Red/ETRed/ET同源重组技术同源重组技术20152015年年3 3月月2525日日 内内 容容一、一、 什么是什么是Red/ET同源重组同源重组二、二、 技术的特点技术的特点三、三、 作用机制作用机制四、四、 功能元件功能元件五、操作流程及关键因素五、操作流程及关键因素六、在基因工程中的主要应用六、在基因工程中的主要应用七、七、 新技术的发展新技术的发展八、在其他细菌中的应用八、在其他细菌中的应用 遗遗 传传 重重 组组基因组的可变性和稳定性之间必须维持一个恰到好处的平衡，这样才能使生物体得以生存并能世代相传，繁衍不息。染色体的遗传差异主要由两种 机制产生，一种是突变，一种是遗传重组。 重组可分为四类（重组可分为四类（DNA序列、蛋白质因子）序列、蛋白质因子） 狭义遗传重组：涉及到狭义遗传重组：涉及到DNA分子内断裂分子内断裂-复合的基因交流复合的基因交流 遗传重组与重组遗传重组与重组DNA技术技术 异常异常广义遗传重组：任何造成基因型变化的基因交流过程广义遗传重组：任何造成基因型变化的基因交流过程一、一、 什么是什么是Red/ET同源重组同源重组1. 1. 概念概念 Red/ET Red/ET重组是新近出现的一种利用来自重组是新近出现的一种利用来自E. coliE. coli中中 噬菌体噬菌体的重组酶的重组酶RedRed/Red/Red 或者是来自或者是来自 Rac Rac 噬菌体噬菌体的重组酶的重组酶RecE/RecT RecE/RecT 进行基因同源进行基因同源重组的重组的DNADNA工程技术。工程技术。2. 2. 原理原理 首先重组酶沿53方向方向消化双链DNA，露出粘性末端（15-50bp15-50bp）。随后重组酶介导单链退火修复单链退火修复（single- strand annealingsingle- strand annealing），即载体和），即载体和插入片段的黏性末端（插入片段的黏性末端（15-50bp15-50bp） 互补形成稳定的带缺刻的环状重组质粒，互补形成稳定的带缺刻的环状重组质粒，转化大肠杆菌后能自动被修复为闭合的环状质粒转化大肠杆菌后能自动被修复为闭合的环状质粒3. 3. 特点：特点： RedRed同源重组技术具有同源重组技术具有同源序列短同源序列短(15(1550bp)50bp)、重组效率高重组效率高、操、操作作简单简单、快速快速的特点。的特点。4. 4. 应用应用 这种技术可在这种技术可在DNADNA靶标分子的任意位点进行靶标分子的任意位点进行基因敲除基因敲除、敲入敲入、点突点突变变等操作等操作, ,无需使用限制性内切酶和连接酶。此外无需使用限制性内切酶和连接酶。此外, ,这种新型重组技术可这种新型重组技术可直接将直接将目的基因克隆到载体上目的基因克隆到载体上, ,目的基因既可来源于细菌人工染色体也目的基因既可来源于细菌人工染色体也可是基因组可是基因组DNADNA。RedRed同源重组技术使难度较大的基因工程实验顺利进行同源重组技术使难度较大的基因工程实验顺利进行, ,大大推动功能基因组研究的发展。大大推动功能基因组研究的发展。g b al phageETRac phageu Rac recE/recT 操操纵纵子子 = red 操操纵纵子子, 操操纵纵子子中中的的重重组组酶酶（Red/Red 或者或者RecE/RecT）协同配合完成重组作用；）协同配合完成重组作用； u recE = red ：53 dsDNA核酸外切酶；核酸外切酶； u recT = red ：ssDNA结合和退火蛋白；结合和退火蛋白； u red： 防止防止 E. coli中的核酸酶中的核酸酶 RecBCD对外源线性对外源线性DNA片片段的消化。段的消化。噬菌体的pL操纵子示意图 Reda a(RecE)Red同源重组原理示意图Single-strand annealingStrand invasion35Digestion Binding35Redb b(RecT)Repair/ReplicationSelectionRecE/RecT和Red/Red两重组系统的差异 u “线状线状DNA线状线状DNA”重组，选用重组，选用RecE/RecT重组酶系统；重组酶系统；u “线状线状DNA环状环状DNA”重组，选用重组，选用Red/Red重组酶系统；重组酶系统；u 根据需要选择含不同抗生素抗性基因（根据需要选择含不同抗生素抗性基因（Ampr、Hygr、Tetr）和不同）和不同的诱导型启动子（的诱导型启动子（pBAD、pTet）的重组酶系统表达质粒。）的重组酶系统表达质粒。 质粒: l pSC101-BAD-gbaA(amp)l pSC101-BAD-gbaA(tet)l pSC101-BAD-gbaA(hyg)l pSC101-Tet-gbaA(tet)l pSC101-BAD-ETgA(tet)l pSC101-Tet-ETgA (amp)RecE/RecT和Red/Red两重组系统对不同类型底物重组效率的差异 RedRed同源重组技术相关文献同源重组技术相关文献Nature Genetics (1998)Nature Biotechnology (2000)1. 不依赖RecA蛋白，在重组酶系统（Red/Red或RecE/RecT）的相互配合下，含短同源臂（1550bp）的供体DNA分子能直接重组到受体DNA分子上，实现替换、插入、删除、突变等；2. 不受靶标DNA分子大小的限制；3. 不受内切酶切位点的限制；4. 精确性：不依赖RecA蛋白，减少了引入非预期的突变、 缺失、替换等的几率； 5. 简便快捷：省去了中间质粒的构建，减少实验步骤、缩短实验周期。二、二、Red/ET同源重组技术的特点同源重组技术的特点三、三、 Red/ET重组的作用机制重组的作用机制Red/ET重组链入侵模型1.链入侵模式Red/ET同源重组链退火模型同源重组链退火模型2.链退火模型四、四、 Red/ET重组中的功能元件重组中的功能元件1. Red、Red和RedRed：以三聚体的形式形成“漏斗型”活性的蛋白， 5-3外切酶活性。Red结构（A）和与DNA相互作用的模式（B）（图片来自Subramanian et al. 2003） Red：与ssDNA结合形成丝状体，催化与互补ssDNA之间的退火。 Red：抑制RecBCD外切酶和SbcCD外切酶对外源DNA的降解。 2. RecE和RecTRecE：C端39kDa的部分才是5-3外切酶活性必需，对5端为羟基的底物也有活性。 RecT：与ssDNA结合形成丝状体，催化与互补ssDNA之间的退火。3. RecA 个亚基形成有活性的RecA蛋白，细菌中广泛存在且高度保守，有同源重组酶、DNA损伤修复、DNA依赖ATPase活性等功能。 可诱导SOS反应、挽救DNA复制叉等，提高电击后细胞的活力，增加电转化效率。五、五、 Red/ET重组操作流程重组操作流程引物设引物设计合成计合成线性供体线性供体dsDNA底物的制备底物的制备线性载体的线性载体的制备制备重组反应重组反应重组产物转化重组产物转化至感受态细胞至感受态细胞重组子重组子筛选筛选重组子检测重组子检测1. 设计合成引物设计合成引物 设计引物时要遵循一般引物设计的基本原则，但是上下游引物要加上15-20bp的载体同源序列。载体同源序列如何添加主要分以下两种情况：（1）载体酶切后是5端突出或平末端，则引物上的同源序列包括5端突出序列的同源序列。（2）载体酶切后是3端突出，则引物上的同源序列不包括3端突出序列的同源序列。引物设计方法引物设计方法同源臂长度对Red/ET重组效率的影响（数据来自Zhang et al. 1998） 同源臂的长度在1550bp时，重组效率就能满足实验要求，重组效率随着同源臂长度的增加而增加。2. 线性供体线性供体dsDNA底物的制备底物的制备u 选用保真度高的选用保真度高的DNA聚合酶聚合酶（如（如Phusion、Pyrobest等，减少等，减少PCR反应中的突变；扩增反应中的突变；扩增GC含量较高的含量较高的DNA片段时，选用片段时，选用Triplemaster、HotStarTaq 等），等），用合成的引物用合成的引物PCR扩增获得扩增获得dsDNA底物；底物；u 纯化纯化PCR产物：产物： （1）减少模板背景对筛选工作带来的难度；）减少模板背景对筛选工作带来的难度； （2）降低其剩余引物与靶标）降低其剩余引物与靶标DNA片段的结合，提高重组效率；片段的结合，提高重组效率； （3）去处）去处PCR产物中的盐离子，提高转化效率。产物中的盐离子，提高转化效率。u 降低模板对筛选工作带来的难度；降低模板对筛选工作带来的难度； （1）纯化回收）纯化回收PCR产物；产物； （2）内切酶消化处理模板；）内切酶消化处理模板； （3）使用）使用R6K复制子。复制子。 线性化载体可以通过线性化载体可以通过酶切酶切或或PCR扩增扩增两种方法获得。两种方法获得。1）酶切）酶切 选取合适的位点，单酶切或双酶切皆可选取合适的位点，单酶切或双酶切皆可, ,质粒的线性化不彻底，将导致阴性质粒的线性化不彻底，将导致阴性克隆的产生，为了提高阳性率，建议通过双酶切进行质粒线性化。克隆的产生，为了提高阳性率，建议通过双酶切进行质粒线性化。2）PCR扩增扩增 选取合适的位点，设计正向和反向引物，引物长度一般在选取合适的位点，设计正向和反向引物，引物长度一般在18-20bp左右，建左右，建议用高保真的聚合酶扩增。为了避免模板质粒议用高保真的聚合酶扩增。为了避免模板质粒DNA对后续试验的影响，建议对后续试验的影响，建议用用Dpn I内切酶消化内切酶消化PCR产物，降低背景，提高阳性率。产物，降低背景，提高阳性率。 不管采取哪种方法，最终线性化载体的浓度需不管采取哪种方法，最终线性化载体的浓度需50ng/ul，高浓度的载体有，高浓度的载体有利于提高效率。利于提高效率。 3. 线性载体的制备线性载体的制备4. 同源重组反应同源重组反应试剂试剂加量加量10x Buffer1ulRecombination Enzyme1ul线性化载体（线性化载体（50ng/ul） 50-100ng插入片段（插入片段（50ng/ul）150-200ngdd H2O补足至补足至10ul（1）配置反应体系）配置反应体系 将目的将目的DNA片段和线性化载体以一定的摩尔比加到管子中进行重组反片段和线性化载体以一定的摩尔比加到管子中进行重组反应（摩尔比可计算方法见附录），应（摩尔比可计算方法见附录），10 ul体系体系(见下表见下表) 注意：注意：1.目的片段与载体的摩尔比在目的片段与载体的摩尔比在2: :1-5: :1之间，摩尔比低于之间，摩尔比低于2:1效率效率会降低；会降低；2.反应时间在反应时间在15-30分钟，时间太短不利于重组反应分钟，时间太短不利于重组反应（2）短暂离心混匀，）短暂离心混匀，37孵育孵育15分钟。分钟。（3）反应结束后，取）反应结束后，取5-10ul反应液立即进行转化，剩余反应液可在反应液立即进行转化，剩余反应液可在4或或-20保存待用。保存待用。 5.重组产物转化至感受态细胞重组产物转化至感受态细胞冰上融化一管100 l的DH5感受态细胞。加入5-10l反应液到感受态细胞中，轻轻混匀，冰上孵育30分钟。42水浴中热激45-90秒后，冰浴3分钟。注意：所使用的感受态细胞效率1108cfu/g.加入890l SOC液体培养基，37复苏45-60分钟。6. 重组子筛选重组子筛选u 复苏培养物8000rpm离心1分钟收集菌体，根据需要将一定量的菌体均匀的涂布在含抗生素平板上,37倒置培养12-16h后观察菌落生长情况。u 使用抗生素的最低抑菌浓度，有利于获得更多的重组子：在10g/mL的卡那霉素平板上重组子的数目是60g/mL的卡那霉素平板上重组子的数目的6倍。 抗生素使用浓度与Red/ET重组效率的关系 常用抗生素的工作浓度常用抗生素的工作浓度7. 重组子的检测重组子的检测u 检测方法：酶切分析、检测方法：酶切分析、PCR检测、平板双划线、测序等；检测、平板双划线、测序等； 一般采用菌落PCR进行阳性克隆鉴定。为避免假阳性结果，鉴定引物选择一条为载体特异性引物，另一条引物为目的片段特异性引物。u 高拷贝质粒修饰存在高拷贝质粒修饰存在“质粒多聚体质粒多聚体” 现象；现象；u “质粒多聚体质粒多聚体”问题解决办法：问题解决办法： 采用采用“线性线性DNA+线性线性DNA”重组方式；重组方式； 利用利用RecE/RecT重组酶系统；重组酶系统； 减低质粒拷贝数减低质粒拷贝数。卡那霉素抗性基因（卡那霉素抗性基因（Kan）替换）替换pUC19中的氨苄抗性基因中的氨苄抗性基因（Amp）“质粒多聚体质粒多聚体” 现象现象解决办法：解决办法：u 采用采用“线性线性DNA+线性线性DNA”重组方式；重组方式；u 利用利用RecE/RecT重组酶系统；重组酶系统；u 减低质粒拷贝数。减低质粒拷贝数。六、六、 Red/ET重组技术的主要应用重组技术的主要应用1. 重组质粒的构建 2. 染色体的修饰 3. 亚克隆（Subcloning） 4. 直接克隆（Direct cloning）1. 重组质粒的构建 (1) 传统基因克隆技术的缺点传统基因克隆技术的缺点 传统克隆技术依赖限制性酶切位点和内切 酶的消化，当缺少合适的酶切位点或者某个酶切位点在目的片段中大量存在时，利用内切酶消化难以得到相应的产物。 方法看似简单，但实验周期长。 大片段难以与载体正确连接。 无法同时连接多个（2个以上）的DNA片段。限制性内切酶限制性内切酶连接酶连接酶步骤步骤1 1：酶切目的片段酶切目的片段步骤步骤2 2：酶切载体：酶切载体步骤步骤3:3:目的片段与载体连接目的片段与载体连接同源重组克隆步骤同源重组克隆步骤传统克隆步骤传统克隆步骤步骤步骤4:4:重组子转化到感重组子转化到感受态细胞受态细胞同源重组克隆同源重组克隆传统克隆传统克隆克隆片段长度50bp-10kb50bp-2kb一次克隆片段数1-5个1个感受态效率要求1108cfu/ug以上1107cfu/ug以上所用的酶重组酶T4连接酶片段的插入位点任何位点特定位点片段酶切不需要需要载体线性化方法酶切或PCR酶切同源重组克隆与传统克隆比较插入选择标记插入选择标记插入无选择标记的插入无选择标记的DNA片段片段2. 染色体的修饰 E. coli染色体上插入抗性基因 传统基因工程技术（A）和Red/ET重组技术（B）修饰E.coli染色体实验步骤比较（B） 不同复制子能承载外源 DNA片段的大小3. 亚克隆（Subcloning） 4. 直接克隆（Direct cloning）（A）亚克隆和直接克隆示意图Red/ET subcloning亚克隆 pGB-15A载体抗性基因簇直接克隆直接克隆 Myxococcus xanthus中的沉默基因簇中的沉默基因簇3 m mg基因组基因组DNA用用EcoR V消化消化Mx unknown PKS gene cluster (36kb)p15A oriCmPKS from other bacteria：Photorhabdus lumineciensPsedumonas flurescencse异源表达异源表达七、七、 Red/ET重组新技术的发展重组新技术的发展1. 三重同源重组（三重同源重组（Triple recombineering） 三重同源重组示意图cry1Ac的启动子片段和终止子片段“一步”重组入pHT315质粒上 2. 四重同源重组（四重同源重组（Quadruple recombineering） 四重同源重组示意图 质粒pR6K-GT1-cotc-lacZneo上目的片段（6123bp）插入人类scn10a基因BAC的第一个内含子中 3. “双同源臂双同源臂”策略策略(Double homology arms strategy)“双同源臂”策略示意图