实验四实验四 白细胞计数、网织红细胞计数及血沉测定白细胞计数、网织红细胞计数及血沉测定目的目的 1掌握显微镜白细胞计数的方法。掌握显微镜白细胞计数的方法。 2掌握网织红细胞手工计数的方法。掌握网织红细胞手工计数的方法。 3血沉测定（示教）。血沉测定（示教）。实验四福医大白细胞计数网织红细胞计数血沉一、显微镜白细胞计数（临检指导一、显微镜白细胞计数（临检指导P32） 1. 概述概述 人外周血白细胞人外周血白细胞 单核细胞单核细胞 白细胞白细胞 淋巴细胞淋巴细胞 中性分叶核粒细胞中性分叶核粒细胞 粒细胞粒细胞 中性杆状核粒细胞中性杆状核粒细胞 嗜酸性粒细胞嗜酸性粒细胞 嗜碱性粒细胞嗜碱性粒细胞实验四福医大白细胞计数网织红细胞计数血沉一、显微镜白细胞计数一、显微镜白细胞计数2原理原理 用用白细胞计数稀释液白细胞计数稀释液（2%冰醋酸加入冰醋酸加入1%美美蓝或结晶紫数滴）蓝或结晶紫数滴）0.38ml，将，将血液（血液（20l）稀释稀释20倍，在倍，在破坏成熟红细胞的同时固定白细胞，破坏成熟红细胞的同时固定白细胞，后充入后充入改良牛鲍计数板，在改良牛鲍计数板，在低倍镜低倍镜下计数下计数四角四角4个大方格个大方格内的白细胞数，经换算求得每升血液中白细胞数。内的白细胞数，经换算求得每升血液中白细胞数。实验四福医大白细胞计数网织红细胞计数血沉一、显微镜白细胞计数一、显微镜白细胞计数 3.操作步骤操作步骤 （1）加稀释液）加稀释液 ：白细胞稀释液白细胞稀释液0.38ml（2）稀释血液：）稀释血液：末梢采血末梢采血20l，加入稀释液中混匀，加入稀释液中混匀（3）溶血）溶血 ：混匀后静置，待液体变为棕褐色混匀后静置，待液体变为棕褐色（4）充池：同红细胞计数）充池：同红细胞计数 （5）计数：）计数：低倍镜低倍镜下计数下计数四角四角4个大方格内个大方格内白细胞总数。白细胞总数。 实验四福医大白细胞计数网织红细胞计数血沉实验四福医大白细胞计数网织红细胞计数血沉一、显微镜白细胞计数一、显微镜白细胞计数4.计算计算WBC=N/41020106=N/20109/L5.参考值参考值 成人：成人： （410）109/L 初生儿：初生儿： （1520）109/L 6月月2岁：岁： （1112）109/L实验四福医大白细胞计数网织红细胞计数血沉 6.注意事项注意事项 （1）器材：微量吸管及牛鲍计数板的校正）器材：微量吸管及牛鲍计数板的校正（2）标本采集和稀释应准确）标本采集和稀释应准确（3）加盖玻片方式：）加盖玻片方式： WHO推荐推荐“推式推式”法法 （4）充液的影响：同红细胞计数）充液的影响：同红细胞计数 （5）计数原则）计数原则 一、显微镜白细胞计数一、显微镜白细胞计数实验四福医大白细胞计数网织红细胞计数血沉（6）计数室内的细胞分布要均匀：）计数室内的细胞分布要均匀：各大方格间细胞各大方格间细胞 数相差不超过数相差不超过10%，否则应重新重池。，否则应重新重池。（7）调整计数白细胞的数量或稀释倍数）调整计数白细胞的数量或稀释倍数:细胞数量过细胞数量过 少，可扩大计数域少，可扩大计数域(计计8或或9个大方格个大方格)或加大取或加大取 血量；细胞数量过多，可增加稀释液至血量；细胞数量过多，可增加稀释液至0.79ml 或仅加血或仅加血10l。（8）去除有核红细胞的影响）去除有核红细胞的影响 ： 实际白细胞数实际白细胞数/L=100校正前白细胞数校正前白细胞数/ （100+有核红细胞）有核红细胞）实验四福医大白细胞计数网织红细胞计数血沉 7.方法学评价方法学评价 显微镜计数法是显微镜计数法是传统的白细胞计数法，传统的白细胞计数法，并可用并可用 于于校准血细胞分析仪校准血细胞分析仪，但其，但其精密度和重复性欠佳精密度和重复性欠佳。 用于校准血液分析仪时应在严格规范的条件下进行。用于校准血液分析仪时应在严格规范的条件下进行。 而校准的血液分析仪在严格规范的条件下，精密度和而校准的血液分析仪在严格规范的条件下，精密度和 准确性较高。准确性较高。一一、显微镜白细胞计数显微镜白细胞计数实验四福医大白细胞计数网织红细胞计数血沉 血液分析仪检测速度快，适合大规模健康人群血液分析仪检测速度快，适合大规模健康人群普查，但需特殊仪器，当某些人为或病理情况（如普查，但需特殊仪器，当某些人为或病理情况（如外周血有核红细胞、巨大血小板和血小板凝集等）外周血有核红细胞、巨大血小板和血小板凝集等）可干扰白细胞计数。可干扰白细胞计数。实验四福医大白细胞计数网织红细胞计数血沉一、一、显微镜白细胞计数显微镜白细胞计数8.临床意义临床意义 白细胞在生理或病理情况下均可有差异。多数白细胞在生理或病理情况下均可有差异。多数与中性粒细胞数量变化一致。与中性粒细胞数量变化一致。实验四福医大白细胞计数网织红细胞计数血沉二二、网织红细胞计数（临检指导网织红细胞计数（临检指导P26）1.原理原理 网织红细胞（网织红细胞（Ret）是晚幼红细胞脱核后到完全成熟的）是晚幼红细胞脱核后到完全成熟的红细胞间的过渡细胞。其胞质中残存核糖核酸等嗜碱性物红细胞间的过渡细胞。其胞质中残存核糖核酸等嗜碱性物质，故经煌焦油蓝质，故经煌焦油蓝/新亚甲蓝染液活体染色后，可见有蓝绿新亚甲蓝染液活体染色后，可见有蓝绿色点状、线状、颗粒状或网状结构，故名网织红细胞。色点状、线状、颗粒状或网状结构，故名网织红细胞。 实验四福医大白细胞计数网织红细胞计数血沉二二、网织红细胞计数网织红细胞计数 2.2.操作步骤（玻片法）操作步骤（玻片法）（1）加染液：于载玻片的中央滴加煌焦油蓝乙醇溶液，自）加染液：于载玻片的中央滴加煌焦油蓝乙醇溶液，自 然干燥后备用。然干燥后备用。（2）加血液：取血）加血液：取血1滴，滴在染料上，用推片角轻轻将血滴，滴在染料上，用推片角轻轻将血 滴与染料混匀，然后用另一载玻片垂直盖在此玻片上滴与染料混匀，然后用另一载玻片垂直盖在此玻片上 （尽量不留气泡），室温下静置（尽量不留气泡），室温下静置1520min。（3）制备涂片。）制备涂片。（4）油镜下计数）油镜下计数1000个红细胞中的网织红细胞数（一般个红细胞中的网织红细胞数（一般 连续计数连续计数3个视野即可）。个视野即可）。实验四福医大白细胞计数网织红细胞计数血沉（5 5）也可用米勒氏窥盘（）也可用米勒氏窥盘（Miller oculordisc）置入接目镜内）置入接目镜内 进行计数（如下图）。进行计数（如下图）。 具体方法是以窥盘的具体方法是以窥盘的A A区计数红细胞，区计数红细胞，B B区计数网织区计数网织 红细胞，由于红细胞，由于B B区的面积为区的面积为A A区的区的9 9倍，故计算如下：倍，故计算如下： 网织红细胞（网织红细胞（% %）=B=B区网织红细胞数区网织红细胞数/ A/ A区红细胞数区红细胞数 9 100% 9 100%实验四福医大白细胞计数网织红细胞计数血沉实验四福医大白细胞计数网织红细胞计数血沉二二、网织红细胞计数网织红细胞计数 3.计算计算 网织红细胞分数数网织红细胞分数数=计数的网织红细胞数计数的网织红细胞数/1000 网织红细胞绝对数网织红细胞绝对数=红细胞数红细胞数/L网织红细胞分数数网织红细胞分数数 4.参考值参考值 正常成人：正常成人： 0.5%1.5% 新生儿：新生儿： 2%6% 成人网织红细胞绝对值：成人网织红细胞绝对值： （2484）109/L实验四福医大白细胞计数网织红细胞计数血沉5.注意事项注意事项（1）只有活体染色后才能看到网织红细胞，故必须将新鲜）只有活体染色后才能看到网织红细胞，故必须将新鲜 血滴与染液相混合，染液与血液之比一般约为血滴与染液相混合，染液与血液之比一般约为1：1， 但若贫血严重也可按但若贫血严重也可按1：2关系处理。注意混匀，否则关系处理。注意混匀，否则 有时凝固。有时凝固。（2）染色时间不得短于）染色时间不得短于10min，否则可能着色不佳。计数，否则可能着色不佳。计数 前注意多部位观察，可与涂片的体尾交界处选染色前注意多部位观察，可与涂片的体尾交界处选染色 好，红细胞分布既不分散又不重叠的区域进行计数。好，红细胞分布既不分散又不重叠的区域进行计数。 经此种染色后红细胞呈清晰的蓝绿色，凡胞质中含有经此种染色后红细胞呈清晰的蓝绿色，凡胞质中含有 蓝绿色点状、短线状结构者为网织红细胞。蓝绿色点状、短线状结构者为网织红细胞。二、网织红细胞计数二、网织红细胞计数实验四福医大白细胞计数网织红细胞计数血沉网织红细胞网织红细胞实验四福医大白细胞计数网织红细胞计数血沉（3）计数时需注意与异物或假象相区别。如有异物残渣，计数时需注意与异物或假象相区别。如有异物残渣， 多呈黑色，转动微螺旋时可见其折光性。接目镜中粉尖多呈黑色，转动微螺旋时可见其折光性。接目镜中粉尖 重叠于红细胞上所致的假象，则随接目镜转动而移位。重叠于红细胞上所致的假象，则随接目镜转动而移位。 勿将皱缩红细胞较深染的皱缩点勿认为网织结构，皱缩勿将皱缩红细胞较深染的皱缩点勿认为网织结构，皱缩 红细胞其边缘处均匀的锯齿状可供作鉴别。红细胞其边缘处均匀的锯齿状可供作鉴别。（4）染色后的涂片应尽快观察计数，否则其网织结构可因染色后的涂片应尽快观察计数，否则其网织结构可因 久置而溶解消失（尤其在夏天湿度大的季节）。久置而溶解消失（尤其在夏天湿度大的季节）。 实验四福医大白细胞计数网织红细胞计数血沉 6.方法学评价方法学评价 玻片法取血量少，且易于使混合血液中的水分蒸发，造玻片法取血量少，且易于使混合血液中的水分蒸发，造 成染色结果偏低，但携带方便，适宜床边采血检查。成染色结果偏低，但携带方便，适宜床边采血检查。二二、网织红细胞计数网织红细胞计数实验四福医大白细胞计数网织红细胞计数血沉二二、网织红细胞计数网织红细胞计数7.质量控制质量控制1.1.显微镜法显微镜法 网织红细胞目视计数误差较大，影响因素主要有：网织红细胞目视计数误差较大，影响因素主要有：操作人员对网织红细胞认识不同；血涂片质量好坏，操作人员对网织红细胞认识不同；血涂片质量好坏，计数红细胞数量的多少和计数方法等。计数红细胞数量的多少和计数方法等。实验四福医大白细胞计数网织红细胞计数血沉2.仪器法仪器法 虽可计数红细胞虽可计数红细胞10 00050 000个，但受到个，但受到H-J小体、小体、有核红细胞、巨血小板等影响，可出现假阳性。有核红细胞、巨血小板等影响，可出现假阳性。实验四福医大白细胞计数网织红细胞计数血沉三三、血沉测定（示教）（临检指导、血沉测定（示教）（临检指导P29）1原理原理( (魏氏法魏氏法) ) 将一定量的抗凝全血灌注于特制的血沉管中，垂直立将一定量的抗凝全血灌注于特制的血沉管中，垂直立 于血沉架上于血沉架上1h后读取红细胞下沉后所暴露出的血浆段高后读取红细胞下沉后所暴露出的血浆段高 度度（mm/h）。）。实验四福医大白细胞计数网织红细胞计数血沉三三、血沉测定血沉测定2方法方法 （1 1）取静脉血）取静脉血1.6ml，加入含，加入含109mmol/L枸橼酸钠枸橼酸钠0.4ml 的抗凝管中混匀。的抗凝管中混匀。（2 2）吸血入血沉管中至刻度）吸血入血沉管中至刻度“0”处，将血沉管直立于血处，将血沉管直立于血 沉架上。沉架上。1h后观察结果。后观察结果。 实验四福医大白细胞计数网织红细胞计数血沉三、血沉测定三、血沉测定3.参考值参考值 50岁：男性岁：男性015mm/h 女性女性020mm/h实验四福医大白细胞计数网织红细胞计数血沉4注意事项注意事项（1）枸橼酸钠抗凝剂与血液比例为）枸橼酸钠抗凝剂与血液比例为1：4，并充分混匀。，并充分混匀。（2）最适温度为）最适温度为18-250C，并于采血后，并于采血后2h内完成。内完成。（3）温度高或低会影响血沉，需根据温度校正图校正。）温度高或低会影响血沉，需根据温度校正图校正。 （见（见P32图图2-11）（4）血沉管内径要标准，放置要垂直、不得倾斜。）血沉管内径要标准，放置要垂直、不得倾斜。三三、血沉测定血沉测定实验四福医大白细胞计数网织红细胞计数血沉实验四福医大白细胞计数网织红细胞计数血沉