因素3.3.掌握掌握PAGEPAGE的操作注意点、试剂作用的操作注意点、试剂作用4.4.熟悉熟悉PAGPAG的聚合的聚合上海交通大学医学院上海交通大学医学院思思 考考 题题名词解释名词解释1.1.凝胶总浓度凝胶总浓度2.2.交联度交联度问答题问答题1.1.与与CAMECAME相比，相比，PAGEPAGE有哪些特点。有哪些特点。2.2.试比较试比较CAMECAME与与PAGEPAGE操作的区别。操作的区别。3.3.简述不连续简述不连续PAGEPAGE的原理。的原理。